專利名稱：一種海水中四環(huán)素抗性基因的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水環(huán)境污染物的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海水中新型污染物-抗生素抗性基因tet的檢測方法。
背景技術(shù)：
醫(yī)療和養(yǎng)殖中抗生素的大量使用，使抗生素通過生活污水和養(yǎng)殖廢水途徑進入水環(huán)境，環(huán)境中生物或細菌因此產(chǎn)生耐藥性基因。耐藥基因的傳播導(dǎo)致耐藥性可能從非致病菌轉(zhuǎn)移到致病細菌，并進一步傳播、發(fā)展成生態(tài)層次上的耐藥性，而使沒有接觸到抗生素的個體也產(chǎn)生耐藥性。Pruden等人(2006)首先將抗生素抗性基因
(AntibioticResistanceGenes, ARGs)作為一種新型“環(huán)境污染物”提出。由于ARGs在生物體內(nèi)可能長久而持續(xù)地傳播，即使攜帶ARGs的細胞被殺滅或消亡，它釋放到環(huán)境中的DNA因受脫氧核糖核酸酶的保護而仍然存在，并最終可能轉(zhuǎn)移給其它細胞，因此，ARGs在環(huán)境中的持久性殘留、菌群間的遷移、轉(zhuǎn)化和傳播，比抗生素殘留本身對環(huán)境生態(tài)的危害更大。近海環(huán)境中城市污水和養(yǎng)殖用水的大量排入，使抗性基因容易擴散進入海水環(huán)境并傳播給海水環(huán)境中微生物，獲得了耐藥性的微生物可能通過接觸、食物等多種方式傳播進入人體，對人類健康和水生生態(tài)系統(tǒng)安全構(gòu)成巨大威脅。但迄今為止，抗生素抗性基因作為一類新型環(huán)境污染物在我國海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中還尚未將引起足夠重視，有關(guān)海水環(huán)境中的抗生素抗性基因污染檢測方法極為薄弱。四環(huán)素類抗生素是一種被廣泛用于人和動物的的細菌性感染的抗生素，此外，還被大量用作促生長劑投喂給動物，因而四環(huán)素抗性基因(tet)是水體中抗生素抗性基因污染的一種重要種類，但是目前海水中四環(huán)素抗性基因(tet)檢測還無系統(tǒng)成熟的方法。為保護海洋生態(tài)系統(tǒng)和保障人類自身健康，建立海水中四環(huán)素抗性基因(tet)的檢測方法，對海洋環(huán)境新型污染物ARGs進行監(jiān)測是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海水中新型污染物-抗生素抗性基因tet的檢測方法，通過PCR方法來檢測，其特征在于通過以下步驟來實現(xiàn)( I)海水樣品的采集及處理以中速定量濾紙(孔徑30 50 μ m)抽濾待測海水樣品1L，除去海水中較大顆粒雜質(zhì)，所得濾液用O. 22 μ m濾膜過濾，保留O. 22 μ m孔徑濾膜作為待測樣品。(2 )提取水樣中DNA濾膜剪碎，置于I. 5ml離心管，加入SDS裂解液(5. 5% SDS, O. 125mg/ml蛋白酶K)60°C溫育2小時，以酚-氯仿-異戊醇溶液(25:24: l，v/v/v)抽提兩遍，二倍體積乙醇加十分之一體積醋酸鈉_20°C沉淀I小時，離心，TE溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?3) PCR擴增區(qū)域與引物序列PCR擴增檢測選取決定四環(huán)素類抗藥機制的兩類主要蛋白-外輸泵蛋白和核糖體保護蛋白基因。引物tet-AF:GCGCTNTATGCGTTGATGCA和tet-AR:ACAGCCCGTCAGGAAATT擴增四環(huán)素抗性基因-外輸?shù)鞍谆騮et (A)的387bp序列；弓丨物 tet-MF: ACAGAAAGCTTATTATATAAC 和 tet_MR: TGGCGTGTCTATGATGTTCAC 擴增四環(huán)素抗性基因-核糖體保護蛋白基因tet (M)的17Ibp序列。(4) PCR擴增體系與條件PCR反應(yīng)體系為25 μ L的反應(yīng)體系包含50ng的模板，O. 2mMdNTP,正反向引物分別O. 4μΜ, IUTaq 酶，2. 5μ 10 Xbuffer0 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55。。復(fù)性30s，72°C延伸30s，進行30個循環(huán)；4°C保溫。(5)結(jié)果檢測PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，tet (A)弓丨物對和tet (M)弓丨物對分別產(chǎn)生
387bp和171bp清晰條帶，如圖I所示，四環(huán)素抗性基因得到陽性擴增，說明海水中具有抗四環(huán)素抗性基因污染。


圖I為四環(huán)素抗性基因PCR產(chǎn)物電泳圖，M :分子量標(biāo)準(zhǔn)；I tet(A) ；2 tet (M) ；N 陰性對照；圖2為四環(huán)素抗性基因tet (A) PCR電泳結(jié)果，M :分子量標(biāo)準(zhǔn)；S1_S5 :水樣S1-S5 ；N :陰性對照；圖3為四環(huán)素抗性基因tet (M) PCR電泳結(jié)果，M :分子量標(biāo)準(zhǔn)；S1_S5 :水樣S1-S5 ；N :陰性對照。
權(quán)利要求
1.一種海水中四環(huán)素抗性基因tet的檢測方法，其特征在于，取IL待測海水樣品，兩次抽濾，采用SDS法提取水樣中DNA，采用PCR法對外輸泵蛋白tet (A)和核糖體保護蛋白基因tet (M)進行檢測，檢測得到387bp和171bp的擴增帶譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述兩次抽濾是以孔徑30 50μπι的中速定量濾紙抽濾待測海水樣品1L，除去海水中較大顆粒雜質(zhì),所得濾液用O. 22 μ m濾膜過濾，保留O. 22um孔徑濾膜作為待測樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述采用SDS法提取水樣中DNA的方法為濾膜剪碎，置于I. 5ml離心管，加入SDS裂解液60°C溫育2小時，以酚-氯仿-異戊醇溶液抽提兩遍，二倍體積乙醇加十分之一體積醋酸鈉-20°C沉淀I小時，離心，TE溶解，-20°C保存?zhèn)溆?，其中SDS裂解液含有5. 5% SDS (W/V)和O. 125mg/ml蛋白酶K，酚-氯仿-異戊醇溶液中酚氯仿異戊醇的體積比為25:24:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述采用PCR法對外輸泵蛋白tet (A)和核糖體保護蛋白基因tet(M)進行檢測時使用的引物為 弓丨物tet-AF:核苷酸序列為GCGCTNTATGCGTTGATGCA和引物tet_AR:核苷酸序列為ACAGCCCGTCAGGAAATT擴增四環(huán)素抗性基因-外輸?shù)鞍谆騮et (A)的387bp序列；引物tet-MF:核苷酸序列為ACAGAAAGCTTATTATATAAC和tet_MR:核苷酸序列為TGGCGTGTCTATGATGTTCAC擴增四環(huán)素抗性基因-核糖體保護蛋白基因tet (M)的171bp序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR的反應(yīng)體系為25μL的反應(yīng)體系，具體包含50ng的模板，O. 2mM dNTP，正反向引物分別O. 4μΜ，IU Taq酶，2. 5μ IOXbuffer ;反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，55°C復(fù)性 30s，72°C 延伸 30s，進行30個循環(huán)，4°C保溫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海水中四環(huán)素抗性基因的檢測方法，步驟為取1L海水樣品，分別以中速定量濾紙和0.22μm 微孔濾膜抽濾，留取0.22μm 微孔濾膜作為檢測樣本， SDS法提取DNA，采用PCR法對外輸泵蛋白tet(A)和核糖體保護蛋白基因tet(M)進行檢測，引物序列分別為tet-AF: GCGCTNTATGCGTTGATGCA和tet-AR: ACAGCCCGTCAGGAAATT； tet-MF: ACAGAAAGCTTATTATATAAC和tet-MR: TGGCGTGTCTATGATGTTCAC，得到387bp和171bp的擴增帶譜。檢測結(jié)果電泳陽性，說明海水中含有四環(huán)素抗性基因。本方法為海洋環(huán)境新型污染物ARGs的檢測提供了方法。
文檔編號C12Q1/68GK102876772SQ201210205120
公開日2013年1月16日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者任利華, 孫國華, 劉愛英, 劉麗娟, 姜向陽, 宋秀凱, 姜會超 申請人:山東省海洋水產(chǎn)研究所