專利名稱：一種提高改良的Shewanella oneidensis MR-1遺傳轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過納米二氧化鈦為介質(zhì),提高外源基因?qū)? one i dens is MR-I遺傳轉(zhuǎn)化的高效改良方法，屬于突變或基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Shewanella (希瓦氏菌)是一種重要的環(huán)境微生物，在自然界，尤其在水環(huán)境有廣泛的分布。Shewanella不僅是一種多功能金屬還原細(xì)菌，以環(huán)境中的金屬氧化物作為電子受體，還能夠利用環(huán)境中很多污染物質(zhì)進(jìn)行厭氧呼吸，包括亞硝酸鹽、亞硫酸鹽等無機(jī)氧化物以及锝、镎、钚、Cr (VI),U (VI)和釩酸鹽等放射性或重金屬化合物等。近些年來的研究 mhewanella菌還能夠?qū)⑷斯と玖献鳛殡娮邮荏w進(jìn)行厭氧脫色降解。由于其代謝多樣性和獨(dú)特的生理生化特性，Shewanella在地質(zhì)的生物礦化、環(huán)境廢水處理、染料降解中都具有重要的應(yīng)用前景，從而受到日益廣泛的關(guān)注。目前，研究人員已經(jīng)對(duì)5X6^3/^773菌的遺傳背景、分子機(jī)理、菌種性狀改良等方面做了大量的基礎(chǔ)研究工作。但是，這些研究均需要涉及到的基因敲除、基因回補(bǔ)以及外源基因重組表達(dá)等基因工程操作。而這些方法通常通過基因接合轉(zhuǎn)移法進(jìn)行。傳統(tǒng)的操作方法多使用萬.coli宿主細(xì)菌攜帶外源基因,通過其與細(xì)胞的結(jié)合轉(zhuǎn)化從而實(shí)現(xiàn)外源載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但是對(duì)轉(zhuǎn)化子的篩選中，發(fā)現(xiàn)這種直接轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化成功率較低。因此，本發(fā)明在傳統(tǒng)的接合轉(zhuǎn)移法的技術(shù)基礎(chǔ)上，通過添加納米二氧化鈦顆粒做介導(dǎo)，使得Shewanella菌的接合轉(zhuǎn)化效率得到大幅提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)傳統(tǒng)Shewanella菌的接合轉(zhuǎn)化方法效率低的問題,通過在轉(zhuǎn)化體系中添加納米二氧化鈦?zhàn)鳛榻橘|(zhì)，建立起一種高效接合轉(zhuǎn)化的改良方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種提高改良的one i dens is MR-I遺傳轉(zhuǎn)化的方法，按照下述步驟進(jìn)行
一、供體菌體菌的制備
(1)配置添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的固體平板酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基，對(duì)攜帶抗Gm表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5的E. coli WM3064進(jìn)行37 0C下過夜培養(yǎng)活化；
(2)挑取(I)中活化菌體所形成的單克隆菌落，接種于添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C、200 rpm過夜培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期；取對(duì)數(shù)期菌液，7000 rpm離心10min，取沉淀，加0. 01 M PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 0)將細(xì)菌重懸液調(diào)成I X IO9 CFU/ml的
山/又o二、受體菌 51 oneidensis MR-1 的制備
(1)配置固體平板LB培養(yǎng)基，對(duì)S.oneidensis MR-I進(jìn)行30 0C下過夜培養(yǎng)；
(2)將活化的菌體接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C、200 rpm過夜培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，取對(duì)數(shù)期菌液，7000 rpm離心10 min，取沉淀，加0. 01 M PBS (pH=7. 0)重懸細(xì)胞，并將細(xì)菌重懸浮液調(diào)成IXlO9 CFU/ml。三、納米二氧化鈦懸浮液的制備
(1)稱取5nm粒徑的納米二氧化鈦，利用無菌超純水將其制備成0. 5 M懸浮液，并充分渦旋混合；
(2)將一定體積的懸浮液放入無菌密封試管中，然后置于超聲波儀中超聲15min備
用；
四、納二米氧化鈦?zhàn)饔糜诩?xì)菌接合轉(zhuǎn)化體系
(1)將供體菌懸浮液和受體菌懸浮液以1:1比例混合，并充分渦旋；
(2)按照體積比為I:9分別取納米二氧化鈦懸浮液，加入混合菌液，使最終納米二氧化·鈦濃度為0. 05 mM，充分渦旋。其中步驟一(I)中所述的配置添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的固體平板酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基中含有酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/l、NaCl 10 g/1，15呢/ml的慶大霉素(Gm)，終濃度為100吒/ml的二氨基庚二酸鹽(DAP)。其中步驟一(2)中所述的添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中其中含有酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/l、NaCl 10 g/1, 15吒/ml的慶大霉素(Gm)，100吒/ml的二氨基庚二酸鹽(DAP)，其余為水。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明具有操作簡單，成本低廉，能夠顯著提高外源基因?qū)οＭ呤暇慕Y(jié)合轉(zhuǎn)化效率，從而使操作者收獲更多的轉(zhuǎn)化子，為希瓦氏的基因敲除、基因回補(bǔ)等相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供更便捷高效的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)。


圖I為納米氧化鈦處理組與同體積水處理空白對(duì)照組對(duì)于供體菌和受體菌接合轉(zhuǎn)化效率的影響對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明處理組轉(zhuǎn)化效率明顯提高了 12. 6倍。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述供體菌萬.coli WM3064是一種分子生物學(xué)常用菌株，由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)武超博士贈(zèng)送，其攜帶的具有Gm抗性的表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5 (該表達(dá)質(zhì)粒購于中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心)由本實(shí)驗(yàn)室自行轉(zhuǎn)化；受體菌5 oneidensis MR-I由美國加利福尼亞大學(xué)尼爾森教授贈(zèng)送。一、(一)Gm抗性的表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5轉(zhuǎn)化入大腸桿菌
(1)取100u I WM3064感受態(tài)細(xì)胞(使用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒提前制備)于冰浴上融化；
(2)加入5ill純pBBRlMCS-5質(zhì)粒，輕輕吹打混勻，冰浴30 min。(3)將菌液放入42 °C水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2 min。(4)加入0.9 ml LB液體(提前37°C預(yù)熱)，于37 °C恒溫?fù)u床上200 rpm, 50 min溫育。(5)將菌液5000 rpm離心5 min，留200 上清將菌體打散，均勻涂布于含含有終濃度為15 l^g/ml Gm和終濃度為100 l^g/ml DAP的瓊脂平板表面(已提前涂布好抗生素，并預(yù)熱)，平板于37°C倒置培養(yǎng)過夜。(6)挑取(5)中過夜的平板上的單克隆至新鮮LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，用高壓滅菌后的用含20%甘油的凍存管-80 °C保存轉(zhuǎn)化后菌液。(上述菌株為細(xì)菌結(jié)合轉(zhuǎn)化中的通用菌株，由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)武超博士贈(zèng)送)
(二)供體菌與受體菌的接合轉(zhuǎn)化
(1)將保存在甘油中的疋coliWM3064劃線于含Gm 15吒/ml和DAP 100吒/ml的LB平板上，37 0C過夜培養(yǎng)培養(yǎng)；
(2)用牙簽挑取活化好的單菌落，接種于50ml LB (含Gm 15吒/ml和DAP 100吒/ml)液體培養(yǎng)基中，37 0C,200 rpm搖至對(duì)數(shù)期，取對(duì)數(shù)期菌液，7000 rpm離心10 min，取沉淀，加PBS將菌體重懸，用分光光度計(jì)將細(xì)菌懸浮液調(diào)成I X IO9 CFU/ ml，待用；
二、受體菌S oneidensis MR-I的制備
(1)配置固體平板LB培養(yǎng)基，對(duì)MR-1進(jìn)行30°C下過夜培養(yǎng)；
(2)將活化的菌體接種于50ml LB液體培養(yǎng)基中，30 °C、200 rpm過夜培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，取對(duì)數(shù)期菌液，7000 rpm離心10 min，取沉淀，加0. 01 M PBS (pH=7. 0)重懸細(xì)胞，并將細(xì)菌重懸浮液調(diào)成I X IO9 CFU/ml。三、納米二氧化鈦懸浮液的制備
(1)稱取0.004g 5 nm粒徑的納米二氧化鈦,利用無菌超純水將其制備成I ml 0. 5M懸浮液，并充分渦旋混合；
(2)將一定體積的懸浮液放入無菌密封試管中，然后置于超聲波儀中超聲15min備
用；
四、納二米氧化鈦?zhàn)饔糜诩?xì)菌接合轉(zhuǎn)化體系
(1)將供體菌懸浮液和受體菌懸浮液以1:1比例混合，并充分渦旋；
(2)分別取100納米二氧化鈦懸浮液,加入900 混合菌液,使最終納米二氧化鈦濃度為0. os禮，充分渦旋；另外將loo m無菌超純水加入900 m混合菌作為對(duì)照組；
(3)將各處理組和對(duì)照組放進(jìn)300C細(xì)菌培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
(4)12h后，將各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組取出，并分別取100耵涂布于含15 l^g/ml Gm的LB平板上，每組三個(gè)重復(fù)。放置于30 °C細(xì)菌培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)。(5) 16^18 h后，待平板上長出直徑約為Imm的單菌落后，進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)(CFU)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，在加入終濃度為0. 05 mM納米二氧化鈦?zhàn)饔糜趦删旌弦汉?，在含Gm的LB平板上的單菌落數(shù)明顯增加(同等稀釋度)。與對(duì)照未加入納米二氧化鈦的轉(zhuǎn)化體系相t匕,每ml混合細(xì)菌懸浮液獲得具有Gm抗性的5 oneidensis MR-I單菌落個(gè)數(shù)增加了 12.6倍(如圖I )，顯示添加納米二氧化鈦能夠顯著增強(qiáng)5 oneidensis MR-I的接合轉(zhuǎn)化效率。
權(quán)利要求
1.一種提高改良的one i dens is MR-I遺傳轉(zhuǎn)化的方法,其特征在于按照下述步驟進(jìn)行 一、供體菌體菌的制備 (1)配置添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的固體平板酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基，對(duì)攜帶抗Gm表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-5的E. coli WM3064進(jìn)行37 0C下過夜培養(yǎng)活化； (2)挑取(I)中活化菌體所形成的單克隆菌落，接種于添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C、200 rpm過夜培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期；取對(duì)數(shù)期菌液，7000 rpm離心10min,取沉淀，加pH=7. 0的0. 01 M PBS將細(xì)菌重懸液調(diào)成I X IO9 CFU/ml的密度； 二、受體菌Soneidensis MR-I的制備 (1)配置固體平板LB培養(yǎng)基，對(duì)5oneidensis MR-I進(jìn)行30 0C下過夜培養(yǎng)； (2)將活化的菌體接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C、200 rpm過夜培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，取對(duì)數(shù)期菌液，7000 rpm離心10 min，取沉淀，加0. 01 M PBS (pH=7. 0)重懸細(xì)胞，并將細(xì)菌重懸浮液調(diào)成I X IO9 CFU/ml ； 三、納米二氧化鈦懸浮液的制備 (1)稱取5nm粒徑的納米二氧化鈦，利用無菌超純水將其制備成0. 5 M懸浮液，并充分渦旋混合； (2)將一定體積的懸浮液放入無菌密封試管中，然后置于超聲波儀中超聲15min備用； 四、納二米氧化鈦?zhàn)饔糜诩?xì)菌接合轉(zhuǎn)化體系 (1)將供體菌懸浮液和受體菌懸浮液以1:1比例混合，并充分渦旋； (2)按照體積比為I:9分別取納米二氧化鈦懸浮液，加入混合菌液，使最終納米二氧化鈦濃度為0. 05 mM，充分渦旋。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高改良的oneidensisMR-I遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于其中步驟一(I)中所述的配置添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的固體平板酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基中含有酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/l> NaCl 10 g/1，15 ^g/ml的慶大霉素，終濃度為100吒/ml的二氨基庚二酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高改良的oneidensisMR-I遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于其中步驟一(2)中所述的添加了慶大霉素和二氨基庚二酸鹽的LB液體培養(yǎng)基中其中含有酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/1、NaCl 10 g/1, 15呢/ml的慶大霉素，100吒/ml的二氨基庚二酸鹽，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明一種提高改良的ShewanellaoneidensisMR-1遺傳轉(zhuǎn)化的方法,屬于突變或基因工程領(lǐng)域。將納米二氧化鈦顆粒添加到外源基因的供體菌EscherichiacoliWM3064和受體菌S.oneidensisMR-1等比例混合的溶液中，靜置培養(yǎng)，能夠有效促進(jìn)該外源基因從供體菌向受體菌的轉(zhuǎn)移，顯著提高外源基因?qū).oneidensisMR-1中遺傳轉(zhuǎn)化效率。該發(fā)明還為納米材料在基因工程領(lǐng)域的新應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)，具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求。
文檔編號(hào)C12N15/87GK102703509SQ20121020850
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者吳勇民, 曹丹鳴, 杜道林, 肖翔 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)