專利名稱：：鼠傷寒沙門菌X3306lux及其在活體成像中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及鼠傷寒沙門菌X33061UX及其在活體成像中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鼠傷寒沙門菌{Salmonella是一種重要的人畜共患病原菌，主要經(jīng)水和食物傳播，可引起食物中毒、胃腸炎等腸道傳染病，其感染發(fā)病率居沙門菌感染的首位。X3306是攜帶毒力質(zhì)粒pStSRIOO的鼠傷寒沙門菌強毒株，可作為標準毒株，應(yīng)用于鼠傷寒沙門菌致病機制的研究。近年來，活體動物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)以其操作簡便及直觀性在生命科學(xué)研究中得以不斷發(fā)展。這種成像技術(shù)可以直接實時觀察標記的基因及細胞在活體動物體內(nèi)的活動及反應(yīng)。利用光學(xué)標記的細菌建立動物模型可以實時動態(tài)追蹤病原菌在動物活體內(nèi)的感染過程，深入研究病原菌致病機制，進行藥物研究及篩選等。主要采用熒光(fluorescence)與生物發(fā)光(bioluminescence)兩種技術(shù)。熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)后產(chǎn)生發(fā)射光。熒光技術(shù)操作簡便，信號較強，但應(yīng)用于體內(nèi)試驗時在受到激發(fā)光激發(fā)時生物體很多物質(zhì)都會產(chǎn)生熒光，如皮膚、毛發(fā)和各種組織及食物等。特別是當(dāng)被標記的靶點深藏于組織內(nèi)部需要較高能量的激發(fā)光時也產(chǎn)生很強的非特異性熒光，且病原菌在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，熒光的激發(fā)光需要穿過組織到達靶點，發(fā)射光需要從體內(nèi)出來，路徑較長。信號水平取決于激發(fā)光的強度、發(fā)光細胞的數(shù)量、靶點的深度、光線穿過的組織對其的吸收及散射等因素，使得熒光強度很難定量。生物發(fā)光是用熒光素酶(Iuciferase)基因標記。以熒光素酶作為體內(nèi)報告源的生物發(fā)光是以酶和底物的特異作用而發(fā)光，特異性極強，因動物本身沒有任何自發(fā)光，使得生物發(fā)光具有極低的背景，極高的信噪比。生物發(fā)光成像相對于熒光成像，其最大的特點就是體內(nèi)檢測的高靈敏度。因此，生物發(fā)光技術(shù)成為目前研究的熱點。細菌操縱子由熒光素酶基因和其底物合成酶基因組成，帶有這種操縱子的細菌會持續(xù)發(fā)光不需要外源性底物。近年來研究者們陸續(xù)將其克隆至多種載體導(dǎo)入病原菌中，應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)和小動物成像系統(tǒng)監(jiān)測病原菌感染過程。但以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的生物發(fā)光技術(shù)在無抗生素選擇下不穩(wěn)定，不能用于體內(nèi)的長期研究。對實驗小鼠注射抗生素來篩選攜帶完整發(fā)光質(zhì)粒的沙門菌，會造成小鼠的耐藥性，且會在某種程度上干擾實驗結(jié)果。又因質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同，單細胞發(fā)光強度不穩(wěn)定，無法以發(fā)光強度來定量檢測病原菌。2010年，KevinHowe構(gòu)建質(zhì)粒pBEN276,利用該質(zhì)粒可將Zm操縱子克隆至細菌染色體(圖I),其生物發(fā)光信號可以用于精確定量，本發(fā)明由此在鼠傷寒沙門菌X3306基礎(chǔ)上構(gòu)建了具有穩(wěn)定生物發(fā)光性能的菌株X33061ux。
發(fā)明內(nèi)容解決的技術(shù)問題本發(fā)明針對熒光標記的體內(nèi)檢測特異性低，背景高，難定量等缺陷，及以往以基于質(zhì)粒的生物發(fā)光檢測需外加篩選壓力和底物，且難以定量等不足，提供了一種可以穩(wěn)定發(fā)光的鼠傷寒沙門菌X33061ux及其在活體成像中的應(yīng)用。技術(shù)方案鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)X3306lux,該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.5895。鼠傷寒沙門菌typhimurium)X3306Iux在活體成像中的應(yīng)用。鼠傷寒沙門菌(5^7^9/7(9773皿η·")X3306下文簡稱X3306;鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)X33O6Iux下文簡稱X33O6Iux0有益效果該鼠傷寒沙門菌具有穩(wěn)定的生物發(fā)光性能，彌補了生物熒光的細菌檢測需激發(fā)光源且在體內(nèi)特異性低，背景高，難定量等缺陷。經(jīng)位點特異性重組，將管家基因E.coli/rr啟動子和操縱子插入宿主菌染色體中穩(wěn)定表達(同時插入位點不破壞基因組基因功能，對細菌無不利影響)。操縱子在其上游連接的管家基因E.co7i/rr啟動子的調(diào)控下，組成性表達熒光素酶和底物，無需外加篩選壓力和底物維持細菌發(fā)光。并通過實驗檢測到細菌的數(shù)量與其發(fā)光強度成正比，且在小鼠活體內(nèi)能持續(xù)檢測到細菌的生物發(fā)光。彌補了以往質(zhì)粒標記的生物發(fā)光細菌需外加篩選壓力和底物，影響發(fā)光檢測，且單位細胞發(fā)光量不穩(wěn)定等不足之處。熒光酶基因插入染色體中穩(wěn)定表達，單位細胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定。加上生物發(fā)光技術(shù)極高的特異性和信噪比，即便標記細胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，亦可從動物體表的信號水平直接得出發(fā)光細胞的相對數(shù)量?？蓮V泛應(yīng)用于體外細胞感染模型和體內(nèi)實驗動物模型的建立。結(jié)合利用活體成像儀器可實時動態(tài)的持續(xù)監(jiān)測鼠傷寒沙門菌在小鼠活體內(nèi)的入侵、增殖及擴散情況。為鼠傷寒沙門菌及傷寒沙門菌致病機制的深入研究，藥物研究和篩選及相關(guān)疾病防治策略的研究等提供便利的工具。圖I為pBEN276質(zhì)粒圖譜，tnsABCD為編碼Tn7轉(zhuǎn)座子的基因。操縱子luxCDABE編碼熒光素酶和底物，引入多克隆酶切位點Xhol和Notl，將其連接于Tn7轉(zhuǎn)座子側(cè)翼。Lux操縱子3’端連接Ε.coli管家基因frr的啟動子，啟動Zm操縱子的組成性表達。圖2為菌落生物發(fā)光檢測結(jié)果(I和2依次為X33061ux單菌落在whitelight和luminescence條件下成像，3和4依次為X3306單菌落在whitelight和luminescence條件下成像)。圖3為菌液生物發(fā)光檢測結(jié)果(1、2:whitelight模式成像X33061ux;3:whitelight模式成像X3306;4、5:luminescence模式成像X33061ux;6:luminescence模式成像X3306)。圖4為X33061ux發(fā)光性能穩(wěn)定性檢測結(jié)果(光強與在無選擇壓力條件下傳代天數(shù)的關(guān)系)圖5為穩(wěn)定發(fā)光菌在活體內(nèi)信號檢測結(jié)果(1，2，3依次為將感染X33061UX的小鼠于whitelight模式成像，luminescence模式成像和merge圖像)。圖6為光子數(shù)與細菌數(shù)關(guān)系的發(fā)光檢測圖(I飛倍比稀釋X33061ux菌液；6X3306陰性對照)。圖7為光子數(shù)與細菌數(shù)關(guān)系圖(I5:10倍稀釋X33061ux菌液；6:X3306陰性對照)。具體實施例方式實施例I菌株具體構(gòu)建及鑒定I、材料準備I.I質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒PBEN276由法國自然資源研究所動物傳染病和公共健康病原菌研究實驗室PierreGermon教授惠贈。KevinHowe,AttilaKarsi,PierreGermon,et.al.DevelopmentofstablereportersystemcloningluxCDABEgenesintochromosomeofSalmonellaentericaserotypesusingTn7transposon[J].BMCMicrobiology2010,10:197鼠傷寒沙門菌typhimurium')X3306由美國亞利桑那州立大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院ROYCURTISSIII教授惠贈。HIDEN0RIMATSUI,CHRISTOPHERM.BACOT,WENDYA.VirulencePlasmid-BornespvBandspvCGenesCanReplacethe90-KilobasePlasmidinConferringVirulencetoSalmonellaentericaSerovarTyphimuriuminSubcutaneouslyInoculatedMice[J].Journalofbacteriology,2001，15(183):4652-4658.1.2儀器與試劑儀器電轉(zhuǎn)儀(Bio-RadGenePulserIIsystem)為美國Bio-Rad產(chǎn)品；高速冷凍離心機Beckaman公司產(chǎn)品；柯達多模式小動物活體成像系統(tǒng)DXS4000pro；試劑質(zhì)粒提取試劑盒QIAGENPlasmidMaxKit購自Qiagen公司。2方法2.1目的菌株的轉(zhuǎn)化2.I.I感受態(tài)細胞制備平板劃線法接種鼠傷寒沙門菌X3306至LB固體培養(yǎng)基，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取個體圓潤有光澤的單菌落接種到3mLLB液體培養(yǎng)基，37°C，200r/min培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物以1:100的比例接種到IOOmL生長培養(yǎng)基中，37°C，250r/min培養(yǎng)至0D600為0.3時取出培養(yǎng)物，立即冰浴30min。4°C,4000r/min離心lOmin，收集菌體。用4°C預(yù)冷的超純水洗三遍，以50μL預(yù)冷的超純水重懸，冰上放置待用。2.I.2電轉(zhuǎn)化方案將質(zhì)粒PBEN276加入到50μL感受態(tài)細胞中，混合均勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的Imm電極杯。再調(diào)節(jié)電壓、電阻及電容參數(shù)為2.5kV，400Ω，50μF，電擊后迅速加入30°C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基lmL。將電擊后的菌液轉(zhuǎn)移至試管，37°C，100r/min培養(yǎng)f3h。取100μL涂布于含40μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜。2.2轉(zhuǎn)化子鑒定陽性克隆從含50μg/mLAmp的LB瓊脂平板上挑出接種至2mL含50μg/mLAmp液體LB培養(yǎng)基30°C，200rpm培養(yǎng)1416h，將菌液轉(zhuǎn)移至24孔板檢測生物發(fā)光。同時提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和PCR鑒定，并接種于SS固體培養(yǎng)基進行鼠傷寒沙門菌生化鑒定。2.3誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子重組將上述經(jīng)鑒定的轉(zhuǎn)化子接種至含O.l%wt阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基30°C，200rpm培養(yǎng)1416h。誘導(dǎo)后的菌液于無抗生素LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，42°C培養(yǎng)1416h。各挑選6個單克隆接種于液體LB培養(yǎng)基42°C，200rpm培養(yǎng)1416h，菌液轉(zhuǎn)移至24孔板檢測生物發(fā)光。2.4篩選穩(wěn)定表達Lux操縱子的克隆挑選出重組后能發(fā)光的菌液于含50μg/mLAmp固體LB培養(yǎng)基上劃線，同時在無抗生素培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代37°C培養(yǎng)，定量檢測細菌發(fā)光情況。篩選出無抗生素抗性且多次傳代能穩(wěn)定發(fā)光的菌落。菌株的培養(yǎng)增殖方法鼠傷寒沙門菌X3306Iux為兼性厭氧菌，在普通LB培養(yǎng)基中可生長，培養(yǎng)基成分蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶于IL水，pH=7±0.2，培養(yǎng)溫度37°C條件下可穩(wěn)定增殖。菌種形態(tài)與生化特性檢測液體LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過夜細菌均勻渾濁。取一環(huán)菌液適當(dāng)稀釋后革蘭染色鏡檢，該菌為革蘭陰性桿菌。用固體LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)18h，形成乳白色菌落，表面光滑，邊緣整齊，直徑f3mm。SS培養(yǎng)基37V培養(yǎng)1824h上菌落形態(tài)為中等大小、圓形、光滑、乳白色、菌落中心黑色，硫化氫陽性。挑取單菌落接種于生化管37°C培養(yǎng)過夜，檢測生化特性，該菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、麥芽糖。挑取單菌落接種于半固體瓊脂，37°C培養(yǎng)18^24h，細菌呈羽毛狀生長，動力陽性。單菌落生物發(fā)光檢測分區(qū)劃線法將鼠傷寒沙門菌X33061ux接種于LB平板，37°C，培養(yǎng)1416h。待長出單菌落后，將平板置于多模式活體成像儀中進行生物發(fā)光檢測。在生物發(fā)光檢測模式下，可見發(fā)光菌單菌落(鼠傷寒沙門菌X33061ux)，而普通細菌單菌落(鼠傷寒沙門菌X3306)不可見(圖2)。菌液生物發(fā)光檢測單菌落接種至液體LB培養(yǎng)基37°C，200rpm培養(yǎng)1416h，菌液轉(zhuǎn)移至24孔板檢測生物發(fā)光。生物發(fā)光模式下只可見發(fā)光菌(鼠傷寒沙門菌X33061ux)，普通細菌(鼠傷寒沙門菌X3306)不可見(圖3)。生物發(fā)光穩(wěn)定性檢測將X33061uX單菌落接種至無抗生素液體LB培養(yǎng)基，每天傳代培養(yǎng)至12天，每3天收集菌液，以O(shè)D6tltl為標準稀釋至相同體積相同濃度，在活體成像儀中進行生物發(fā)光檢測，記錄發(fā)光強度。X33061ux具有穩(wěn)定的生物發(fā)光性能(如圖4)。實施例2鼠傷寒沙門菌iSalmorwllaX33061ux活體成像1.細菌培養(yǎng)從固體LB瓊脂平板上挑選單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)1416h至對數(shù)生長期。4000rpm，4°C，10min離心收集菌體，經(jīng)生理鹽水洗兩遍(4000rpm，4°C，lOmin)后，用適量生理鹽水重懸，測0D600計算細菌濃度。用生理鹽水梯度稀釋待用。2.小鼠感染方法(腹腔注射或口飼感染)2.I腹腔注射感染選取8-12周BALB/C或C57BL小鼠，以50μL濃度105CFU/mL的菌液腹腔注射感染小鼠。2.2.口飼感染8-12周BALB/C或C57BL小鼠禁食禁水6h后，以50μL10%wt的NaHCO3灌胃，中和胃酸，以體積O.2mL濃度107CFU/mL的菌液灌胃感染小鼠，半小時后恢復(fù)喂食。3.活體成像方法以10%wt水合氯醛O.ImL經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，待麻醉生效(約30min)后利用小動物成像儀成像。首先在白光(whitelight)條件下成像，只可見小鼠。然后在生物發(fā)光(luminescence)條件下成像,只可見發(fā)光菌。將兩次成像結(jié)果歸并(merge),可見發(fā)光菌感染后播散到的部位(圖5)。經(jīng)光子量分析可計算發(fā)光菌在體內(nèi)的增殖情況(圖6，7)。權(quán)利要求1.鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)X33061ux，該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.5895。2.鼠傷寒沙門菌typhimurium)X33061ux在活體成像中的應(yīng)用。全文摘要鼠傷寒沙門菌X3306lux及其在活體成像中的應(yīng)用，該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.5895。鼠傷寒沙門菌X3306是攜帶毒力質(zhì)粒pStSR100的強毒株，可作為標準毒株，應(yīng)用于鼠傷寒沙門菌致病機制的研究。X3306lux是在X3306基礎(chǔ)上構(gòu)建的具有穩(wěn)定生物發(fā)光性能的菌株。經(jīng)位點特異性重組，將管家基因E.colifrr啟動子和Lux操縱子插入X3306染色體中穩(wěn)定表達(同時插入位點不破壞基因組基因功能，對細菌無不利影響)。Lux操縱子在其上游連接的管家基因E.colifrr啟動子的調(diào)控下，組成性表達熒光素酶和底物，無需外加篩選壓力和底物維持細菌發(fā)光。文檔編號C12N1/20GK102757911SQ20121020624公開日2012年10月31日申請日期2012年6月21日優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日發(fā)明者儲元元,葉穎,李嫄淵,黃瑞申請人:蘇州大學(xué)