專利名稱：一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種谷子育種材料類型的劃分方法，具體涉及一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，屬于作物品種分類研究領域。
背景技術：
傳統(tǒng)的谷子育種材料分類方法是按照育種材料的某一方面的特征特性而進行劃分的，如按育性可分為正?？捎牧虾托坌圆挥?，按株型可分為緊湊型、半緊湊型和披散型，按適宜種植季節(jié)分為春谷、夏谷，按生育期分為早熟、中熟和晚熟等等。近些年來隨著生物技術的發(fā)展，學者們通過構建進化樹研究谷子種質(zhì)資源間親緣關系，并據(jù)此研究種質(zhì)資源遺傳進化關系，進而研究各類群與生態(tài)類型、地理來源關系的報道，如2006年王節(jié)之等(生物技術，2006，16 (I) 10-14)利用SSR引物，通過構建進化樹研 究來自全國不同生態(tài)區(qū)的96份谷子品種資源的遺傳進化關系，將谷子育種材料分為5個類群，但并沒能得出遺傳類群與生態(tài)類型具有一致性的結論。2009年賈小平等(Theor ApplGenet, 2009,118 :821-829)也利用進化樹進行谷子種質(zhì)資源的遺傳進化方面的研究，依據(jù)研究者對供試材料的認識，將供試材料的進化樹縱切的遺傳相似系數(shù)確定為0. 77或0. 8，在遺傳相似系數(shù)為0. 77時，供試材料被劃分為2個類群；在遺傳相似系數(shù)為0. 8時,供試材料被劃分為5個類群，由于不能確定對進化樹進行縱切的特定遺傳相似系數(shù)，因此，不能得出理想的遺傳進化研究結果。并且所有的這些研究均是基于細胞核的遺傳信息開展的，到目前為止，未見基于細胞質(zhì)遺傳信息對谷子育種材料進行類型劃分的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了克服上述技術缺陷而提供一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法。本發(fā)明的原理是根據(jù)谷子細胞質(zhì)中線粒體遺傳保守，呈典型母系遺傳的特點，利用線粒體特異引物，擴增其非編碼區(qū)，對線粒體進行多態(tài)性分析，據(jù)此構建基于分子水平的谷子育種材料細胞質(zhì)來源進化樹；通過系譜追蹤，構建谷子育種材料的母本衍生進化圖；依據(jù)母本衍生進化圖，通過母本衍生進化圖和細胞質(zhì)來源進化樹的比較分析，確定對谷子育種材料細胞質(zhì)來源進化樹縱切的特定遺傳相似系數(shù)，并對其細胞質(zhì)來源進行分子聚類；將細胞質(zhì)來源分子聚類圖與母本衍生進化圖結合，確定各類群材料的細胞質(zhì)類型。本發(fā)明的特點是將谷子育種材料細胞質(zhì)來源進化樹與谷子育種材料的母本衍生進化圖結合，確定對進化樹進行縱切的特定遺傳相似系數(shù)，從而達到對谷子育種材料的細胞質(zhì)進行了分類的目的。本發(fā)明提供的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于包括如下步驟(I)細胞質(zhì)來源進化樹的構建；(2)母本衍生進化圖的構建；(3)特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類；(4)谷子育種材料細胞質(zhì)類型的確定。一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(I)所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建包括如下步驟①葉片組織的培養(yǎng)與獲取將谷子育種材料的種子種于育苗盤中獲得谷子幼苗，于4葉期分別剪取育種材料的葉片組織；②全基因組DNA的提取采用CTAB法提取步驟①中葉片組織的全基因組DNA ；③PCR擴增采用20 Ul反應體系，利用線粒體特異引物對步驟②提取的基因組DNA進行37個反應循環(huán)PCR擴增；④多態(tài)性檢測利用凝膠電泳法對步驟③中線粒體的PCR擴增產(chǎn)物進行多態(tài)性檢測；⑤細胞質(zhì)來源進化樹的生成對步驟④中電泳圖譜上清晰且可重復出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒有出現(xiàn)的帶記為“0”，生成由“I”和“0”組成的原始矩陣，用NTSYS-PC2. I軟件進行數(shù)據(jù)分析，用SAHN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，生成細胞質(zhì)來源的進化樹。 所述的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(2)所述的母本衍生進化圖的構建為利用系譜追蹤法將谷子育種材料按步驟(I)中進化樹的排列順序進行縱向排列，通過逐代向上追蹤育種材料的母本，直到追蹤到農(nóng)家品種為止，依據(jù)系譜將同一母本衍生的育種材料按照衍生關系逐步連接起來，形成母本衍生進化圖。所述的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(3)所述的特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類為將步驟(2)構建的谷子育種材料的母本衍生進化圖與步驟(I)中構建的谷子育種材料的胞質(zhì)來源進化樹相結合，并進行比較分析，確定基本能將同一母本衍生系統(tǒng)聚為一個分枝的特定遺傳相似系數(shù)，在該遺傳相似系數(shù)下對步驟(I)中構建的谷子育種材料的胞質(zhì)來源進化樹進行縱切，將谷子育種材料進行胞質(zhì)來源的分子聚類，分子聚類中每個分枝代表一個胞質(zhì)類群。所述的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(4)所述的谷 子育種材料細胞質(zhì)類型的確定是將步驟(3)中的分子聚類圖與步驟(2)中構建的母本衍生進化圖結合，將胞質(zhì)來源分子聚類圖中的每個分枝與對應的母本衍生系統(tǒng)逐一進行對比，確定每個類群材料的細胞質(zhì)類型，完成對谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分。所述的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(I)所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建中步驟①中所述的谷子育種材料為延谷12、長高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、壩谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、鄭9188、大同28、鐵8240、錦谷12、錦谷14、朝438、公谷68、鐵487、鐵谷6、復532、晉汾I、滄156、濟谷13、長高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29綠、安2491、興谷88、晉15、晉汾3、滄344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷 12、K523、L70、鐵大粒黃、K359、朝谷 13、谷 83、衡 968、濟 9403、冀谷 27、濟 9409、魯谷 10、濟谷 12、濟谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安 4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、長高 146A、石 207226、石 206058、公谷 65X164,203184 早、安 2367、石 202242、谷 57、冀谷 24、谷豐 2 號、石 06-439、谷 38、小香米、冀谷19、K1130、壩谷214-2、谷11、K1011、長農(nóng)36、冀谷28、長農(nóng)35、晉谷35、太選5號、太選2號、晉谷21、谷95、晉谷29、朝谷14、K660、美國大頭、谷10、K546、朝綠-I、晉谷16、石98622和石97672共111份。所述的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(2)所述的母本衍生進化圖的構建中111份谷子育種材料中12份來源于同一母本材料沁源母雞嘴、13份材料來源于同一母本材料黃軟谷、63份材料來源于同一母本材料日本60日、6份材料來源于同一母本材料硬穗谷、5份材料來源于同一母本材料黑枝谷，12份材料未追蹤到其母本，便于研究命名為系譜丟失I型和系譜丟失II型。所述的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(3)所述的特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類中特定遺傳相似系數(shù)為0. 74，在該遺傳相似系數(shù)下對步驟(I)中所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建中所構建的進化樹進行縱切，將其縱切為7個分枝，每個分枝代表I個胞質(zhì)來源的分子類群，這樣將胞質(zhì)來源進化樹縱切為7個類群，縱切結果與母本衍生進化圖一致性達98. 2%。所述的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(4)所述的谷子育種材料細胞質(zhì)類型的確定中將步驟(3)中所述的特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類中構建的分子聚類圖與步驟(2)中所述的母本衍生進化圖的構建中所構建的母本衍生進化圖相結合，進行逐一對比，確定各類群材料的胞質(zhì)類型，分別為來源于“沁園母雞嘴”的Q型，來源于“日本60日”的R型，來源于“黃軟谷”的H型，來源于“硬穗谷”的Y型，來源于“黑枝谷”的S型，還有兩種由于系譜丟失，追蹤不到母本來源，分別定名 為M I型和M II型。有益效果利用本發(fā)明方法可將谷子育種材料的細胞質(zhì)類型進行劃分，如對我國目前雜優(yōu)利用研究中具有較大利用價值的111份谷子育種材料按本發(fā)明可分為7個類型來源于“泌園母雞嘴”的Q型，來源于“日本60日”的R型，來源于“黃軟谷”的H型，來源于“硬穗谷”的Y型，來源于“黑枝谷”的S型，還有兩種由于系譜丟失，追蹤不到母本來源，分別定名為M I型和M II型，并且劃分的7種類型的分子聚類結果與系譜追蹤結果一致性高達98. 1%，為培育不同細胞質(zhì)類型的不育系和雜交種奠定了基礎。


圖1-1和圖1-2是谷子育種材料線粒體的PCR擴增多態(tài)性檢測圖譜；圖中，M為Marker ;V1_V111分別代表111份谷子育種材料延谷12、長高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、壩谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、鄭9188、大同28、鐵8240、錦谷12、錦谷14、朝438、公谷68、鐵487、鐵谷6、復532、晉汾I、滄156、濟谷13、長高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29綠、安2491、興谷88、晉15、晉汾3、滄344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷 12、K523、L70、鐵大粒黃、K359、朝谷 13、谷 83、衡 968、濟 9403、冀谷 27、濟 9409、魯谷 10、濟谷 12、濟谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安 4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、長高 146A、石 207226、石206058、公谷 65X164,203184 早、安 2367、石 202242、谷 57、冀谷 24、谷豐 2 號、石 06-439、谷38、小香米、冀谷19、K1130、壩谷214-2、谷11、K1011、長農(nóng)36、冀谷28、長農(nóng)35、晉谷35、太選5號、太選2號、晉谷21、谷95、晉谷29、朝谷14、K660、美國大頭、谷10、K546、朝綠-I、晉谷16、石98622、石97672的DNA ；A為標準條帶，“帶”的顏色深于或同于“A”的條帶記為“1”，淺于1”的條帶記為“0”。圖2-1、2_2和2-3是111份谷子育種材料的細胞質(zhì)來源進化樹的三個組成部分，
三者按順序拼接在一起即得進化樹全圖中，0.55,0. 66,0. 78,0. 89、I. 00 為遺傳相似系數(shù)圖3-1、3_2和3-3是111份谷子育種材料的母本衍生進化圖的三個組成部分，三者按順序拼接在一起即得母本衍生進化圖全圖；圖中，用實線連接的是母本來源明確的材料；用虛線連接的是母本來源不明確，但分子聚類將它們與相應的實線部分聚為一個類群的材料；沁源母雞嘴、黃軟谷、日本60日、硬穗谷、黑枝谷、系譜丟失I型和系譜丟失II型代表育種材料不同母本的來源。圖4-1、4_2和4-3是111份谷子育種材料的細胞質(zhì)來源的分子聚類圖的三個組成部分，三者按順序拼接在一起即得分子聚類圖全圖；圖中，0. 55,0. 66,0. 78,0. 89、I. 00為遺傳相似系數(shù)；L代表對進化樹進行縱切的特定遺傳相似系數(shù)0. 74 ;B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7表示在特定遺傳相似系數(shù)0. 74下對進 化樹縱切后形成的7個分子類群。圖5是谷子育種材料細胞質(zhì)類型劃分中，BI分子類群和沁源母雞嘴母本衍生系統(tǒng)對應，定位Q型；B2分子類群和黃軟谷母本衍生系統(tǒng)對應，定位H型；B3分子類群和日本60日母本衍生系統(tǒng)對應，定位R型；B4分子類群和硬穗谷母本衍生系統(tǒng)對應，定位Y型；B5分子類群對應的母本衍生系統(tǒng)系譜丟失，定位M I型；B6分子類群和黑枝谷母本衍生系統(tǒng)對應，定位S型；B7分子類群對應的母本衍生系統(tǒng)系譜丟失，定位M II型；a對應圖4-1，b對應圖4-2，c對應圖4_3 ;d對應圖3-1，e對應圖3-2，f對應圖3-3。下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例中所用試劑如無特別說明均購自生工生物工程上海有限公司，所用線粒體特異引物由生工生物工程上海有限公司合成，所用NTSYS-pc2. I軟件由State Universityof New York, Stony Brook研制,所用111份谷子育種材料來自我國華北夏谷生態(tài)區(qū)、西北春谷生態(tài)區(qū)、東北春谷生態(tài)區(qū)的河北、河南、山東、遼寧、吉林、山西、內(nèi)蒙、陜西8個省區(qū)(詳見表I)。表I 111份谷子育種材料的一覽表
權利要求
1.一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于包括如下步驟(1)細胞質(zhì)來源進化樹的構建；(2)母本衍生進化圖的構建；(3)特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類；(4)谷子育種材料細胞質(zhì)類型的確定。
2.根據(jù)權利要求I一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(I)所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建包括如下步驟 ①葉片組織的培養(yǎng)與獲取將谷子育種材料的種子種于育苗盤中獲得谷子幼苗，于4葉期分別剪取育種材料的葉片組織； ②全基因組DNA的提取采用CTAB法提取步驟①中葉片組織的全基因組DNA； ③PCR擴增采用20Ul反應體系，利用線粒體特異引物對步驟②提取的基因組DNA進行37個反應循環(huán)PCR擴增； ④多態(tài)性檢測利用凝膠電泳法對步驟③中線粒體的PCR擴增產(chǎn)物進行多態(tài)性檢測； ⑤細胞質(zhì)來源進化樹的生成對步驟④中電泳圖譜上清晰且可重復出現(xiàn)的條帶記為“ I ”，同一位置沒有出現(xiàn)的帶記為“0”，生成由“ I ”和“0”組成的原始矩陣，用NTSYS-pC2. I軟件進行數(shù)據(jù)分析，用SAHN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，生成細胞質(zhì)來源的進化樹。
3.根據(jù)權利要求I一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(2)所述的母本衍生進化圖的構建為利用系譜追蹤法將谷子育種材料按權利要求2中所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建中所構建進化樹的排列順序進行縱向排列，通過逐代向上追蹤育種材料的母本，直到追蹤到農(nóng)家品種為止，依據(jù)系譜將同一母本衍生的育種材料按照衍生關系逐步連接起來，形成母本衍生進化圖。
4.根據(jù)權利要求I的一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(3)所述的特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類為將權利要求3中所述的母本衍生進化圖的構建中所構建的谷子育種材料的母本衍生進化圖與權利要求2中所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建中所構建的進化樹相結合，并進行比較分析，確定基本能將同一母本衍生系統(tǒng)聚為一個分枝的特定遺傳相似系數(shù)，在該遺傳相似系數(shù)下對權利要求2中所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建中所構建的進化樹進行縱切，將谷子育種材料進行胞質(zhì)來源的分子聚類，分子聚類中每個分枝代表一個胞質(zhì)類群。
5.根據(jù)權利要求I一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(4)所述的谷子育種材料細胞質(zhì)類型的確定為將權利要求4中所述的特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類中所形成的分子聚類圖與權利要求3中所述的母本衍生進化圖的構建中所構建的谷子育種材料的母本衍生進化圖相結合，將胞質(zhì)來源分子聚類圖中的每個分枝與對應的母本衍生系統(tǒng)逐一進行對比，確定每個類群材料的細胞質(zhì)類型，完成對谷子育種材料細胞質(zhì)類型進行劃分。
6.根據(jù)權利要求2—種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(I)所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建中步驟①中所述的谷子育種材料為延谷12、長高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、壩谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、鄭9188、大同28、鐵8240、錦谷12、錦谷14、朝438、公谷68、鐵487、鐵谷6、復532、晉汾I、滄156、濟谷13、長高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29綠、安2491、興谷88、晉15、晉汾3、滄·344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷 12、K523、L70、鐵大粒黃、K359、朝谷 13、谷 83、衡 968、濟 9403、冀谷 27、濟 9409、魯谷 10、濟谷 12、濟谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安 4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、長高 146A、石 207226、石.206058、公谷 65X164,203184 早、安 2367、石 202242、谷 57、冀谷 24、谷豐 2 號、石 06-439、谷38、小香米、冀谷19、K1130、壩谷214-2、谷11、K1011、長農(nóng)36、冀谷28、長農(nóng)35、晉谷35、太選5號、太選2號、晉谷21、谷95、晉谷29、朝谷14、K660、美國大頭、谷10、K546、朝綠-I、晉谷16、石98622和石97672共111份。
7.根據(jù)權利要求3—種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(2)所述的母本衍生進化圖的構建中111份谷子育種材料中12份來源于同一母本材料沁源母雞嘴、13份材料來源于同一母本材料黃軟谷、63份材料來源于同一母本材料日本60、6份材料來源于同一母本材料硬穗谷、5份材料來源于同一母本材料黑枝谷，12份材料未追蹤到其母本，便于研究命名為系譜丟失I型和系譜丟失II型。
8.根據(jù)權利要求4一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(3)所述的特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類中特定遺傳相似系數(shù)為0. 74，在該遺傳相似系數(shù)下對權利要求2、6中所述的細胞質(zhì)來源進化樹的構建中所構建的進化樹進行縱切，將其縱切為7個分枝，每個分枝代表I個胞質(zhì)來源的分子類群，這樣將胞質(zhì)來源進化樹縱切為7個類群，縱切結果與母本衍生進化圖一致性達98. 2%。
9.根據(jù)權利要求5—種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于步驟(4)所述的谷子育種材料細胞質(zhì)類型的確定中將權利要求4、8中所述的特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類中構建的分子聚類圖與權利要求3、7中所述的母本衍生進化圖的構建中所構建的母本衍生進化圖相結合，進行逐一對比，確定各類群材料的胞質(zhì)類型，分別為來源于“泌園母雞嘴”的Q型，來源于“日本60日”的R型，來源于“黃軟谷”的H型，來源于“硬穗谷”的Y型，來源于“黑枝谷”的S型，還有兩種由于系譜丟失，追蹤不到母本來源，分別定名為M I型和M II型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷子育種材料細胞質(zhì)類型的劃分方法，其特征在于包括以下步驟(1)細胞質(zhì)來源進化樹的構建；(2)母本衍生進化圖的構建；(3)特定遺傳相似系數(shù)的確定及細胞質(zhì)來源的分子聚類；(4)谷子育種材料細胞質(zhì)類型的確定。本發(fā)明為培育不同細胞質(zhì)類型的不育系和雜交種奠定了基礎，為創(chuàng)制不同細胞質(zhì)類型的谷子不育系，培育不同細胞質(zhì)類型的谷子雜交種奠定基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102750458SQ20121020360
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權日2012年6月20日
發(fā)明者劉正理, 夏雪巖, 師志剛, 張婷, 張梅申, 張永信, 李偉, 程汝宏 申請人:河北省農(nóng)林科學院谷子研究所