專利名稱：一種碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株碘普羅胺降解菌株-假單胞菌(Pseudomonas sp.)的碘普羅胺
酶活性測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
碘普羅胺是碘化造影劑的一種，用于血管造影、腎動(dòng)脈造影、尿路造影、CT的對(duì)比增強(qiáng)檢查、體腔顯示。該類物質(zhì)具有極強(qiáng)的生化穩(wěn)定性，人體注射后，80%的藥物都不經(jīng)新陳代謝而隨尿液直接排出，同一些未處理而直接丟棄的過期或者失效的碘普羅胺直接排入城市污水管網(wǎng)。城市污水處理廠從成本和運(yùn)營(yíng)便捷性上考慮，一般采用生物法，但是由于碘普羅胺結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且被研發(fā)出來的時(shí)間不長(zhǎng)，普通活性污泥通常會(huì)以結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單、存在時(shí)間較長(zhǎng)的污染物作為初級(jí)基質(zhì)進(jìn)行代謝，導(dǎo)致碘普羅胺的去除率極低，最終又進(jìn)入水體，對(duì)環(huán)境系統(tǒng)造成潛在影響，因此成為目前國(guó)際上研究較多的痕量污染物——藥品及個(gè)人護(hù)理用品(PPCPs)之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于PPCPs的降解與去除研究仍舊屬于黑箱模型范疇，通常考慮的是外因條件變化所導(dǎo)致的不同去除率，然而如何更加有效地從根源上了解最佳去除模式還需更深入的研究。假單胞菌(Pseudomonas sp.)對(duì)于碘普羅胺的去除率最高可達(dá)99%,從環(huán)境中去除碘普羅胺不僅要考慮降解效率，更要考察菌體對(duì)于目標(biāo)污染物的代謝過程，該細(xì)菌對(duì)目標(biāo)污染物的去除實(shí)質(zhì)上是其胞內(nèi)酶的代謝作用，因此研究其酶活性所受環(huán)境生態(tài)因子的影響是邁出進(jìn)入灰箱模型的第一步，其中酶活性的測(cè)定方法為之后的所有實(shí)驗(yàn)奠定了研究基石。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定且便捷的碘普羅胺降解菌酶活性測(cè)定方法，為PPCPs的基礎(chǔ)研究做前期準(zhǔn)備。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性測(cè)定方法，其特征在于，具體步驟為步驟a.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱量O. 3g碘普羅胺標(biāo)準(zhǔn)品加入IOOmL蒸餾水中，配成3g/L的碘普羅胺溶液，逐級(jí)稀釋到3、6、9、12、15、18、2411^/1，在24211111波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；步驟b.樣品的采集與制備配制含有30mg/L碘普羅胺、lg/L可溶性淀粉的IOOmL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，將本實(shí)驗(yàn)室分離得到的假單胞菌(Pseudomonas sp.)以10wt%的接種量接種到所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，將其置于30°C搖床中在180r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)，Id后菌種生長(zhǎng)量達(dá)到較為活躍的對(duì)數(shù)期，所得菌液即可作為待測(cè)樣品；步驟c.樣品濃縮將上步所得的待測(cè)樣品取40mL裝入50mL離心管內(nèi)，以8000rpm的速度離心30min，棄去上清液，加入4mL pH7. I的Tris-HCl緩沖液清洗菌體，再以8000rpm的速度離心30min，棄去上清液，重復(fù)清洗一次，以20 30mL Tris-HCl緩沖液混勻沉淀物，放入超聲波細(xì)胞破碎機(jī)中冰浴破碎30min，功率300W，工作2s，休息ls，所獲溶液即為粗酶液；步驟d.樣品培養(yǎng)向6只IOmL具塞試管中分別加入3mLpH7. I的Tris-HCl緩沖液、lmL15mg/L的碘普羅胺溶液以及ImL粗酶液，混合均勻后將3只試管作為樣品管置于30°C恒溫水浴鍋培養(yǎng)2小時(shí)，另外3只作為空白對(duì)照管在80 90°C水浴放置IOmin滅活；步驟e.終止酶反應(yīng)將樣品管在80 90°C水浴中放置IOmin滅活,將樣品管和空白對(duì)照管分別倒入IOmL離心管中，以12000rpm離心20min ；步驟f.吸光度分析將步驟e中離心后的上清液倒入Icm石英比色皿中，使用紫外-可見光分光光度計(jì)在242nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算空白對(duì)照管與樣品管的吸光度之差，比對(duì)碘普羅胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性，取三組數(shù)據(jù)的平均值。碘普羅胺酶的活性單位定義為每分鐘降解I μ mol碘普羅胺所需要的酶量。優(yōu)選地，所述的步驟b中的無機(jī)鹽培養(yǎng)基包括以下組份=K2HPO4 O. 435g、 KH2PO4O. 17g、NH4Cl O. 21g、CaCl2 · 2H20 0. 003g、FeSO4 · 7H20 0. OOlg、MgSO4 0. 02g、MnSO40. 005g、蒸餾水lOOmL，調(diào)節(jié)pH值為6. 8 7. 2。本發(fā)明的碘普羅胺酶活性測(cè)定方法解決了 PPCPs領(lǐng)域降解菌酶活性測(cè)定方法的空白，為此領(lǐng)域進(jìn)一步研究奠定了技術(shù)上的基礎(chǔ)，該方法選擇通過底物即碘普羅胺濃度的減少量考察酶活性，并將停止酶反應(yīng)的水浴溫度控制在80 90°C，避免碘普羅胺因高溫分解導(dǎo)致最終結(jié)果偏大的問題，與此同時(shí)，選擇將空白樣中同時(shí)添加酶液并高溫滅活，可避免對(duì)照組因離心不夠完全而出現(xiàn)吸光度偏高，兩組對(duì)比樣不在同一水平比較的情況。本方法檢測(cè)簡(jiǎn)便、效果穩(wěn)定，具有極高的實(shí)用價(jià)值，利于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來具體說明本發(fā)明。實(shí)施例碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性測(cè)定方法，具體步驟為a.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱量0. 3g碘普羅胺標(biāo)準(zhǔn)品加入IOOmL蒸餾水中，配成3g/L的碘普羅胺溶液，逐級(jí)稀釋到3、6、9、12、15、18、24mg/L，在242nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)線為y = 0. 0427x+0. 0062,R2 = 0. 9985，其中，y為吸光度，x為碘普羅胺濃度(mg/L) οb.樣品的采集與制備配制含有30mg/L碘普羅胺、lg/L可溶性淀粉的IOOmL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(K2HPO4 0. 435g、KH2PO4 0. 17g、NH4Cl 0. 21g、CaCl2 · 2H20 0. 003g、FeSO4 · 7H200. 001g、MgSO4 0. 02g、MnSO4 0. 005g、蒸餾水 IOOmL, pH = 6. 8 7. 2。)，將本實(shí)驗(yàn)室分離得到的假單胞菌(Pseudomonas sp.)以IOwt %的接種量接種到所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，將其置于30°C搖床中在180r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)，Id后菌種生長(zhǎng)量達(dá)到較為活躍的對(duì)數(shù)期，所得菌液即可作為待測(cè)樣品；c.樣品濃縮將上步待測(cè)樣品取40mL裝入50mL離心管內(nèi)，以8000rpm的速度離心30min,棄去上清液,加入4mL pH7. I的Tris-HCl緩沖液清洗菌體，以8000rpm的速度離心30min，棄去上清液，重復(fù)清洗一次，以25mL Tris-HCl緩沖液混勻沉淀物，放入超聲波細(xì)胞破碎機(jī)中冰浴破碎30min，功率300W，工作2s，休息ls，所獲溶液即為粗酶液；
d.樣品培養(yǎng)向六只IOmL具塞試管中分別加入3mL ρΗ7· I的Tris-HCl緩沖液、lmL15mg/L的碘普羅胺溶液以及ImL粗酶液，混合均勻后將三只試管作為樣品管置于30°C恒溫水浴鍋培養(yǎng)2小時(shí)，以便碘普羅胺按酶充分與底物反應(yīng)，另外三只作為空白對(duì)照管在80°C水浴中放置IOmin滅活；e.終止酶反應(yīng)將樣品管在80°C水浴中放置IOmin滅活，將樣品管和空白對(duì)照管分別倒入IOmL離心管中，以12000rpm離心2Omin ；f.吸光度分析將步驟e中離心后的上清液倒入Icm石英比色皿中，使用紫外-可見光分光光度計(jì)在242nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算空白對(duì)照管與樣品管的吸光度之差，比對(duì)碘普羅胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性，取三組數(shù)據(jù)的平均值。碘普羅胺酶的活性單位定義為每分鐘降解Iymol碘普羅胺所需要的酶量(IU =I μ mol/min) 0酶活力計(jì)算公式為
權(quán)利要求
1.一種碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性測(cè)定方法，其特征在于，具體步驟為 步驟a.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱量0. 3g碘普羅胺標(biāo)準(zhǔn)品加入IOOmL蒸懼水中，配成3g/L的碘普羅胺溶液，逐級(jí)稀釋到3、6、9、12、15、18、24mg/L，在242nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 步驟b.樣品的采集與制備配制含有30mg/L碘普羅胺、lg/L可溶性淀粉的IOOmL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，將本實(shí)驗(yàn)室分離得到的假單胞菌以IOwt%的接種量接種到所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，將其置于30°C搖床中在180r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)，Id后菌種生長(zhǎng)量達(dá)到較為活躍的對(duì)數(shù)期，所得菌液即可作為待測(cè)樣品； 步驟c.樣品濃縮將上步所得的待測(cè)樣品取40mL裝入50mL離心管內(nèi)，以8000rpm的速度離心30min，棄去上清液，加入4mL pH7. I的Tris-HCl緩沖液清洗菌體，再以8000rpm的速度離心30min，棄去上清液，重復(fù)清洗一次，以20 30mL Tris-HCl緩沖液混勻沉淀物，放入超聲波細(xì)胞破碎機(jī)中冰浴破碎30min，功率300W，工作2s，休息ls，所獲溶液即為粗酶液； 步驟d.樣品培養(yǎng)向6只IOmL具塞試管中分別加入3mL pH7. I的Tris-HCl緩沖液、ImL 15mg/L的碘普羅胺溶液以及ImL粗酶液，混合均勻后將3只試管作為樣品管置于30°C恒溫水浴鍋培養(yǎng)2小時(shí)，另外3只作為空白對(duì)照管在80 90°C水浴放置IOmin滅活； 步驟e.終止酶反應(yīng)將樣品管在80 90°C水浴中放置IOmin滅活，將樣品管和空白對(duì)照管分別倒入IOmL離心管中，以12000rpm離心20min ； 步驟f.吸光度分析將步驟e中離心后的上清液倒入Icm石英比色皿中，使用紫外-可見光分光光度計(jì)在242nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算空白對(duì)照管與樣品管的吸光度之差，比對(duì)碘普羅胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性，取三組數(shù)據(jù)的平均值。碘普羅胺酶的活性單位定義為每分鐘降解I U mol碘普羅胺所需要的酶量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性測(cè)定方法，其特征在于，所述的步驟b中的無機(jī)鹽培養(yǎng)基包括以下組份=K2HPO4 0. 435g、KH2PO4 0. 17g、NH4Cl 0. 21g、CaCl2 2H20 0. 003g、FeSO4 7H20 0. OOlg、MgSO4 0. 02g、MnSO4 0. 005g、蒸餾水lOOmL，調(diào)節(jié)pH值為6. 8 7. 2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種碘普羅胺降解菌產(chǎn)生的碘普羅胺酶的活性測(cè)定方法，包括如下操作步驟a.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，b.樣品的采集與制備，c.樣品濃縮，d.樣品培養(yǎng)，e.終止酶反應(yīng)，f.吸光度分析。本發(fā)明的方法補(bǔ)充了PPCPs研究過程中酶測(cè)定方法的缺失，它的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，具有較高的實(shí)用價(jià)值，同時(shí)可用作其他降解菌酶活性的測(cè)定，利于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK102758001SQ201210209199
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月22日
發(fā)明者何夢(mèng)琦, 侍寬, 劉亞男, 劉振鴻, 劉暢, 張丹丹, 徐冰潔, 曾昊, 李珊珊, 桂夢(mèng)瑤, 梅述芳, 毛菲菲, 王鵬, 程鏡潤(rùn), 薛罡, 金舒怡, 顧熙磊, 高品 申請(qǐng)人:東華大學(xué)