專利名稱：一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實現(xiàn)方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物遺傳育種技術領域，具體地說是一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實現(xiàn)方法及其應用。
背景技術：
一般的，乳腺炎是奶牛飼養(yǎng)中最為常見、最為復雜的疾病之一，也是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)損失最大的一種疾病。目前，全世界約有2. 6457億頭奶牛(FA0，2010年)，每年約有1/3的奶?；既橄傺?。據(jù)估計，大約95%的病例是由金黃色葡萄球菌(Staph, aureus)、鏈球菌(Strep, uberis)和大腸桿菌(E. coli)感染引起,每年因乳腺炎造成的損失高達350億美元(Wellenberg等，2002)。有關奶牛乳腺炎發(fā)病機理和防治的研究已有100多年的歷史，并取得了顯著的進展。然而，奶牛乳腺炎是一種非常復雜的疾病，盡管許多國家都已經(jīng)對各種乳腺炎實施綜合防治措施，但它是一種受多因素影響的疾病，很難控制。目前，對乳腺炎 的控制與預防措施并沒有從整體上降低乳腺炎的發(fā)病率，而且乳腺炎也是奶牛生產(chǎn)中抗生素使用的最主要原因(Villli，2001)。因此，我們迫切需要探討其它途徑來降低乳腺炎的發(fā)病率，通過遺傳選擇來提高奶牛乳腺炎抗性被認為是解決乳腺炎問題的一種最好的長期策略(Burton等，2001)。若通過遺傳育種手段，可使奶牛增強乳腺炎的抗性，減少藥物的使用量，改善牛奶質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟損失，有望從根本上解決乳腺炎這一長期困擾著世界奶業(yè)發(fā)展的難題。奶?？剐缘倪z傳力很低，基于表型選擇的遺傳改良效果不佳。而奶牛分子育種可以實現(xiàn)奶牛的早期選擇，大大縮短奶牛遺傳改良的世代間隔，節(jié)約選育成本，提高選擇效率。基因中有的分子標記，例如單核苷酸突變可影響基因的表達調(diào)控、基因功能等，對個體的表型具有重要的影響。因此，基于功能性的分子標記輔助選擇的分子育種技術大有可為。α-2-巨球蛋白(Α2Μ)基因位于牛5號染色體，基因全長48. 3kbp，包含37個外顯子和36個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生4. 9kbp的mRNA。A2M作為一種進化上保守的非特異性廣譜蛋白酶抑制劑，抑制侵入機體的寄生蟲和病原體釋放的多種蛋白酶與毒素，減少其對宿主的破壞，增強宿主的抗病力(Armstrong PB, Quigley JP. 1999. Alpha2-macroglobulin anevolutionarily conserved arm of the innate immune system. Dev Comp Immunol. 23,375-90)。它和補體系統(tǒng)中的補體成分3 (C3)，補體成分4 (C4)和補體成分5 (C5)都屬于α-巨球蛋白家族?？勺兗羟惺且环N重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，可以提高基因產(chǎn)物的多樣性?？勺兗羟惺钦婧松锏囊环N基本而又重要的調(diào)控機制，它精細協(xié)調(diào)基因的功能，高效調(diào)節(jié)基因的定量表達以及蛋白功能的多樣化，使一個基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同的發(fā)育階段、分化細胞和生理狀態(tài)下，通過不同的剪切方式，可以得到不同的mRNA和翻譯產(chǎn)物，從而影響蛋白質(zhì)與其各配體間的連接方式、酶的活性、空間結(jié)構(gòu)以及細胞內(nèi)分布的改變，對細胞的分化、發(fā)育、生理功能和病理狀態(tài)都有重要意義。一個基因通過可變剪切可以產(chǎn)生多種mRNA，產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，但是對于其調(diào)節(jié)機制所知不多。外顯子剪接增強子(ESE)作為引起可變剪切的順式作用原件之一，在產(chǎn)生可變剪切的過程中發(fā)揮了非常重要的作用。單核苷酸多態(tài)(SNPs)是基因突變之一，可以引起前體mRNA的異常剪切，包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留等。最近，許多報道證明SNPs是導致基因產(chǎn)生異?？勺兗羟械闹饕?。(Montgomery SB, SammethM，Gutierrez-Arcelus M，Lach RP, Ingle C，Nisbett J，Guigo R，Dermitzakis ET.2010.Transcriptome genetics using second generation sequencing in a Caucasianpopulation. Nature. 464，773-777)。已經(jīng)報道許多異常的可變剪切和人的許多疾病是有關聯(lián)的。到目前為止沒有牛A2M基因存在可變剪切和引起可變剪切的功能性SNPs的報道，也沒有A2M基因功能性SNPs和奶?？谷橄傺撞〉膱蟮馈?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術任務是解決現(xiàn)有技術的不足，提供一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實現(xiàn)方法及其應用。 本發(fā)明的技術方案是按以下方式實現(xiàn)的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其通過實時熒光定量RT-qPCR和同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因；通過反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和克隆測序分析可變剪切，同時通過基因直接測序技術檢測到該基因的單核苷酸多態(tài)性SNPs，利用軟件分析可變剪切和SNPs的關系，同時對體細胞評分SCS和A2M基因型進行關聯(lián)分析，判斷SNPs位點為功能性位點，選擇有利的等位基因型個體作為奶?？谷橄傺啄芰α舴N。改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其步驟是a :篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，al :對A2M mRNA進行熒光定量PCR，紀錄結(jié)果，a2 :利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對A2M蛋白進行相
對定量，記錄結(jié)果；b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及克隆測序分析可變剪切；c A2M基因的功能性SNP位點鑒別；d:SNPs和可變剪切關系的分析。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于a :篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，al :對A2M mRNA進行熒光定量PCR步驟是首先分別選擇3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織，利用SYBR Premix ExTaqTM II (大連寶生物工程公司，中國)和LightCycler 480 II(Roche Diagnostics)儀器進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)，基因的相對表達水平用持家基因β-actin (序列號NM_173979. 3)做內(nèi)參，實驗重復三次；20 μ I RT-qPCR擴增體系10. 0μ I SYBR Premix Ex TaqTM ΙΙ(2Χ)，0·4μΜ上下游引物A2M-F SEQ ID NO. 1，A2M-R SEQ ID NO. 2 ；或β -actinF SEQ ID NO. 3，β -actin-R SEQ ID NO. 4 ；2. 0 μ I A2M cDNA( < IOOng)或
β-actin 質(zhì)粒 DNA, 6· 4 μ I 蒸懼水；擴增反應條件94°C 5min ;然后94°C 15s，56°C 15s，這一步共40個循環(huán)；最后70°C 5s,分析熒光定量的結(jié)果，比較A2M mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達量和正常的乳腺組織中的表達量；a2 :利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對A2M蛋白進行相對定量步驟是利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織A2M蛋白進行相對定量，牛的蛋白參考數(shù)據(jù)庫為UniProt ID Q9H0H5, iTRAQ的結(jié)果 比較患乳腺炎組織A2M蛋白表達量和正常的組織表達量；b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及克隆測序分析可變剪切的步驟是以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，根據(jù)A2M基因cDNA序列(NCBI參考序列NM_001109795. I)設計特異引物擴增A2M cDNA片段，特異引物上游引物A2MF序列為SEQID NO. 9，下游引物 A2MR 序列為SEQ IDN0. 10，25 μ I PCR 體系反應成分包括DNA(100ng/y I) I μ I, A2MF, A2MR 引物(lOymol/L)各O. 5 μ 1，2 X Taq PCR MasterMix (北京諾維森生物公司)12. 5 μ 1，重餾水補至25 μ 1，PCR 程序為94 V 4min,然后 94 °C 30s, 64. 9 V 30s, 72 V 30s，共 35 個循環(huán)，72°C IOmin,PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 4623bp PCR目的帶外，還有4條清晰的帶，對這4條帶純化后連接到pGEM -T Easy載體，測序后發(fā)現(xiàn)2種新的可變剪切形式,標記為A2M-AS1和A2M-AS2 ； c A2M基因的功能性SNP位點鑒別步驟是根據(jù)引起基因可變到切機制的相關背景資料，參考NCBI中牛A2M基因序列(序列號NC_007303. 4)，以奶牛DNA為模板，設計F1/R1和F2/R2引物擴增發(fā)生可變剪切位置附近的DNA序列引物序列Fl 為SEQ ID NO. 5 ；R1 為SEQ ID NO. 6 ；引物序列F2 為SEQ ID NO. 7 ；R2 為SEQ ID NO. 8 ；25 μ I PCR體系，PCR反應，然后對產(chǎn)物直接測序，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測序結(jié)果，在Α2Μ基因的29和37外顯子上發(fā)現(xiàn)了兩個SNPs位點c. 3535A > T和c. 4520T > C(NCBI 參考序列ΝΜ_001109795. I);其中，c. 3535A > T 是位于擴增片段 SEQID NO. 12第642bp處的單核苷酸位點；c. 4520T > C位于擴增片段SEQ ID NO. 14第526bp處的單核苷酸位點，選擇A2M基因序列上鑒別到的2個SNPs位點在338頭中國荷斯坦奶牛個體中采用直接測序的方法進行SNP基因分型，采用SAS8. I軟件進行關聯(lián)性分析，通過關聯(lián)性分析結(jié)果，分別發(fā)現(xiàn)這2個位點的AA和TT基因型型具有比較高的SCS，根據(jù)這2個基因型和SCS的表型有關，篩選出乳腺炎抗性/易感功能性分子標記，通過對奶牛個體基因型的判定，通過標記輔助選擇的方法，可選育乳腺炎抗性個體，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系；d:SNPs和可變剪切關系的分析為了分析測序發(fā)現(xiàn)的SNPs和可變剪切的關系，利用ESEfinder3. O對這2個SNP進行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個SNP正好是位于剪切增強子內(nèi)ESE，其中，c. 3535A > T突變增加了SC35 and SRp40兩種剪切蛋白的結(jié)合，c. 4520T > C突變增加了 SRp40剪切蛋白的結(jié)合，同時對奶牛DNA進行測序，并且提取它們相應的總RNA，利用RT-PCR和克隆測序技術分析c. 3535和c. 4520位點的基因型和異?？勺兗羟畜w的關系。一對擴增奶牛A2M不同可變剪切體所設計的PCR擴增引物，其特征在于上游引物A2MF序列為SEQ ID NO. 9，下游引物A2MR序列為SEQ ID NO. 10，其PCR擴增的異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的產(chǎn)物大小為1242bp，序列如SEQ IDN0. 16 ;異?？勺兗羟畜wA2M-AS2的產(chǎn)物大小為3607bp，序列如SEQ IDN0. 17。一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點，其特征在于其序列如SEQID NO. 12，并且擴增片段第642bp處的單核苷酸位點為A或T。一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異?？勺兗羟畜wA2M-AS2的核·苷酸序列及其功能性單核苷酸位點，其特征在于其序列如SEQID NO. 14，并且擴增片段第526bp處的單核苷酸位點為T或C。所述的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點在奶牛乳腺炎抗性育種中的應用。影響奶牛乳腺炎易感/抗性的A2M基因功能性分子標記位點在奶牛乳腺炎抗性遺傳改良中的應用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比所產(chǎn)生的有益效果是本發(fā)明通過分子生物學技術手段，可實現(xiàn)對奶牛個體或群體的乳腺炎抗性早期選擇，改變現(xiàn)有的只根據(jù)表型選擇效果不佳狀況，可顯著提供奶牛乳腺炎抗性選擇的準確性和可靠性。本發(fā)明通過遺傳育種手段，可增加乳腺炎抗性基因在群體中的分布，可增加奶牛群體對乳腺炎的抗性，降低發(fā)病率，減少藥物的使用量，改善牛奶質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟損失。本發(fā)明鑒別了 2個功能性的SNPs位點，可導致奶牛產(chǎn)生2種A2M基因異?？勺兗羟畜w，通過分子生物學相關技術檢測個體奶牛A2M基因的這2個位點的基因型，并且通過和奶牛生產(chǎn)性能測定(DHI)數(shù)據(jù)關聯(lián)分析后選擇有利的基因型個體留種，可以提高A2M乳腺炎抗性基因型個體在群體中的比例，降低奶牛乳腺炎病的發(fā)病率，減少經(jīng)濟損失。本發(fā)明為奶牛的乳腺炎抗性遺傳改良提供了一種新的方法。


圖IA2M基因在正常和乳腺炎組織中的差異表達，A :mRNA差異表達B :蛋白差異表達。圖2A2M cDNA擴增的PCR產(chǎn)物在I %瓊脂糖的檢測。圖3可變剪切體A2M-AS1和A2M-AS2的模式示意圖。圖4c. 3535A > T突變前后ESE的變化。圖5c. 4520T > C位點攜帶牛的基因測序峰圖。圖6c. 4520T > C突變前后ESE的變化。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的實現(xiàn)方法及其應用作以下詳細說明。本發(fā)明的目的一是通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因的方法；通過RT-PCR和克隆測序新發(fā)現(xiàn)了 2種可變剪切，同時通過基因直接測序技術檢測到該基因的2個SNPs，利用ESEfinder 3. O軟件分析新發(fā)現(xiàn)的2種可變剪切和SNPs的關系，同時對體細胞評分(SCS)和A2M基因型進行了關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)這2個SNPs位點為功能性位點。選擇有利的等位基因型個體留種，可以改善奶牛的抗乳腺炎能力，提高產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)。本發(fā)明的目的之二是影響奶牛乳腺炎易感/抗性的A2M基因功能性分子標記位點在奶牛乳腺炎抗性遺傳改良中的應用。目的一實現(xiàn)的方法具體如下 I、篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因I. 1A2M mRNA 進行熒光定量 PCR首先分別選擇3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織，利用SYBR Premix ExTaqTM 11(大連寶生物工程公司，中國)和LightCycler 480 II (Roche Diagnostics)儀器進行實時熒光定量PCR (RT-qPCR)?；虻南鄬Ρ磉_水平用持家基因β-actin(序列號ΝΜ_173979· 3)做內(nèi)參。實驗重復三次。20 μ I RT-qPCR擴增體系10. O μ I SYBR Premix Ex TaqTM II (2 X)，O. 4 μ M 上下游引物(A2M-F :SEQ ID NO. 1，A2M-R :SEQ ID NO. 2或 β-actinF :SEQ ID NO. 3, β -actin-R SEQ ID NO. 4), 2. 0 μ I A2M cDNA ( < IOOng)或β -actin質(zhì)粒DNA，6. 4μ I蒸餾水。擴增反應條件如下-MV 5min ;然后94°C 15s，56。。15s，這一步共40個循環(huán)；最后70°C 5s.熒光定量的結(jié)果表明A2M mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達顯著高于正常的乳腺組織，見圖I。I. 2A2M蛋白進行相對定量利用同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)的方法對3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織A2M蛋白進行相對定量。牛的蛋白參考數(shù)據(jù)庫為UniProt ID :Q9H0H5。iTRAQ的結(jié)果顯示患乳腺炎組織A2M蛋白表達量比起正常的組織上調(diào)了將近3. 5倍，見圖I。2、利用RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及克隆測序分析以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，根據(jù)已報道的A2M基因cDNA序列(NCBI參考序列NM_001109795. I)設計特異引物擴增A2M cDNA片段。特異引物上游引物A2MF序列為SEQ ID NO. 9，下游引物A2MR序列為=SEQID NO. 10。25 μ I PCR 體系反應成分包括DNA(100ng/y I) I μ I, A2MF, A2MR 引物(lOymol/L)各O. 5μ l，2XTaq PCR MasterMix (北京諾維森生物公司)12. 5 μ 1，重餾水補至25 μ I。PCR 程序為94°C 4min ;然后 94°C 30s, 64. 9°C 30s, 72°C 30s，共 35 個循環(huán)；72°C IOmin0PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 4623bp PCR目的帶外，還有4條清晰的帶，對這4條帶純化后連接到pGEM -T Easy載體，測序后發(fā)現(xiàn)2種新的可變剪切形式，命名為A2M-AS1和A2M-AS2，剪切模式見圖3。3、A2M基因的功能性SNP位點鑒別
根據(jù)引起基因可變到切機制的相關背景資料，參考NCBI中牛A2M基因序列(序列號NC_007303. 4)，以奶牛DNA為模板，設計F1/R1和F2/R2引物擴增發(fā)生可變剪切位置附近的DNA序列。引物序列Fl為SEQ ID NO. 5 ；R1為SEQ ID NO. 6。引物序列F2為=SEQID NO. 7 ；R2 為SEQ ID NO. 8。25 μ I PCR體系如上述2中所述，然后對產(chǎn)物直接測序，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測序結(jié)果。申請人在Α2Μ基因的29和37外顯子上發(fā)現(xiàn)了兩個SNPs位點c. 3535Α > T 和 C. 4520Τ > C (NCBI 參考序列ΝΜ_001109795. I)。其中，c. 3535A > T 是位于擴增片段SEQ ID NO. 12第642bp處的單核苷酸位點。c. 4520T>C位于擴增片段SEQ IDNO. 14第526bp處的單核苷酸位點。選擇A2M基因序列上鑒別到的2個SNPs位點在338頭中國荷斯坦奶牛個體中采用直接測序的方法進行SNP基因分型。采用SAS8. I軟件進行關聯(lián)性分析(表I)。通過關聯(lián) 性分析結(jié)果，申請人分別發(fā)現(xiàn)這2個位點的AA和TT基因型型具有比較高的SCS，具體分析見表I。根據(jù)這2個基因型和SCS的表型有關，篩選出乳腺炎抗性/易感功能性分子標記，通過對奶牛個體基因型的判定，通過標記輔助選擇的方法，可選育乳腺炎抗性個體，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系。表I A2M基因型和體細胞數(shù)表型關聯(lián)性分析
位置基因型個體數(shù)，、
(SCS)
c.3535A>T AA2013.96 ±0.23
AT1034.53 ±0.52
TT345.12 ±0.60
c.4520T>C TT1634.33 土 0.35
TC1244.81 士 0.46
CC515.28 ±0.574、SNPs和可變剪切關系的分析為了分析測序發(fā)現(xiàn)的SNPs和可變剪切的關系，利用ESEfinder 3. O對這2個SNP進行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個SNP正好是位于剪切增強子內(nèi)(ESE)。其中，c. 3535A > T突變增加了 SC35 and SRp40兩種剪切蛋白的結(jié)合(圖4)。有報道，剪切蛋白SC35可以引起異常的可變剪切(Gabut M, MineM, Marsac C, Brivet M, Tazi J, Soret J. 2005. The SR proteinSC35 is responsible for aberrant splicing of the Elalpha pyruvate dehydrogenasemRNA in a case of mental retardation with lactic acidosis. Mol Cell Biol. 25,3286-94.)。c. 4520T > C突變增加了 SRp40剪切蛋白的結(jié)合(圖5)。同時對奶牛DNA進行測序，并且提取它們相應的總RNA。利用RT-PCR和克隆測序技術分析c. 3535和c. 4520位點的基因型和異?？勺兗羟畜w的關系，詳見表2和表3。表2 c. 3535位點基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS1的關系c.3535A>T 樣品數(shù)A2M-AS1 數(shù) A2M-AS1 頻率
AA20OO
AT12758.3%
TT33100%表3 c. 4520位點基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS2的關系
c.4520T>C 樣品數(shù)A2M-AS2 數(shù) A2M-AS2 頻率
TT15OO
TC12975%
CC77100%目的二實現(xiàn)的方法具體如下本發(fā)明利用A2M基因的2個功能性SNPs位點的信息，采用分子生物學相關技術鑒別奶牛在這2個位點的基因型，選擇具有乳腺炎抗性的基因型個體。本發(fā)明鑒別了 2個功能性的SNPs位點，可導致奶牛產(chǎn)生2種A2M基因異?？勺兗羟?，通過分子生物學相關技術檢測個體奶牛A2M基因的這2個位點的基因型，并且通過和奶牛生產(chǎn)性能測定(DHI)數(shù)據(jù)關聯(lián)分析后選擇有利的基因型個體留種，可以提高A2M乳腺炎抗性基因型個體在群體中的比例，降低奶牛乳腺炎病的發(fā)病率，減少經(jīng)濟損失。本發(fā)明為奶牛的乳腺炎抗性遺傳改良提供了一種新的方法。利用228頭中國荷斯坦奶牛作為實驗動物，這些奶牛血樣來自青島高產(chǎn)和濟南佳寶牛場。228頭牛具有DHI數(shù)據(jù)。采用直接DNA測序的方法對A2M基因c. 3535位點在在上述的228頭奶牛進行SNP基因分型。分型過程中，F(xiàn)1/R1引物的擴增片段第642堿基A，為野生型，序列為SEQ IDNO. 12 ;擴增片段第642堿基T為突變型，序列為SEQID NO. 13。同時對這個SNP位點的基因型與DHI記錄中的SCS表型進行關聯(lián)性統(tǒng)計分析，見表4。同時對一定數(shù)量的牛DNA進行測序，并且提取它們相應的mRNA。利用RT-PCR和克隆測序技術分析c. 3535位點的基因型和可變剪切A2M-AS1的關系，見表5。表4 A2M基因型和體細胞數(shù)表型關聯(lián)性分析
位置基因型個體數(shù)體細胞數(shù)
c.3535A>T AA1294.16 ±0.53
AT734.73 ± 0.63
TT264.97 ± 0.67表5 c. 3535位點基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS1的關系檢測出檢測出c.3535A>T 樣品數(shù)A2M-AS1 個體A2M-AS1 個體數(shù)的比例
AA13OO
AT6350%
TT22100%分析結(jié)果表明SNP位點c. 3535A > T，A等位基因為抗性基因，T等位基因為易感基因，基因型AA個體對奶牛乳腺炎具有抵抗性；此位點分別為AA型個體是抗乳腺炎病奶牛的選育改良所需要的優(yōu)良基因型個體。利用192頭中國荷斯坦奶牛作為實驗動物，這些奶牛血樣來自青島高產(chǎn)和濟南佳寶牛場。這192頭牛的DHI數(shù)據(jù)記錄完全。 采用直接DNA測序的方法對A2M基因c. 4520位點在在上述的192頭奶牛進行SNP基因分型。分型過程中，F(xiàn)2/R2引物的擴增片段第526堿基T為野生型，序列為SEQ IDNO. 14 ;擴增片段第526堿基C為突變型，序列為SEQID NO. 15。同時對這個SNP位點進行分型后與DHI記錄中的SCS表型進行關聯(lián)性統(tǒng)計分析，見表5。同時對牛DNA進行測序，并且提取它們相應的mRNA。利用RT-PCR和克隆測序技術分析c. 4520位點的基因型和可變剪切A2M-AS2的關系，見表6。表5 A2M基因型和體細胞數(shù)表型關聯(lián)性分析
位置基因型個體數(shù)體細胞評分
c.4520T>C TT1054.05 ± 0.37
TC674.36 士 0.49
CC205.17 ±0.61表6 c. 4520位點基因型和產(chǎn)生可變剪切A2M-AS2的關系
c.4520T>C位點奶牛頭數(shù)檢測出檢測出 基因型A2M-AS2的奶A2M-AS2奶牛 牛頭數(shù)的比例
TT9OO
TC3I33.3%
CCII100%分析結(jié)果表明SNP位點c. 4520T > C，T等位基因為抗性基因，C等位基因為易感基因，基因型TT個體對奶牛乳腺炎具有抵抗性。此位點分別為TT型個體是抗乳腺炎病奶牛的選育改良所需要的優(yōu)良基因型個體。
權(quán)利要求
1.一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于通過實時熒光定量RT-qPCR和同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因；通過反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和克隆測序分析可變剪切，同時通過基因直接測序技術檢測到該基因的單核苷酸多態(tài)性SNPs，利用軟件分析可變剪切和SNPs的關系，同時對體細胞評分SCS和A2M基因型進行關聯(lián)分析，判斷SNPs位點為功能性位點，選擇有利的等位基因型個體作為奶?？谷橄傺啄芰α舴N。
2.一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于其步驟是 a:篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因，al :對A2M mRNA進行熒光定量PCR，記錄結(jié)果，a2 :利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對A2M蛋白進行相對定量，記錄結(jié)果； b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及克隆測序分析可變剪切； c :A2M基因的功能性SNP位點鑒別； d =SNPs和可變剪切關系的分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法，其特征在于a:篩選A2M基因作為奶牛乳腺炎易感/抗性候選基因， al :對A2M mRNA進行熒光定量PCR步驟是 首先分別選擇3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織，利用SYBR PremixEx TaqTMII(大連寶生物工程公司，中國)和LightCycler 480 II (Roche Diagnostics)儀器進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)，基因的相對表達水平用持家基因i3_actin(序列號NM_173979. 3)做內(nèi)參，實驗重復三次； . 20 μ I RT-qPCR擴增體系10. 0μ I SYBR Premix Ex TaqTM II (2 X )，O. 4 μ M 上下游引物A2M-F SEQ ID NO. 1，A2M-R SEQ ID NO. 2 ； 或β-actinF SEQ ID NO. 3，β-actin-R SEQ ID NO. 4 ； . 2.0μ I A2M cDNA( < IOOng) 或β -actin 質(zhì)粒 DNA, 6. 4 μ I 蒸懼水； 擴增反應條件94°C 5min ;然后94°C 15s，56°C 15s，這一步共40個循環(huán)；最后70°C 5s，分析熒光定量的結(jié)果，比較A2M mRNA在患乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達量和正常的乳腺組織中的表達量； a2 :利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對A2M蛋白進行相對定量步驟是利用同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法對3頭正常的和3頭患乳腺炎的乳腺組織A2M蛋白進行相對定量，牛的蛋白參考數(shù)據(jù)庫為UniProt ID Q9H0H5, iTRAQ的結(jié)果比較患乳腺炎組織A2M蛋白表達量和正常的組織表達量； b :利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳及克隆測序分析可變剪切的步驟是 以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，根據(jù)A2M基因cDNA序列(NCBI參考序列NM_001109795. I)設計特異引物擴增A2M cDNA片段，特異引物上游引物A2MF序列為SEQID NO. 9，下游引物 A2MR 序列為SEQ IDN0. 10，.25 μ I PCR 體系反應成分包括DNAdOOng/μ 1)1μ 1，A2MF，A2MR 引物(10ymol/L)各O. 5 μ 1，2 X Taq PCR MasterMix (北京諾維森生物公司)12. 5 μ 1，重餾水補至25 μ 1， PCR程序為-MV 4min，然后 94°C 30s, 64. 9°C 30s，72。。30s，共 35 個循環(huán)，72°C IOmin,PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 4623bp PCR目的帶外，還有4條清晰的帶，對這4條帶純化后連接到pGEM -T Easy載體，測序后發(fā)現(xiàn)2種新的可變剪切形式，標記為 A2M-AS1 和 A2M-AS2 ； c A2M基因的功能性SNP位點鑒別步驟是 根據(jù)引起基因可變到切機制的相關背景資料，參考NCBI中牛A2M基因序列(序列號NC_007303. 4)，以奶牛DNA為模板，設計F1/R1和F2/R2引物擴增發(fā)生可變剪切位置附近的DNA序列引物序列 Fl 為SEQ ID NO. 5 ；R1 為SEQ ID NO. 6 ；引物序列 F2 為SEQ ID NO. 7 ；R2 為SEQ ID NO. 8 ； . 25 μ I PCR體系，PCR反應，然后對產(chǎn)物直接測序，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件分析測序結(jié)果，在Α2Μ基因的29和37外顯子上發(fā)現(xiàn)了兩個SNPs位點c. 3535A > T和c. 4520T > C(NCBI 參考序列ΝΜ_001109795. I);其中，c. 3535A > T 是位于擴增片段 SEQID NO. 12第642bp處的單核苷酸位點；c. 4520T > C位于擴增片段SEQ ID NO. 14第526bp處的單核苷酸位點， 選擇A2M基因序列上鑒別到的2個SNPs位點在338頭中國荷斯坦奶牛個體中采用直接測序的方法進行SNP基因分型，采用SAS8. I軟件進行關聯(lián)性分析，通過關聯(lián)性分析結(jié)果，分別發(fā)現(xiàn)這2個位點的AA和TT基因型型具有比較高的SCS，根據(jù)這2個基因型和SCS的表型有關，篩選出乳腺炎抗性/易感功能性分子標記，通過對奶牛個體基因型的判定，通過標記輔助選擇的方法，可選育乳腺炎抗性個體，培育出抗乳腺炎的奶牛新品系；d =SNPs和可變剪切關系的分析 為了分析測序發(fā)現(xiàn)的SNPs和可變剪切的關系，利用ESEfinder3. O對這2個SNP進行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個SNP正好是位于剪切增強子內(nèi)ESE，其中，c. 3535A > T突變增加了 SC35and SRp40兩種剪切蛋白的結(jié)合，c. 4520T > C突變增加了 SRp40剪切蛋白的結(jié)合， 同時對奶牛DNA進行測序，并且提取它們相應的總RNA，利用RT-PCR和克隆測序技術分析c. 3535和c. 4520位點的基因型和異常可變剪切體的關系。
4.一對擴增奶牛A2M不同可變剪切體所設計的PCR擴增引物，其特征在于上游引物A2MF序列為SEQ ID NO. 9，下游引物A2MR序列為SEQ IDN0. 10，其PCR擴增的異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的產(chǎn)物大小為1242bp，序列如SEQ ID NO. 16 ;異?？勺兗羟畜wA2M-AS2的產(chǎn)物大小為3607bp，序列如SEQ ID NO. 17。
5.一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異?？勺兗羟畜wA2M-AS1的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點，其特征在于其序列如SEQID NO. 12，并且擴增片段第642bp處的單核苷酸位點為A或T。
6.一種影響奶牛乳腺炎易感/抗性A2M基因可產(chǎn)生異?？勺兗羟畜wA2M-AS2的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點，其特征在于其序列如SEQID NO. 14，并且擴增片段第526bp處的單核苷酸位點為T或C。
7.權(quán)利要求中1、2、3、4、5中任一所述的核苷酸序列及其功能性單核苷酸位點在奶牛乳腺炎抗性育種中的應用。
8.影響奶牛乳腺炎易感/抗性的A2M基因功能性分子標記位點在奶牛乳腺炎抗性遺傳改良中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種改善奶牛的抗乳腺炎能力的選種方法及其應用，屬于動物遺傳育種技術領域，通過實時熒光定量RT-qPCR和同位素標記相對和絕對定量iTRAQ的方法提供一個奶牛乳腺炎易感/抗性A2M候選基因；通過反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和克隆測序分析可變剪切，同時通過基因直接測序技術檢測到該基因的單核苷酸多態(tài)性SNPs，利用軟件分析可變剪切和SNPs的關系，同時對體細胞評分SCS和A2M基因型進行關聯(lián)分析，判斷SNPs位點為功能性位點，選擇有利的等位基因型個體作為奶?？谷橄傺啄芰α舴N。本發(fā)明通過遺傳育種手段，可使奶牛增強乳腺炎的抗性，減少藥物的使用量，改善牛奶質(zhì)量安全，減少經(jīng)濟損失。
文檔編號C12Q1/68GK102899395SQ201210203358
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者黃金明, 王秀革, 袁金鐸, 王長法, 鞠志花, 李秋玲, 齊超, 張燕, 李榮嶺, 李建斌, 侯明海, 仲躋峰 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院奶牛研究中心