專利名稱：一種基于毛細(xì)電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法，尤其是一種靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強、靈活性強、成本低的基于毛細(xì)電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法。
背景技術(shù)：
目前，我國出疹性病原體檢測主要方法有如下幾種1.病原體檢查即直接做影像及活組織檢查 ，或病原體分離培養(yǎng)，之后在顯微鏡、電鏡下觀察，做出診斷。此方法曾一度是微生物檢測的經(jīng)典方法，也是之后各種檢測方法的基礎(chǔ)平臺，得到各個國家的認(rèn)可，在我國一直沿用至今。優(yōu)點成本低；對實驗室硬件要求低。缺點(I)耗時長一般需3-5天或更長。(2)診斷效率低只能單菌純培養(yǎng)；對一些表型特征變異的病原體，用形態(tài)學(xué)經(jīng)驗很難辨別；此外，由于抗生素的濫用，細(xì)菌在檢測過程中生長受到抑制，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。(3)工作量巨大由于對每個抽檢樣品的每種菌都必須進行檢測，工作量非常巨大，特別是部分對培養(yǎng)環(huán)境要求較為苛刻的菌，更加大了檢測的工作量和難度。2.免疫學(xué)檢查應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA):—般先用一抗與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后用通用的酶標(biāo)記的二抗與一抗發(fā)生特異性結(jié)合，再將酶顯色，之后觀察結(jié)果。優(yōu)點⑴樣品通量較高利用96孔酶標(biāo)板，一塊平板可完成多個樣品的檢測；⑵較敏感利用酶聯(lián)的特性，可將原來的抗原信號放大；(3)快捷在時間上，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)檢查法要縮短很多。缺點(1)易出現(xiàn)假陽性由于洗滌和抗原包被的操作，或由于抗原表面決定簇類似而發(fā)生交叉反應(yīng)，故易出現(xiàn)假陽性(2);耗時耗力制作抗體是非常耗時耗力的工作(3);靈敏度不確定實驗的靈敏度取決于抗體的好壞，而每個抗體的好壞不一，質(zhì)量難以控制；(4)無法檢測多變異的病毒變異性較快的病毒，如甲流病毒，存在多種亞型，并且經(jīng)常變異，變異導(dǎo)致抗體失效，無法檢測抗原，如禽流感病毒和豬流感病毒等。3.分子生物學(xué)-PCR檢測方法。目前經(jīng)常應(yīng)用的有實時熒光定量PCR、免疫PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等，都是針對病原體的特異性靶基因進行檢測。其中，熒光定量PCR檢測方法最為成熟。熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點靈敏性高，并可精確定量，在對李氏桿菌、沙門氏菌、肉毒桿菌、大腸桿菌等的檢測中都取得了良好效果。2004年，中國發(fā)布了實施熒光定量PCR檢測禽流感H7亞型的國家標(biāo)準(zhǔn)。2009年，美國FDA批準(zhǔn)了用熒光定量PCR檢測豬流感HlNl亞型的試劑盒。熒光定量PCR的缺點(I)通量低一次只能檢測一個病原成分，如需要檢測多種病原菌，就需要多臺PCR儀同時工作，效率低，周期長，對大批量的多種病原污染的樣品更是無從下手；(2)成本相對較高因一次只能檢測一個病原體，當(dāng)一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，必須一個一個檢測，成本相對增高。4.分子生物學(xué)-基因芯片法基因芯片是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。優(yōu)點(1)高通量并行檢測當(dāng)一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，一次實驗即可得出全部結(jié)果；(2)操作簡便快速整個檢測只需4-8小時基本可以出結(jié)果。缺點(1)技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜每個樣品需要一個芯片，成本大于YlOOO/樣品，不利于大規(guī)模推廣；探針的合成與固定比較復(fù)雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；(2)不能精確定量，重復(fù)性差；(3)靈敏度較低芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產(chǎn)生二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或由于Tm值不同，而導(dǎo)致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；(4)由于芯片的種類較多，難以制定一個統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強、靈活性強、成本低的基于毛細(xì)電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種基于毛細(xì)電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法，包括如下步驟(I)生產(chǎn)“出疹性病原體多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄；(4)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應(yīng)；(5)以毛細(xì)電泳的方法分離樣
品O優(yōu)選地，所述步驟(I)中的試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄引物管、PCR引物管、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、PCR緩沖液、25mM氯化鎂、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、熒光標(biāo)記物、陽性對照。優(yōu)選地，所述步驟(2)中的患者樣品包括鼻咽拭子、痰液、皰疹液、血液等等。優(yōu)選地，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。優(yōu)選地，所述步驟(3)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、95°C、4°C。優(yōu)選地，所述步驟(4)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環(huán)反應(yīng)的子步驟。優(yōu)選地，所述步驟(4)的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為95°C、94°C、60°C、70°C、
4。。。本發(fā)明的有益效果為1.靈敏度高、重復(fù)性好采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超高靈敏度。2.準(zhǔn)確性強采用毛細(xì)管電泳對PCR產(chǎn)物進行分離檢測，可將非特異性擴增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性。3.高通量本系統(tǒng)采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術(shù)，實現(xiàn)單個反應(yīng)檢測15-40個位點，可同時做192個反應(yīng)(如192個患者樣品，每個樣品檢測14種出診性病原體，23個位點)，一天出結(jié)果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準(zhǔn)確報告，避免漏檢。4.精確定量可精確定量病原體基因拷貝數(shù)。5.靈活性強可隨時根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因。6.成本低每個樣品的檢測成本少于￥50，利于大規(guī)模推廣。
具體實施方式
下面根據(jù)實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。本發(fā)明創(chuàng)立了一種同步檢測十六種常見出疹性病原體、二十二個靶位的多重基因檢測方案。檢測的病毒包括單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2型，水痘-帶狀皰疹病毒，非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒，人類巨細(xì)胞病毒，人類皰疹6型病毒，人類皰疹7型病毒，腸道病毒及其亞型(柯薩奇病毒A16型和腸道病毒71型)，麻疫病毒，風(fēng)疫病毒，細(xì)小病毒B19, 口蹄疫病毒及其亞型(口蹄疫病毒A型、O型、C型、Asia型、SAT1，2，3)，乙型溶血性鏈球菌，肺炎支原體等(表I)。建立了可靠的樣品質(zhì)量及反應(yīng)過程的對照(表I)a)人DNA和人RNA完整性的對照內(nèi)參確保在檢驗過程中對樣品質(zhì)量的判斷，避 免假陰性。b)正常反應(yīng)對照內(nèi)參監(jiān)控PCR反應(yīng)效率，避免假陰性。出疹性病原體多重基因檢測的引物設(shè)計(見表2核苷酸序列)表1.檢測的靶位點
權(quán)利要求
1.一種基于毛細(xì)電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法，包括如下步驟(1)生產(chǎn)“出疹性病原體多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄；(4)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應(yīng)；(5)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述步驟(I)中的試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄引物管、 PCR引物管、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、PCR緩沖液、25mM氯化鎂、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、熒光標(biāo)記物、陽性對照。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述步驟(2)中的患者樣品包括鼻咽拭子、痰液、 皰疹液、血液等等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，所述步驟(3)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、 95。。、4。。。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述步驟(4)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環(huán)反應(yīng)的子步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，所述步驟(4)的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為 95。〇、94。〇、60。〇、70。〇、4。〇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于毛細(xì)電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法，包括如下步驟(1)生產(chǎn)“出疹性病原體多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉(zhuǎn)錄；(4)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應(yīng)；(5)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。本發(fā)明具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強、靈活性強、成本低的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/70GK102994649SQ201210206599
公開日2013年3月27日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者吳勇, 周靜曉, 黃迎彬, 陳燕芬 申請人:海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司