專利名稱：Rosea 1和Delila作為篩選標(biāo)記在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種菊花可視標(biāo)記基因Rosea I和Delila在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菊花是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，具有重要的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)由于其巨大的優(yōu)越性，正成為觀賞植物育種的重要手段。但是在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，使用的標(biāo)記基因會(huì)產(chǎn)生潛在的生態(tài)環(huán)境和食品安全性問(wèn)題，因此使用安全標(biāo)記基因或去除選擇標(biāo)記已成為基因工程育種的重要目標(biāo)和發(fā)展趨勢(shì)。
標(biāo)記基因的安全性問(wèn)題是近年來(lái)國(guó)際上關(guān)注的熱點(diǎn)，截止目前解決轉(zhuǎn)基因植物安全性的主要策略有兩種1、開(kāi)發(fā)使用無(wú)爭(zhēng)議的生物安全標(biāo)記基因或?qū)剐曰驑?biāo)記進(jìn)行一定修飾；2、在轉(zhuǎn)化時(shí)仍使用傳統(tǒng)的抗性標(biāo)記基因，但獲得轉(zhuǎn)基因植株后再將其去除。目前，利用無(wú)爭(zhēng)議的生物安全標(biāo)記基因是提高標(biāo)記基因的安全性最為有效的辦法，是基因工程發(fā)展的必然趨勢(shì)(王永飛，2004)。與常規(guī)標(biāo)記基因相比，生物安全標(biāo)記基因沒(méi)有抗生素或除草劑抗性，相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)生物是安全的，目前有應(yīng)用前景的安全標(biāo)記基因可以分成兩大類負(fù)向選擇系統(tǒng)和正選擇系統(tǒng)，主要包括化合物解毒酶基因、糖類代謝酶基因、激素代謝酶基因、報(bào)告基因等。去除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的方法主要有共轉(zhuǎn)化法、位點(diǎn)特異重組酶系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子法、多元自主轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)和同源重組等方法?；ㄇ嗨乜梢晿?biāo)記基因?qū)儆谏锇踩珮?biāo)記基因?；ㄇ嗨卮x調(diào)節(jié)基因?qū)胫参锛?xì)胞之后，細(xì)胞可能變成紅色，無(wú)需進(jìn)行組織化學(xué)測(cè)試而殺死植物組織，用一般的解剖鏡甚至肉眼即可觀測(cè)，在眾多的植物遺傳轉(zhuǎn)化報(bào)告基因中是最方便的一種。目前，這些基因已被廣泛應(yīng)用到單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化上。單立波等(2009)研究了玉米花色素苷合成調(diào)節(jié)基因Cl-R在小麥幼胚、玉米愈傷組織、水稻愈傷組織、煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)情況。由于調(diào)節(jié)基因Cl-R激活了植物體細(xì)胞內(nèi)花色素苷的合成，因此不需任何生色底物，即可活體觀察到花素苷的表達(dá)。結(jié)果表明，對(duì)于小麥、水稻、玉米，槍擊48小時(shí)后，放大2倍便可見(jiàn)紅色斑點(diǎn)，且其表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于⑶S的表達(dá)，證明Cl-R基因可以作為一個(gè)很好的衡量打槍效果的指示，同時(shí)還證明其在雙子葉植物煙草葉片的基因槍轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)體系中也起同樣的作用。目前對(duì)于植物花青素的時(shí)空合成機(jī)制已有深入的研究，不同植物中的花青素生物合成受兩類基因的控制一類是結(jié)構(gòu)基因，編碼合成代謝中的酶類；另一類是調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)強(qiáng)度和程式。在花青素合成途徑中，調(diào)節(jié)基因影響著結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)方式和表達(dá)強(qiáng)度，每一步酶促反應(yīng)均是調(diào)節(jié)基因作用的靶位點(diǎn)。目前植物中已分離和鑒定了 3類花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子(Ramsay and Glover, 2005): (I) R2R3-MYB 蛋白；(2) MYC 家族的 bHLH 蛋白；(3)WD40蛋白。利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等技術(shù)現(xiàn)已從金魚(yú)草、玉米、矮牽牛、紫蘇和擬南芥等多種植物中分離出相應(yīng)的調(diào)節(jié)基因(劉仕蕓等，2006):如屬于MYB型的玉米cl/pl基因，矮牽牛an2、an4基因，金魚(yú)草roseal/2、venosa基因；bHLH型的玉米r/b基因、ini基因，紫蘇myc_rp/gp、mycf3gl基因，金魚(yú)草Delila, mutabilis基因；WD40型的矮牽牛anil基因、紫蘇pfwd基因、擬南芥ttgl等。研究表明，多數(shù)調(diào)節(jié)基因?qū)ㄇ嗨赝緩降恼{(diào)控是在結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，并且多數(shù)的調(diào)控是轉(zhuǎn)錄激活，只有少數(shù)幾種調(diào)節(jié)基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。金魚(yú)草中3個(gè)調(diào)控基因Deli la、eluta和rosea主要對(duì)花青素合成途徑的后階段起調(diào)節(jié)作用，而對(duì)早期CHS和CHI階段表現(xiàn)微量調(diào)控(Martin et al.，1991)。
隨著轉(zhuǎn)基因工程中抗生素標(biāo)記基因帶來(lái)的問(wèn)題，目前研究安全標(biāo)記基因成為人們解決這一問(wèn)題的主要方法。因此尋求安全標(biāo)記基因成為轉(zhuǎn)基因工程的熱點(diǎn)和難點(diǎn)?；ㄇ嗨乜梢晿?biāo)記的應(yīng)用為安全轉(zhuǎn)基因提供了一種新的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供Rosea I和Delila作為篩選標(biāo)記在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的Rosea I和Delila作為篩選標(biāo)記在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用，具體是將金魚(yú)草的花青素調(diào)節(jié)基因Rosea I和Delila共轉(zhuǎn)化到菊花中，與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照相比，出現(xiàn)花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。在一個(gè)實(shí)施方案中，Rosea I基因的啟動(dòng)子為擬南芥根部特異性啟動(dòng)子ATH-root,Delila基因的啟動(dòng)子為組成型35S啟動(dòng)子。莖部出現(xiàn)花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。其中，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。本發(fā)明還提供一種菊花轉(zhuǎn)基因的方法。本發(fā)明提供的菊花轉(zhuǎn)基因的方法，其為通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將金魚(yú)草花青素調(diào)節(jié)基因Rosea I和Delila共轉(zhuǎn)化到菊花中。其中，所述的Rosea I基因的啟動(dòng)子為擬南芥根部特異性啟動(dòng)子ATH-root，Delila基因的啟動(dòng)子為組成型35S啟動(dòng)子。其中，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。本發(fā)明通過(guò)將外源基因Rosea I和Delila整合進(jìn)菊花基因組，轉(zhuǎn)基因植物莖部在自然條件下出現(xiàn)明顯紫紅色，與對(duì)照有明顯差異。而且表型觀察與分子鑒定的符合率為75%，表明Rosea I和Delila可以作為菊花轉(zhuǎn)基因工程中的安全標(biāo)記基因，避免抗生素等標(biāo)記基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害。


圖I所示為質(zhì)粒pJAM-root-Ros/DEL載體構(gòu)建流程。圖2 所示為質(zhì)粒 pJAM-root-Ros/DEL 的 PCR 鑒定。圖3所示為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定。M，Marker DL15000 ；1為陰性對(duì)照水；2_3為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；4為陰性對(duì)照植株；5-8為pJAM-root-Ros/Del轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株。圖4所示為轉(zhuǎn)基因植株的Southern檢測(cè)。I為陰性對(duì)照水；2_3為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；4為陰性對(duì)照質(zhì)粒；5-8為pJAM-root-Ros/Del轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株。圖5所示為對(duì)目的基因Delila的表達(dá)進(jìn)行了 RT-PCR檢測(cè)。M，Marker DL15000 ；I為陰性對(duì)照水；2為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；3為陰性對(duì)照植株；4-5為pJAM-root-Ros/Del轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株。圖6所示為轉(zhuǎn)Roseal/Delila基因菊花莖段。A、B為對(duì)照植株；C、D為轉(zhuǎn)化植株。圖7所示為轉(zhuǎn)Roseal/Delila基因菊花不同時(shí)期莖段圖片。A、B為移栽植株；C、D為組培苗。
權(quán)利要求
1.Rosea I和Delila作為篩選標(biāo)記在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，將金魚(yú)草的花青素調(diào)節(jié)基因RoseaI和Delila共轉(zhuǎn)化到菊花中，與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照相比，出現(xiàn)花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的RoseaI基因的啟動(dòng)子為擬南芥根部特異性啟動(dòng)子ATH-root，莖部出現(xiàn)花青素積累或花青素積累量增加的即可初步判斷為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
4.如權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。
5.一種菊花轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將金魚(yú)草花青素調(diào)節(jié)基因Rosea I和Delila共轉(zhuǎn)化到菊花中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的RoseaI基因的啟動(dòng)子為擬南芥根部特異性啟動(dòng)子ATH-root。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的菊花為地被菊‘地毯粉’。
全文摘要
本發(fā)明涉及金魚(yú)草花青素調(diào)節(jié)基因Rosea 1和Delila在菊花轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。Rosea 1和Delila基因轉(zhuǎn)入菊花后可在菊花莖中產(chǎn)生可視標(biāo)記，從而區(qū)別轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株。在菊花轉(zhuǎn)基因工程中可以用該基因代替抗生素標(biāo)記基因，避免抗生素等標(biāo)記基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102719450SQ20121020191
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者張啟翔, 張秀海, 王葉, 石少川, 程堂仁, 高亦珂 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)