專利名稱:一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種檢測方法,尤其是一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的腫瘤用藥個體化指導的檢測方法。
背景技術:
目前經(jīng)常應用的有實時熒光定量PCR、免疫PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等,都是針對特異性靶基因進行檢測。其中,熒光定量PCR檢測方法最為成熟。熒光定量PCR技術的優(yōu)點是靈敏性高,并可精確定量,在對EGFR,BRAF, KRAS等的檢測中都取得了良好效果。利用特異引物對突變靶序列進行高精準PCR擴增放大,并利用一 種新型探針在實時熒光定量PCR平臺上實現(xiàn)對樣品DNA中突變的檢測,具有很高的特異性和敏感度。其中目前在腫瘤個體化分子診斷領域最重要的EGFR、KRAS、BRAF三種基因突變檢測試劑產(chǎn)品已獲得SFDA《醫(yī)療器械注冊證》和歐盟CE認證。熒光定量PCR的缺點通量低,一次只能檢測一個基因,如需要檢測多種相關基因突變,SNP,表達情況,就需要多臺PCR儀同時工作,效率低,周期長;成本相對較高因一次只能檢測一個基因位點,當一個樣品同時需要檢測多種腫瘤相關基因時,必須一個一個檢測,成本相對增高;不適用于檢測固定包埋后的病理組織,但患者可供的多數(shù)是固定后的組織;只能設定一個內(nèi)參基因(管家基因),但腫瘤組織的管家基因有別于正常組織,需要一組管家基因作內(nèi)參;只能同步檢測最多三種基因,但個體化治療需要同步檢測十幾種甚至更多的基因。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的腫瘤用藥個體化指導的檢測方法。本發(fā)明采用如下技術方案一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,包括如下步驟(I)采集患者樣品,并提取核酸;(2)以患者核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄;(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應;(4)以毛細電泳的方法分離樣品。優(yōu)選地,所述步驟(I)中的患者樣品包括新鮮、冰凍腫瘤組織等等。優(yōu)選地,所述步驟(2)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。優(yōu)選地,所述步驟(2)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、95°C、4°C。優(yōu)選地,所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環(huán)反應的子步驟。優(yōu)選地,所述步驟(3)的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為95°C、94°C、55°C、70°C、
4。。。本發(fā)明的有益效果為1.靈敏度高、重復性好采用激光誘導熒光-PMT,具有超高靈敏度。
2.準確性強采用毛細管電泳對PCR產(chǎn)物進行分離檢測,可將非特異性擴增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴增產(chǎn)物分離,最大程度降低假陽性。3.高通量本系統(tǒng)采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術,實現(xiàn)單個反應檢測30-40個位點,可同時做192個反應(如192個患者樣品,每個樣品檢測11個相關基因),本方法可一次性給出準確報告,避免漏檢。4.精確定量可精確定量基因突變,SNP,表達拷貝數(shù)。5.靈活性強可隨時根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因,例如新發(fā)現(xiàn)的靶向位點,可立即設計特異性引物,將其放入“腫瘤個體化治療用藥指導多重基因檢測方案”中去。
6.成本低每個樣品的檢測成本少于Y50,利于大規(guī)模推廣。
具體實施例方式下面根據(jù)實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。本發(fā)明創(chuàng)立了一種同步檢測11種常見腫瘤個體化治療相關基因的多重基因檢測方案。檢測步驟采集患者樣品(新鮮,冰凍組織等),提取核酸,以患者核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應,最終用毛細電泳方法分離樣品。1.檢測的基因及內(nèi)容包括(表I)。2.建立了可靠地樣品質(zhì)量及反應過程的對照(表I)a)人RNA完整性的對照內(nèi)參確保在檢驗過程中對樣品質(zhì)量的判斷,避免假陰性。b)正常反應對照內(nèi)參監(jiān)控PCR反應效率,避免假陰性。表1:
權利要求
1.一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,包括如下步驟 (1)采集患者樣品,并提取核酸; (2)以患者核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄; (3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應; (4)以毛細電泳的方法分離樣品。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,所述步驟(I)中的患者樣品包括新鮮、冰凍腫瘤組織。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,所述步驟(2)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,所述步驟(2)中的孵育溫度分別為 48 °C、42 °C、95 °C、4°C。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環(huán)反應的子步驟。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,所述步驟(3)的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為95°C、94°C、55°C、70°C、4°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法,包括如下步驟(1)采集患者樣品,并提取核酸;(2)以患者核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄;(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應;(4)以毛細電泳的方法分離樣品。本發(fā)明一種腫瘤用藥個體化指導的檢測方法具有靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102994627SQ20121020658
公開日2013年3月27日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權日2012年6月21日
發(fā)明者吳勇, 李令棟, 南麗, 顏進, 王晴晴 申請人:海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司