一種生產(chǎn)輔酶q10工程菌的構(gòu)建方法、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種生產(chǎn)輔酶Q10工程菌的構(gòu)建方法、工程菌及其應(yīng)用，該菌為類球紅細(xì)菌，拉丁文學(xué)名為Rhodobacter?sphaeroides；命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時(shí)間：2012年4月13日；保藏編號：CGMCC?No.5998。本發(fā)明提供一種通過對EMP途徑相關(guān)代謝途徑的改造，提高輔酶Q10產(chǎn)量的方法，能將輔酶Q10的合成能力提高約30%，適合輔酶Q10的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種生產(chǎn)輔酶Q10工程菌的構(gòu)建方法、工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種生產(chǎn)輔酶QlO工程菌的構(gòu)建方法、工程菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]輔酶Q是生物體內(nèi)廣泛存在的脂溶性醌類化合物，不同來源的輔酶Q其側(cè)鏈異戊烯單位的數(shù)目不同，人類和哺乳動物是10個異戊烯單位，故稱輔酶Q10。
[0003]輔酶QlO是生物細(xì)胞呼吸鏈中的重要遞氫體，是一種良好的生化藥物，近年來已廣泛應(yīng)用于各類心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。此外，在治療壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性牙周炎以及促進(jìn)胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果。最近，研究者發(fā)現(xiàn)CoQlO具有抗衰老作用，從而將其應(yīng)用擴(kuò)展到化妝品和保健品領(lǐng)域，使其在國內(nèi)外的需求進(jìn)一步擴(kuò)大。
[0004]輔酶QlO的制備方法主要有三種，即動植物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。動植物組織提取法中動植物輔酶QlO含量低，而且各種化學(xué)成份復(fù)雜，并受原料和來源限制，因此產(chǎn)品成本高，價(jià)格昂貴，規(guī)?；a(chǎn)受到了一定限制?；瘜W(xué)合成法技術(shù)上比較成熟，主要是以來源較豐富的茄尼醇為原料合成的，但其產(chǎn)物為順反異構(gòu)體的混合物，生物活性低，合成生物活性高的CoQlO尚未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的程度。微生物發(fā)酵法合成的輔酶QlO成本低、無光學(xué)異構(gòu)體，生物學(xué)活性高，大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用效果好。
[0005]常用的微生物包括紅螺菌，土壤桿菌，類球紅細(xì)菌，根瘤菌等。其中類球紅細(xì)菌培養(yǎng)簡單，是輔酶QlO高效的生產(chǎn)菌之一。輔酶QlO分子結(jié)構(gòu)由兩部分組成:醌環(huán)部分和異戊二烯側(cè)鏈部分。醌環(huán)骨架由分支酸途徑合成，前體是對羥基苯甲酸。側(cè)鏈由異戊二烯途徑合成，側(cè)鏈的長短決定了輔酶Q的種類的不同。在類球紅細(xì)菌中，異戊二烯焦磷酸異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)與9分子異戊二烯焦磷酸(IPP)依次在櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶及聚十異戊二烯焦磷酸合酶的催化下生成聚十異戊二烯焦磷酸。十異戊二烯焦磷酸和對羥基苯甲酸縮合形成輔酶QlO的前體物，該前體物苯環(huán)經(jīng)修飾之后形成目標(biāo)產(chǎn)物輔酶Q10。在微生物中，合成IPP主要有兩條途徑，分別是真核生物的甲羥戊酸途徑(MVP)和原核生物中的非甲羥戊酸途徑(MEP)。在類球紅細(xì)菌中，IPP由MEP途徑合成。
[0006]目前國內(nèi)相關(guān)研究主要集中在多基因表達(dá)強(qiáng)化大腸桿菌上。尚無專利有關(guān)于通過基因過表達(dá)強(qiáng)化類球紅細(xì)菌輔酶QlO的合成能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶QlO產(chǎn)量較低且生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)，提供了一種能顯著提高輔酶QlO產(chǎn)量的生產(chǎn)輔酶QlO工程菌及其構(gòu)建與應(yīng)用方法。通過引用該方法，可以極大提高應(yīng)用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶QlO的產(chǎn)量，降低了輔酶QlO的生產(chǎn)成本。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:
[0009]一種生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下:[0010]a.從類球紅細(xì)菌中提取基因組DNA ;
[0011]b.用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出DXS和DDS的同源基因；
[0012]c.用擴(kuò)增出的同源基因與廣宿主質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組載體；
[0013]d.重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1中；
[0014]e.將S17-1與所述類球紅細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移，即得敲除了基因DXS和DDS的工程菌。
[0015]作為優(yōu)選，所述的DXS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，所述的DDS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0016]作為優(yōu)選，所述廣宿主質(zhì)粒為克隆載體pBBRlMCS-2，所述質(zhì)粒的啟動子為tac啟動子。
[0017]一株利用上述構(gòu)建方法得到的用于生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌，該菌為類球紅細(xì)菌，拉丁文學(xué)名為Rhodobacter sphaeroides ;命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時(shí)間:2012年4月13日；保藏編號=CGMCCN0.5998。
[0018]應(yīng)用上述工程菌生產(chǎn)輔酶QlO的方法，具體步驟如下:
[0019]f.挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含IOmL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200rpm，在26-34°C培養(yǎng)23h，獲得一級種子；
[0020]g.將一級種子按1%的比例轉(zhuǎn)接至含20mL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，在26_34°C，200rpm的條件下培養(yǎng)23h，獲得二級種子；
[0021]h.將二級種子以1%的比例接種至含IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL中，在26_34°C，200rpm的條件下培養(yǎng)72h后，添加異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)表達(dá)48h ；收集菌液；可通過常規(guī)方法提取輔酶Q10。
[0022]作為優(yōu)選，所述的種子培養(yǎng)基每IOOmL中含有:(NH4)2SO40.25g，玉米漿0.05g，酵母提取物 0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g，K2HPO40.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO40.01gjCoCl2 0.003g，MnSO40.0OOlg，CaCO30.8g，維生素 ΒΙΟ.1 μ g，維生素 K 0.1 μ g，維生素A0.15 μ g ;ρΗ 調(diào)節(jié)為 7.2。
[0023]作為優(yōu)選，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基每IOOmL種含有:(NH4)2SO40.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO4 0.15g，味精 0.3g，MgSO4 0.63g，玉米漿 0.4g，F(xiàn)eSO4 0.12g，CoCl2 0.005g，CaCO3 0.6g，維生素 B10.1 μ g,維生素 K 0.1 μ g,維生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 調(diào)節(jié)為 7.2。
[0024]作為優(yōu)選，所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的濃度為0.0Ol-lOmM。
[0025]所述類球紅細(xì)菌從河邊污泥中分離得到；大腸桿菌S17-1購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號ATCC47055。
[0026]本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有以下顯著的技術(shù)效果:
[0027]本發(fā)明通過選擇MEP途徑中的關(guān)鍵酶DXS、DDS的過表達(dá)，完成對EMP途徑相關(guān)代謝途徑的改造。經(jīng)過上述改造生產(chǎn)的工程菌，具有較高的輔酶QlO合成能力，相比現(xiàn)有用于生產(chǎn)輔酶QlO的類球紅細(xì)菌或類似菌種，該工程菌具有更高的輔酶QlO生產(chǎn)能力。將該工程菌應(yīng)用于輔酶QlO的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，能夠在不改變原有的生產(chǎn)過程，工藝步驟，培養(yǎng)條件的情況下，使微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶QlO的生產(chǎn)能力在原有基礎(chǔ)上提高達(dá)30%，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和工業(yè)實(shí)用性。
[0028]保藏信息[0029]保藏名稱:類球紅細(xì)菌，拉丁文學(xué)名為Rhodobacter sphaeroides ;命名為NHU-ZDD菌株；
[0030]保藏時(shí)間:2012年4月13日；
[0031]保藏編號:CGMCCN0.5998 ；
[0032]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
[0034]實(shí)施例1生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法
[0035]一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0036]1.設(shè)計(jì)引物。用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物序列。
[0037]克隆基因DXS，其中，
[0038]上游引物DXSF:
[0039]CATGCCATGGGCATGACCGACAGACCCTGCAC ；
[0040]下游引物DXSR: CGGGATCCCTCCTCCGGATCAGGCGCG ；
[0041]上游引物添加酶切位點(diǎn)Ncol，下游引物添加酶切位點(diǎn)BamHI。
[0042]克隆基因DDSF:
[0043]上游引物DDSF:
[0044]GAAGATCTGAGGAGACGGGATGGGATTGGACGAGGTT ；
[0045]下游引物DDSR:
[0046]CCCAAGCTTGAAAGGGATCAGGCGATGCG ；
[0047]在上游引物中包含酶切位點(diǎn)BglII和SD序列GAGGAGA，下游引物包含酶切位點(diǎn)
HindIII1
[0048]2.提取類球紅細(xì)菌基因組DNA (所用試劑均來自Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒)
[0049]I)吸取0.5_4mL類球紅細(xì)菌(最多5父109個細(xì)菌)，13500印111離心I分鐘，盡可能
吸凈上清。
[0050]2)加入100 μ LEL Buffer,使用tip頭吹打均勻。
[0051]3) 37 °C溫育 40 分鐘。
[0052]4)加入 100 μ LRS Buffer,隨后加入 10 μ LPK Solution,充分混勻。
[0053]5)于56°C環(huán)境中溫浴15分鐘，然后移出。
[0054]6 )加 200 μ L GABuffer 并混合均勻。
[0055]7)于12000rpm離心I分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5mL離心管。
[0056]8)加 400 μ L 的 BA Buffer,并混合均勻。
[0057]9)將混合液體轉(zhuǎn)移至Spin column。于1000Orpm離心I分鐘,并棄去接液管中液體。
[0058]10)向 Spin column 中加入 500 μ L 的 G Binding Buffer。于 1000Orpm 離心 30
秒，并棄去接液管中液體。
[0059]11)向 Spin column 中加入 500 μ L 的 Wash Buffer。于 1000Orpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。
[0060]12)再向 Spin column 中加入 500 μ L 的 Wash Buffer。于 1000Orpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。
[0061]13)再次將Spin column于1000Orpm離心I分鐘，并將Spin column轉(zhuǎn)移至一個新的1.5mL離心管。
[0062]14)向 Spin column 中加入 100 μ L Elution Buffer,并于室溫溫育 1 分鐘。
[0063]15)于12000rpm離心I分鐘,并棄去Spin column。1.5mL離心管中剩余液體即含
有基因組DNA。
[0064]3.進(jìn)行PCR擴(kuò)增DXS基因
[0065]用高保真酶PrimeSTAR(購自大連寶生物公司)擴(kuò)增,采用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系:GC緩沖液25μL，水16μL，(dNTP混合液4 μL，上游引物DXSF 1.5μ L (10uM)，下游引物DXSR 1.5μ L(10uM)，所提取的基因組 DNA 1.5 μ L，PrimeSTAR 酶 0.5 μ L。
[0066]擴(kuò)增程序?yàn)?30個循環(huán)，每個循環(huán)包含98 V變性10秒，60 V退火5秒，72 °C延伸2分鐘。
[0067]4.PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行酶切(所用試劑來自AxyPrep PCR清潔試劑盒)
[0068]將PCR產(chǎn)物取出，各加入150 μ L PCRA，然后均加入離心柱中，取一支空白離心柱加入 400 μ L 水，一起 13500rpm 離心1 分鐘，加入 BUFFER W2 700 μ L, 13500rpm 離心 I 分鐘，棄清液，再加入BUFFERW2 700 μ L，再13500rpm離心I分鐘。棄清液，再空離I分鐘，徹底甩干離心柱。加入34 μ L Eluent，然后取2支離心管。一支加入DXS34 μ L，另一只加入pBBRlMCS-234 μ LjNcoI 和 BamHI 各加入 1 μ L，加入 4μ L BUFFER。放入 37°C 水浴酶切 1.5小時(shí)。
[0069]5.電泳
[0070]1)制備1%瓊脂糖凝膠:稱取0.2g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20mL 1 X TAE,瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。冷卻到65°C左右加入GelGreen染色劑3 μ L。
[0071]2)膠板制備:取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加IXTAE電泳緩沖液至沒過膠板l_2mm為止。
[0072]3)加樣:在點(diǎn)樣板上將第4步中酶切的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pBBRlMCS-2與上樣緩沖液混合，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于IX。用10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。并加入10 μ L DNAmarker-D作為對照。
[0073]4)電泳:加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓100V，樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動，電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm處時(shí)，停止電泳。
[0074]5)電泳完畢后，取出凝膠，在紫外燈下觀察，顯示2kb處有明顯條帶。證實(shí)DXS的PCR擴(kuò)增成功。[0075]6.割膠回收(所用試劑來自AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒)
[0076]I)割下對應(yīng)條帶的膠。
[0077]2)將膠放入1.5mL離心管中，計(jì)算凝膠重量。(需提前記錄離心管重量)該重量作為一個凝膠體積(IOOmg=IOO μ L)。再加入3個凝膠體積的BUFF DE-A，混合后75°C加熱融化，約6-8分鐘，期間間斷混合。再加入0.5個BUFFER DE-A體積的BUFFER DE-B,混合均勻。
[0078]3)將混合液轉(zhuǎn)入DNA制備管。13500rpm離心I分鐘，棄濾液。加入500 μ L BUFFERffl, 13500rpm離心30秒，棄濾液。加700 μ LBUFFER W2, 13500rpm離心30秒，棄濾液。再加700 μ L BUFFER W2, 13500rpm離心I分鐘，棄濾液。然后再13500rpm離心I分鐘。將制備管置于潔凈的1.51^離心管中，在制備膜中央加入25 4 1^11^社，室溫靜置1分鐘，13500rpm離心I分鐘洗脫DNA。
[0079]7.T4連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒
[0080]取割膠回收得到的DXS基因5.5 μ L，pBBRlMCS-2質(zhì)粒3 μ L，T4連接酶(λ 5 μ L，T4連接酶BUFFER I μ L混合，22 °C水浴連接30分鐘。
[0081]8.PCR 擴(kuò)增 DDS 基因
[0082]用高保真酶PrimeSTAR(購自大連寶生物公司)擴(kuò)增,采用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系:GC緩沖液25 4 1^，水16 4 1^，(1見13混合液4 4 1^，上游引物005卩 1.5μ L (10uM)，下游引物 DDSR 1.5μ L(10uM)，所得基因組 DNA 1.5 μ L，PrimeSTAR 酶 0.5 μ L。
[0083]擴(kuò)增程序?yàn)?30個循環(huán)，每個循環(huán)包含98°C變性10s，60 °C退火5s，72 °C延伸2min。
[0084]9.PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行酶切(所用試劑來自AxyPrep PCR清潔試劑盒)
[0085]將PCR產(chǎn)物取出，加入150 μ LPCRA，然后均加入離心柱中，取一支空白離心柱加入400 μ L水，一起13500rpm離心I分鐘，加入BUFFER W2700 μ L, 13500rpm離心I分鐘，棄清液，再加入Ι27(Κ)μ?，再13500rpm離心I分鐘。棄清液，再空離I分鐘，徹底甩干離心柱。加入34 μ L Eluent，然后取2支離心管。一支加入DDS 34 μ L，另一只加入已重組有DXS基因的口88町]\?^-234 4 1^重組載體，88111和出11(11111各加入BUFFER。放入37°C水浴酶切1.5小時(shí)。
[0086]10.電泳
[0087]I)制備1%瓊脂糖凝膠:稱取0.2g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20mL I X TAE,瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。冷卻到65°C左右加入GelGreen染色劑3 μ L。
[0088]2)膠板制備:取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加IXTAE電泳緩沖液至沒過膠板l_2mm為止。
[0089]3)加樣:在點(diǎn)樣板上將第9步中酶切的PCR產(chǎn)物和pBBRlMCS-2質(zhì)粒與上樣緩沖液混合，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于IX。用10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。并加入10 μ L DNA marker-D作為對照。
[0090]4)電泳:加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓100V，樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動，電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm處時(shí)，停止電泳。
[0091]5)電泳完畢后，取出凝膠，在紫外燈下觀察，對比mark顯示Ikb處有明顯條帶。證實(shí)DDS的PCR擴(kuò)增成功。
[0092]11.割膠回收(所用試劑來自AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒)
[0093]I)割下對應(yīng)條帶的膠。
[0094]2)將膠放入1.5mL離心管中，計(jì)算凝膠重量。(需提前記錄離心管重量)該重量作為一個凝膠體積(IOOmg=IOO μ L)。再加入3個凝膠體積的BUFF DE-A，混合后75°C加熱融化，約6-8分鐘，期間間斷混合。再加入0.5個BUFFER DE-A體積的BUFFER DE-B,混合均勻。
[0095]3)將混合液轉(zhuǎn)入DNA制備管。13500rpm離心I分鐘，棄濾液。加入500 μ L BUFFERffl, 13500rpm離心30秒，棄濾液。加700 μ LBUFFER W2, 13500rpm離心30秒，棄濾液。再加700 μ L BUFFER W2, 13500rpm離`心I分鐘，棄濾液。然后再13500rpm離心I分鐘。將制備管置于潔凈的1.51^離心管中，在制備膜中央加入25 4 1^11^社，室溫靜置1分鐘，13500rpm離心I分鐘洗脫DNA。
[0096]12.T4連接酶連接，構(gòu)建最終重組質(zhì)粒
[0097]取割膠回收得到的DDS基因5.5yL，已重組DXS基因的pBBRlMCS-2重組質(zhì)粒
3μ L，T4連接酶0.5 μ L，Τ4連接酶BUFFER I μ L混合，22°C水浴連接30分鐘。將擴(kuò)增好的片段克隆至載體上DXS基因后面，獲得重組載體Ptac-DXS-DDS?；駾XS和基因DDS在同一個tac啟動子的控制下串聯(lián)表達(dá)。
[0098]二、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1
[0099]取出大腸桿菌S17-1感受態(tài)2管，冰浴10分鐘后加入重組載體Ptac_DXS_DDS。冰浴20分鐘，熱擊90秒，冰浴5分鐘，加入600 μ LLB培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)45分鐘后5000rpm離心5分鐘，棄300 μ L上清液，將剩余液體涂布到卡那平板上。
[0100]二、接合轉(zhuǎn)移
[0101]1.接種類球紅細(xì)菌。
[0102]2.第二天晚上接種已轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1的陽性克隆。
[0103]3.第三天早上轉(zhuǎn)接大腸桿菌S17-1，每管5mL LB培養(yǎng)基加入100 μ L菌液，并加入5μ L卡那霉素，放入37°C搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)3-4小時(shí)。
[0104]4.取4mL類球紅細(xì)菌菌液和2mL大腸桿菌菌液，分裝至2mL離心管中，每管lmL。
[0105]5.5000rpm 離心 5 分鐘。
[0106]6.各棄上清，加入ImL新鮮LB培養(yǎng)基，輕輕重懸菌體。
[0107]7.5000rpm 離心 5 分鐘。
[0108]8.各棄上清，加入ImL新鮮LB培養(yǎng)基，輕輕重懸菌體。
[0109]9.按類球紅細(xì)菌和大腸桿菌的比例為100 =10,100 =20,100 =50,100:100的比例混勻菌液。
[0110]10.將混合液澆注于濾膜中心區(qū)域。
[0111]11.將LB平板小心移至32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
[0112]12用鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至2mL離心管中。
[0113]13.用700 μ L LB液體培養(yǎng)基將濾膜上的菌體沖洗下來并吹散。
[0114]14.分裝涂布到含NK的平板培養(yǎng)基上，每板350 μ L菌液。放入32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。
[0115]四、接合轉(zhuǎn)移完檢驗(yàn)是否為陽性克隆
[0116]1.挑取2個生長良好的菌落培養(yǎng)30-48小時(shí)。
[0117]2.轉(zhuǎn)接后2~4小時(shí)提取質(zhì)粒(所用試劑來自AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒)。
[0118]1)取2mL菌液加入離心管。13400rpm離心I分鐘，棄上清。再加入2mL菌液，13400rpm離心I分鐘，棄上清。
[0119]2)加入250yL Buffer SI懸浮細(xì)菌沉淀。不留小的菌塊。需確認(rèn)S I中已加入
RNaseA0
[0120]3)加250 μ L Buffer S2，溫和并充分上下翻轉(zhuǎn)4_6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5分鐘。BufferS2需盡量減少與空氣的接觸。
[0121]4)加350 μ L Buffer S3。溫和并充分的上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，13400rpm離心14分鐘。
[0122]5)取上清液轉(zhuǎn)至制備管，置于2mL離心管中，13400rpm離心I分鐘，棄上清。
[0123]6)加入 500 μ L Buffer Wl, 13400rpm 離心 I 分鐘，棄上清。
[0124]7)加 700 μ L Buffer W2，13400rpm 離心 I 分鐘，棄上清。再加 700 μ L Buffer W2,13400rpm離心I分鐘，棄上清。需確認(rèn)Buffer W2已加入無水乙醇。
[0125]8)然后13400rpm空離I分鐘，將制備管移入新的1.5mL離心管中，加入80 μ L已預(yù)熱到65度的Eluent，室溫靜置I分鐘，13400rpm離心I分鐘。
[0126]3.酶切后進(jìn)行電泳檢測。證實(shí)為陽性克隆。
[0127]其中，所述平板培養(yǎng)基(每IOOmL):酵母提取物0.8g，F(xiàn)eSO40.01g, K2HPO4 0.13g，CoCl2 0.003g,NaCl 0.2g,MnSO4 0.0OOlgjMgSO4 0.025g，葡萄糖 0.3g，維生素 Β10.1 μ g，維生素K 0.1 μ g，維生素A 0.15 μ g，瓊脂粉1.5g ；pH調(diào)節(jié)為7.2。
[0128]實(shí)施例2: IPTG誘導(dǎo)表達(dá)
[0129]一、挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含IOmL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200rpm，在30°C培養(yǎng)23h，獲得一級種子；
[0130]二、將一級種子按1%的比例轉(zhuǎn)接至含20mL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)23h，獲得二級種子；
[0131]三、將二級種子以1%的比例接種至含IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)72h后，添加IPTG至終濃度ImM，(也可選0.0OlmM或IOmM)誘導(dǎo)表達(dá)48h。收集菌液。并采用常規(guī)方法提取其中的輔酶Q10。
[0132]種子培養(yǎng)基每IOOmL中含有:(NH4)2SO40.25g，玉米漿0.05g,酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO40.05g, MgSO4 0.lg, FeSO4 0.01g, CoCl20.003g，MnSO4 0.0OOlg, CaCO3 0.8g，維生素 B10.1 μ g，維生素 K 0.I μ g，維生素 A0.15μ g ;ρΗ 調(diào)節(jié)為 7.2。
[0133]發(fā)酵培養(yǎng)基每IOOmL 種含有:(NH4) 2S040.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO40.15g，味精 0.3g，MgSO4 0.63g，玉米漿 0.4g，F(xiàn)eSO40.12g，CoCl20.005g，CaCO30.6g，維生素BI0.1 μ g,維生素 K 0.I μ g，維生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 調(diào)節(jié)為 7.2。
[0134]實(shí)驗(yàn)例:HPLC檢測比較菌株改造前后同等培養(yǎng)條件下輔酶QlO產(chǎn)量的對比，見表I:
[0135]表1菌株改造前后輔酶QlO產(chǎn)量對比
[0136]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下: a.從類球紅細(xì)菌中提取基因組DNA; b.用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出DXS和DDS的同源基因； c.用擴(kuò)增出的同源基因與廣宿主質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組載體； d.重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1中； e.將大腸桿菌S17-1與類球紅細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移，即得工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述的DXS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示；所述的DDS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所/Jn ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)輔酶QlO的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述的廣宿主質(zhì)粒為克隆載體PBBR1MCS-2 ;所述質(zhì)粒的啟動子為tac啟動子。
4.一株利用如權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建方法得到的工程菌，其特征在于:該菌為類球紅細(xì)菌，拉丁文學(xué)名為/Sot/oAacier sphaeroides ;命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時(shí)間:2012年4月13日；保藏編號:CGMCC N0.5998。
5.利用如權(quán)利要求4所 述的工程菌生產(chǎn)輔酶QlO的方法，其特征在于，具體步驟如下: f.挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含IOmL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200rpm，在26-34°C培養(yǎng)23h，獲得一級種子； g.將一級種子按1%的比例轉(zhuǎn)接至含20mL種子培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，在26-34°C，200rpm的條件下培養(yǎng)23h，獲得二級種子； h.將二級種子以1%的比例接種至含IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL中，在26-34°C，200rpm的條件下培養(yǎng)72h后,添加異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷,誘導(dǎo)表達(dá)48h,收集菌液；并提取輔酶Q10。
6.利用如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)輔酶QlO的方法，其特征在于:所述的種子培養(yǎng)基每IOOmL中含有=(NH4)2SO4 0.25g，玉米漿0.05g，酵母提取物0.14g, NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO4 0.01g, CoCl2 0.003g, MnSO40.0OOlg, CaCO3 (λ 8g，維生素 BI (λ I μ g，維生素 K (λ I μ g，維生素 A 0.15yg;pH 調(diào)節(jié)為7.2。
7.利用如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)輔酶QlO的方法，其特征在于:所述的發(fā)酵培養(yǎng)基每IOOmL 中含有:(NH4)2SO4 0.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO4 0.15g，味精 0.3g，MgSO40.63g，玉米漿 0.4g，F(xiàn)eSO4 0.12g，CoCl2 0.005g, CaCO3 0.6g，維生素 BI 0.1 μ g,維生素 K0.I μ g，維生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 調(diào)節(jié)為 7.2。
8.利用如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)輔酶QlO的方法，其特征在于:所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的濃度為0.0Ol-lOmM。
【文檔編號】C12N1/20GK103509729SQ201210201673
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】于洪巍, 石一軍, 陸文強(qiáng), 王昌澤, 張建新 申請人:浙江新和成股份有限公司, 上虞新和成生物化工有限公司