專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染方法。
背景技術(shù)：
植物遺傳轉(zhuǎn)化是一種重要和先進(jìn)的育種技術(shù)。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)已經(jīng)基本成熟，而最為通常的轉(zhuǎn)化方法是應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)氲绞荏w植物的細(xì)胞并整合到染色體基因組中以實(shí)現(xiàn)外源基因穩(wěn)定的遺傳。在采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆下胚軸外植體的過(guò)程中，以往都是把外植體整個(gè)浸泡在農(nóng)桿菌菌液中，使整個(gè)外植體都沾上菌液。為了抑制外植體表面的農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上的過(guò)旺增殖以防止植物材料的腐爛，通常是在培養(yǎng)基中添加抗生素。但是，抗生素在抑制農(nóng)桿菌增 殖的同時(shí)也對(duì)外植體不定芽再生產(chǎn)生不利影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆下胚軸外植體的技術(shù)不足，提供一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染的裝置，該裝置可以有效保證部分外植體粘上菌液并避免整個(gè)外植體都沾上菌液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染方法，本發(fā)明一方面基于本發(fā)明上述裝置，只對(duì)有再生不定芽潛能的下胚軸外植體的形態(tài)學(xué)上端切口附近進(jìn)行局部的農(nóng)桿菌侵染處理。因?yàn)榻?jīng)過(guò)局部侵染處理后農(nóng)桿菌僅存在于外植體上端切口附近，在不定芽再生的培養(yǎng)過(guò)程中外植體上端切口附近不需要接觸培養(yǎng)基，因此不需要在培養(yǎng)基中添加旨在抑制農(nóng)桿菌的抗生素。避免了抗生素在抑制農(nóng)桿菌增殖的同時(shí)也對(duì)外植體不定芽再生產(chǎn)生的不利影響，另一方面，本發(fā)明方法對(duì)侵染的關(guān)鍵步驟和工藝進(jìn)行了優(yōu)化，適宜的裝置以及步驟和工藝的優(yōu)化最終保證了本發(fā)明良好的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的
本發(fā)明首先提供一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染的裝置，包括培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿蓋，在培養(yǎng)皿中固定有一基板，基板上設(shè)置有貫通柱孔，所述貫通柱孔至少下端伸出基板并保證其下端底部與培養(yǎng)皿底距離為I mm 2 mm;所述貫通柱孔的孔內(nèi)徑大小與外植體莖徑大小相適配。所述裝置可置于高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行常規(guī)滅菌。所述貫通柱孔可以為若干個(gè)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述裝置包括培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿蓋，在培養(yǎng)皿中固定有一塊通常用于核苷酸片段擴(kuò)增的PCR板，切掉PCR板底部的小管形成貫通柱孔(整齊地切掉PCR板底部的小管)，保留四個(gè)角上的小管作支架，支架將PCR板支撐在培養(yǎng)皿中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)皿大小和PCR板大小，本發(fā)明采用4cmX 6cm的PCR板。
基于上述裝置，本發(fā)明同時(shí)提供一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染方法，具體包括以下步驟
(I)制備用于局部侵染處理下胚軸外植體的農(nóng)桿菌菌液；
作為優(yōu)選，用已滅菌的接種環(huán)從保存有農(nóng)桿菌菌種的小管中蘸取少許菌液，在固體培養(yǎng)基上劃線接種之后，把培養(yǎng)皿放置于28°c生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落后，再用接種針挑取單菌落接種至盛有20mL液體農(nóng)桿菌培養(yǎng)基的大離心管(已滅菌)中，恒溫?fù)u床(28°C，200rpm)上培養(yǎng)24小時(shí)后，12000rpm離心lOmin，保留沉淀倒掉上清液，再向大離心管中加入20mL液體共培養(yǎng)基，懸浮沉淀，恒溫?fù)u床(28°C，200rpm)中培養(yǎng)I小時(shí)，調(diào)整菌液的OD值為O. 5 1.0。所述農(nóng)桿菌培養(yǎng)基5 g/L牛肉浸膏+lg/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L鹿糖+0. 4g/100 mL MgSO4 · 7H20，用 I mg/L NaOH 溶液調(diào)整 pH 至 7. 4。培養(yǎng)基在 121 °C, O. I MPa 的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷至60 °C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌 的100 mg/mL氯霉素母液和50 mg/mL的卡那霉素母液,使兩者終濃度分別為100 mg/L和50 mg/L;其中固體培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂。所述液體共培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、8. 6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解絡(luò)蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮,用I mg/LNaOH溶液調(diào)整pH至5. 5。培養(yǎng)基在121 °C, O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60°C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L。(2)獲取大豆下胚軸外植體供體材料和下胚軸外植體；
作為優(yōu)選，選取大小均一的成熟大豆種子，經(jīng)常規(guī)滅菌后，接種至無(wú)激素MSB5培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)5天，獲得具有長(zhǎng)度大于I cm的胚軸的大豆幼苗作為下胚軸外植體供體材料，對(duì)幼苗進(jìn)行切割，獲取長(zhǎng)度為I cm左右的下胚軸切段為外植體，切口平齊。所述MSB5培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、
8.6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8 6. O。培養(yǎng)基在121 °C >O. I MPa的條件下滅菌15 min。(3) BA溶液處理下胚軸外植體；
作為優(yōu)選，在超凈工作臺(tái)上，把切好的下胚軸外植體逐個(gè)插入本發(fā)明所述的裝置的各個(gè)貫通柱孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下(接觸培養(yǎng)皿底)，然后向該裝置組成部分的培養(yǎng)皿中倒入30 mg/L BA處理溶液至約I mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚軸外植體，放置在無(wú)菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的BA溶液。所述BA處理溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的分析純BA藥品，用I mg/L NaOH充分溶解，再用去離子水定容，配制成30 mg/L的BA處理溶液。采用I mg/L HCl調(diào)整pH值為5. 8 6. O ;在121°C、0. I MPa的條件下，對(duì)已配制好的高濃度的BA處理溶液進(jìn)行15 min滅菌。(4)對(duì)下胚軸外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染前的預(yù)培養(yǎng)；
作為優(yōu)選，把經(jīng)過(guò)步驟(3) BA溶液短期處理后的外植體以豎插方式(外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上)接種至無(wú)激素MSB5培養(yǎng)基(同步驟(3))上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)I 2天。更為優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為I天。
所述預(yù)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L 二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8-6. O。培養(yǎng)基在121 0C,O. I MPa的條件下滅菌15 min。(5)對(duì)下胚軸外植體進(jìn)行局部農(nóng)桿菌侵染；
作為優(yōu)選，在超凈工作臺(tái)中，把經(jīng)過(guò)步驟(4)預(yù)培養(yǎng)后的下胚軸外植體逐個(gè)插入本發(fā)明所述的裝置的各個(gè)貫通柱孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下(接觸培養(yǎng)皿底)，然后向所述裝置組成部分的培養(yǎng)皿中倒入步驟(I)所述的農(nóng)桿菌菌液至約I _深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20 min后倒掉農(nóng)桿菌菌液，取出下胚軸外植體，放置在無(wú)菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的農(nóng)桿菌菌液。在此過(guò)程中要特別注意外植體的其他部位不要接觸到農(nóng)桿菌。(6)對(duì)侵染后的下胚軸外植體進(jìn)行共培養(yǎng)；
作為優(yōu)選，把經(jīng)過(guò)步驟(5)農(nóng)桿菌局部侵染后的下胚軸外植體以豎插方式(外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上)接種至無(wú)抗生素的固體共培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、黑暗條件下，共培養(yǎng)3 6天。接種操作和整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程要注意外植體上端有農(nóng)桿菌的部位不要與培養(yǎng)瓶壁以及培養(yǎng)基接觸。更為優(yōu)選地，共培養(yǎng)時(shí)間為3天。所述共培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L 二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解絡(luò)蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮+8 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 5。培養(yǎng)基在121 °C, O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60 °C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L。(7)對(duì)侵染后的下胚軸外植體進(jìn)行恢復(fù)再生培養(yǎng)；作為優(yōu)選，把經(jīng)過(guò)步驟(6)共培養(yǎng)后的下胚軸外植體以豎插方式(外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上)接種至無(wú)抗生素的恢復(fù)培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)20天。接種操作和整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程要注意外植體上端有農(nóng)桿菌的部位不要與培養(yǎng)瓶壁以及培養(yǎng)基接觸。所述恢復(fù)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、
8.6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8-6. O。培養(yǎng)基在121 °C, O. I MPa的條件下滅菌15 min。
(8)對(duì)侵染后的下胚軸外植體再生的不定芽進(jìn)行篩選培養(yǎng)；
作為優(yōu)選，把經(jīng)過(guò)步驟(7)所述恢復(fù)培養(yǎng)后已經(jīng)再生不定芽的下胚軸外植體以橫放方式接種至篩選培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)30天。所述篩選培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、
8.6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌劑(200 mg/L羧芐青霉素和200 mg/L頭孢霉素)+篩選劑(3 mg/L草胺磷)+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8 6. O。培養(yǎng)基在121 0C,O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60 V左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的抑菌劑母液和篩選劑母液至所定濃度。(9)抗性芽生根培養(yǎng)與抗性苗馴化移栽；
作為優(yōu)選，經(jīng)過(guò)步驟(8)篩選培養(yǎng)后將仍然鮮綠的抗性芽從外植體上切割分離I cm 2 cm，以豎插方式接種至生根培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，從培養(yǎng)瓶中取出生根的抗性苗，洗凈抗性苗根上的培養(yǎng)基后，即可栽植到干凈的細(xì)砂基質(zhì)中，進(jìn)行常規(guī)的保濕煉苗。幾天之后，即可把抗性苗種植在一般的土壤中進(jìn)行常規(guī)管理，最后可以獲得完整的抗性植株。所述生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、8. 6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L 肌醇)+0. 5 mg/L NAA +25 g/L 鹿糖+300 mg/L 蛋白胨 + 抑菌劑(200 mg/L 羧芐青霉素和200 mg/L頭孢霉素)+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8 6. O。培養(yǎng)基在121 0C,O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60 °C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的抑菌劑母液(200 mg/L羧芐青霉素和200 mg/L頭孢霉素)至所定濃度。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明為了保證大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌效果和效率，主要從兩個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化，一方面創(chuàng)造性地設(shè)計(jì)了一種裝置，可很好地應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染，設(shè)計(jì)巧妙，取材簡(jiǎn)單，但可以有效保證部分外植體粘上菌液并避免整個(gè)外植體都沾上菌液，采用最簡(jiǎn)單的方法解決了長(zhǎng)期困擾本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)難題，不僅避免使用抗生素從而保證了轉(zhuǎn)化效率，而且因?yàn)椴皇褂每股?，也大大降低生產(chǎn)成本；本發(fā)明進(jìn)一步巧妙地利用核苷酸片段擴(kuò)增的PCR板制備所述裝置，就地取材，容易實(shí)現(xiàn)推廣應(yīng)用；第二方面是對(duì)侵染步驟和條件進(jìn)行了進(jìn)一步地優(yōu)化，尤其是在預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)方面進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步保證侵染效率。本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法中除了篩選培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中添加抗生素之外，其他培養(yǎng)基中都不用添加抗生素，由此可降低大豆下胚軸外植體遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的藥劑成本，更重要的是由于不定芽再生培養(yǎng)基中沒(méi)有抗生素，由此可以消除抗生素對(duì)不定芽再生的不利影 響，顯著提高轉(zhuǎn)化工作效率。


圖I本發(fā)明農(nóng)桿菌局部侵染處理下胚軸外植體的裝置；
圖2大豆下胚軸外植體的恢復(fù)培養(yǎng)；
圖3大豆不定芽的篩選培養(yǎng)；
圖4抗性芽生根培養(yǎng)；
圖5移栽種植的抗性苗參考 圖6轉(zhuǎn)基因大豆的PCR鑒定(檢測(cè)目的基因)；
其中，I :陽(yáng)性對(duì)照(菌液質(zhì)粒)；2 :陰性對(duì)照(野生型植物)；3 =Marker 3 ;4 6 :抗性植
株;
圖I轉(zhuǎn)基因大豆的PCR鑒定(檢測(cè)篩選標(biāo)記基因)；
其中，I :陽(yáng)性對(duì)照(菌液質(zhì)粒)；2 :陰性對(duì)照(野生型植株)；3 Marker 3 ;4 6 :抗性植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。附圖中，顯示的大豆品種“華春2號(hào)”等僅為說(shuō)明本發(fā)明思路描述方便，并不因此限定本發(fā)明范圍，本技術(shù)領(lǐng)域可以采用其他常用的大豆品種。實(shí)施例I
本實(shí)施例提供一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染的裝置，見(jiàn)附圖I所示，包括培養(yǎng)皿I及培養(yǎng)皿蓋2，在培養(yǎng)皿中固定有一基板3，基板上設(shè)置有貫通柱孔4，所述貫通柱孔4至少下端伸出基板并保證其下端底部與培養(yǎng)皿底距離為Imm 2mm ;所述貫通柱孔的孔內(nèi)徑大小與外植體莖徑大小相適配。所述裝置可置于高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行常規(guī)滅菌。所述貫通柱孔可以為若干個(gè)。作為優(yōu)選，所述基板采用一塊通常用于核苷酸片段擴(kuò)增的PCR板3，整齊地切掉PCR板底部的小管形成貫通柱孔4，保留四個(gè)角上的小管作支架，支架將PCR板3支撐在培養(yǎng)皿中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)皿大小和PCR板大小，本發(fā)明采用4cmX6cm的PCR板?；谏鲜鲅b置，本實(shí)施例同時(shí)提供一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染方法，具體包括以下步驟
(I)制備用于局部侵染處理下胚軸外植體的農(nóng)桿菌菌液；
用已滅菌的接種環(huán)從保存有EHA 105農(nóng)桿菌菌種(由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郭振飛研究員惠贈(zèng)，本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員也可以采用其他已報(bào)道用于大豆侵染的農(nóng)桿菌菌種)的小管中蘸取少許菌液，在固體培養(yǎng)基上劃線接種之后，把培養(yǎng)皿放置于28°C生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落后，再用接種針挑取單菌落接種至盛有20mL液體農(nóng)桿菌培養(yǎng)基的大離心管(已滅菌)中，恒溫?fù)u床(28°C，200rpm)上培養(yǎng)24小時(shí)后，12000rpm離心lOmin，保留沉淀倒掉上清液，再向大離心管中加入20mL液體共培養(yǎng)基，懸浮沉淀，恒溫?fù)u床(28°C，200rpm)中培養(yǎng)I小時(shí)，調(diào)整菌液的OD值為O. 5 I. O。
所述農(nóng)桿菌培養(yǎng)基5 g/L牛肉浸膏+lg/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L鹿糖+0. 4g/100 mL MgSO4 · 7H20，用 I mg/L NaOH 溶液調(diào)整 pH 至 7. 4。培養(yǎng)基在 121 °C, O. I MPa 的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷至60 °C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100 mg/mL氯霉素母液和50 mg/mL的卡那霉素母液,使兩者終濃度分別為100 mg/L和50 mg/L;其中固體培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂。所述液體共培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、8. 6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解絡(luò)蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮,用I mg/LNaOH溶液調(diào)整pH至5. 5。培養(yǎng)基在121 °C, O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60°C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L。(2)獲取大豆下胚軸外植體供體材料和下胚軸外植體；
選取大小均一的成熟大豆種子，經(jīng)常規(guī)滅菌后，接種至無(wú)激素MSB5培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)5天，獲得具有長(zhǎng)度大于I cm的胚軸的大豆幼苗作為下胚軸外植體供體材料，對(duì)幼苗進(jìn)行切割，獲取長(zhǎng)度為Icm左右的下胚軸切段為外植體，切口平齊。所述MSB5培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、8.6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8 6. O。培養(yǎng)基在121 °C >O. I MPa的條件下滅菌15 min。(3) BA溶液處理下胚軸外植體；在超凈工作臺(tái)上，把切好的下胚軸外植體逐個(gè)插入本發(fā)明所述的裝置的各個(gè)貫通柱孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下(接觸培養(yǎng)皿底)，然后向該裝置組成部分的培養(yǎng)皿中倒入30 mg/L BA處理溶液至Imm 2mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚軸外植體，放置在無(wú)菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的BA溶液。所述BA處理溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的分析純BA藥品，用I mg/L NaOH溶液充分溶解，再用去離子水定容，配制成30 mg/L的BA處理溶液。采用I mg/L HCl溶液調(diào)整pH值為5. 8 6. O ;在121°C、0. I MPa的條件下，對(duì)已配制好的高濃度的BA處理溶液進(jìn)行15 min滅菌。(4)對(duì)下胚軸外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染前的預(yù)培養(yǎng)；
把經(jīng)過(guò)步驟(3)BA溶液短期處理后的外植體以豎插方式(外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上)接種至無(wú)激素MSB5培養(yǎng)基(同步驟(3))上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)I天。
所述預(yù)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、I. 7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L 二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8-6. O。培養(yǎng)基在121 0C,O. I MPa的條件下滅菌15 min。(5)對(duì)下胚軸外植體進(jìn)行局部農(nóng)桿菌侵染；
在超凈工作臺(tái)中，把經(jīng)過(guò)步驟(4)預(yù)培養(yǎng)后的下胚軸外植體逐個(gè)插入本發(fā)明所述的裝置的各個(gè)貫通柱孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下(接觸培養(yǎng)皿底)，然后向該裝置組成部分的培養(yǎng)皿中倒入步驟(I)所述的農(nóng)桿菌菌液至I mm 2 mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20min后倒掉農(nóng)桿菌菌液，取出下胚軸外植體，放置在無(wú)菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的農(nóng)桿菌菌液。在此過(guò)程中要特別注意外植體的其他部位不要接觸到農(nóng)桿菌。(6)對(duì)侵染后的下胚軸外植體進(jìn)行共培養(yǎng)；
把經(jīng)過(guò)步驟(5)農(nóng)桿菌局部侵染后的下胚軸外植體以豎插方式(外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上)接種至無(wú)抗生素的固體共培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、黑暗條件下，共培養(yǎng)3天。接種操作和整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程要注意外植體上端有農(nóng)桿菌的部位不要與培養(yǎng)瓶壁以及培養(yǎng)基接觸。所述共培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、I. 7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化|丐、16. 9 mg/L—水硫酸猛、8. 6 mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L 二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+500 mg/L水解絡(luò)蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮+8 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 5。培養(yǎng)基在121 °C, O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60 °C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L。(7)對(duì)侵染后的下胚軸外植體進(jìn)行恢復(fù)再生培養(yǎng)；把經(jīng)過(guò)步驟(6)共培養(yǎng)后的下胚軸外植體以豎插方式(外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上)接種至無(wú)抗生素的恢復(fù)培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)20天，見(jiàn)附圖2所示。接種操作和整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程要注意外植體上端有農(nóng)桿菌的部位不要與培養(yǎng)瓶壁以及培養(yǎng)基接觸。所述恢復(fù)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、1.7 g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、
8.6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8-6. O。培養(yǎng)基在121 °C, O. I MPa的條件下滅菌15 min。(8)對(duì)侵染后的下胚軸外植體再生的不定芽進(jìn)行篩選培養(yǎng)；
把經(jīng)過(guò)步驟(7)所述恢復(fù)培養(yǎng)后已經(jīng)再生不定芽的下胚軸外植體以橫放方式接種至篩選培養(yǎng)基上，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000 lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)30天，見(jiàn)附圖3所示。所述篩選培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L 二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、
8.6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L肌醇)+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌劑(200 mg/L羧芐青霉素和200 mg/L頭孢霉素)+篩選劑(3 mg/L草胺磷)+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8 6. O。培養(yǎng)基在121 0C,O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60 V左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的抑菌劑母液和篩選劑母液至所定濃度。(9)抗性芽生根培養(yǎng)與抗性苗馴化移栽；
經(jīng)過(guò)步驟(8)篩選培養(yǎng)后將仍然鮮綠的抗性芽從外植體上切割分離(長(zhǎng)度為Icm 2cm),以豎插方式接種至生根培養(yǎng)基上，見(jiàn)附圖4所示，在室溫為25 °C、光照強(qiáng)度為2000lx、光照時(shí)間為每天12小時(shí)的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，從培養(yǎng)瓶中取出生根的抗性苗，洗凈抗性苗根上的培養(yǎng)基后，即可栽植到干凈的細(xì)砂基質(zhì)中，進(jìn)行常規(guī)的保濕煉苗。幾天之后，即可把抗性苗種植在一般的土壤中進(jìn)行常規(guī)管理，最后可以獲得完整的抗性植株，見(jiàn)附圖5所示。附圖5中僅以移栽種植的抗性苗的實(shí)際生長(zhǎng)形態(tài)作為參考，其它背景圖案不作為本說(shuō)明書(shū)保護(hù)內(nèi)容。所述生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分(16. 5 g/L硝酸銨、19 g/L硝酸鉀、
1.7g/L磷酸二氫鉀、3. 7 g/L七水硫酸鎂、4. 4 g/L二水氯化鈣、16. 9 mg/L—水硫酸錳、8. 6mg/L七水硫酸鋅、6. 2 mg/L硼酸、O. 83 mg/L碘化鉀、O. 25 mg/L二水硫酸鑰二鈉、O. 025 mg/L五水硫酸銅、O. 025 mg/L六水氯化鈷、37. 3 mg/L 二水乙二胺四乙酸鈉、27. 8 mg/L七水硫酸亞鐵)+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分(10 mg/L鹽酸硫胺素、I mg/L鹽酸卩比卩多醇、I mg/L煙酸、100 mg/L 肌醇)+0. 5 mg/L NAA +25 g/L 鹿糖+300 mg/L 蛋白胨 + 抑菌劑(200 mg/L 羧芐青霉素和200 mg/L頭孢霉素)+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 8 6. O。培養(yǎng)基在121 °C,O. I MPa的條件下滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至60 °C左右時(shí)，加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的抑菌劑母液至所定濃度。實(shí)施例2預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)下胚軸外植體篩選存活率的影響
本實(shí)施例，對(duì)苗齡為5天的大豆幼苗進(jìn)行切割獲取下胚軸外植體，對(duì)其進(jìn)行短期BA溶液(同實(shí)施例I)處理后，再進(jìn)行0、1、2天的預(yù)培養(yǎng)，采用OD值為O. 5 I. O的農(nóng)桿菌菌液對(duì)外植體的形態(tài)學(xué)上端進(jìn)行局部侵染20 min處理，經(jīng)過(guò)3天的共培養(yǎng)后，把外植體以豎插方式接種至無(wú)抗生素恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天，最后把外植體以橫放方式接種至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示。表I預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外植體存活率的影響
時(shí)間/d I存活率/% ~ 20.83b ~ 45.83a 2~ 丨40· 28a
注數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17. O統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較(P含O. 05)，數(shù)據(jù)后字母不同表示顯著差異。表I的結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為I天時(shí)，外植體存活率達(dá)最大值，為45. 83 %，顯著高于不經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)而直接進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)組的20. 83 % ;觀察還發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體，在篩選過(guò)程中，被農(nóng)桿菌侵染過(guò)的部分容易發(fā)黃且外植體不易存活。實(shí)施例3共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)下胚軸外植體篩選存活率的影響
本實(shí)施例，對(duì)苗齡為5天的大豆幼苗進(jìn)行切割獲取下胚軸外植體，對(duì)其進(jìn)行短期BA溶液處理后，再進(jìn)行I天的預(yù)培養(yǎng)，采用OD值為O. 5 I. O的農(nóng)桿菌菌液對(duì)外植體的形態(tài)學(xué)上端進(jìn)行局部侵染20 min處理，經(jīng)過(guò)再經(jīng)過(guò)0、3、6天的共培養(yǎng)后，把外植體以豎插方式接種至無(wú)抗生素恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天，最后把外植體以橫放方式接種至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外植體存活率的影響
時(shí)間/d I存活率/%
~ 20. OOb355.83a
662. 50a
注數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17. O統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較(P含O. 05)，數(shù)據(jù)后字母不同表示顯著差異。表2的結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)3天和6天后，外植體存活率分別為55.83 %和62. 50%，顯著高于不經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)而直接進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)的20. 00 %。實(shí)施例4對(duì)局部侵染法所獲得的抗性植株的分子檢測(cè)
對(duì)苗齡為5天的大豆幼苗進(jìn)行切割獲取下胚軸外植體，對(duì)其進(jìn)行短期BA溶液處理后，再進(jìn)行I天的預(yù)培養(yǎng)，采用OD值為O. 5 I. O的農(nóng)桿菌菌液對(duì)外植體的形態(tài)學(xué)上端進(jìn)行局部侵染20 min處理，經(jīng)過(guò)再經(jīng)過(guò)0、3、6天的共培養(yǎng)后，把外植體以豎插方式接種至無(wú)抗生素恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天，最后把外植體以橫放方式接種至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，篩選后所得的抗性芽經(jīng)過(guò)生根培養(yǎng)后得到抗性苗，對(duì)其進(jìn)行馴化移栽，最后可以獲得完整植株。以大豆抗性植株的葉片為材料，采用SDS法抽提總DNA用于PCR檢測(cè)。所述SDS法抽提總DNA :取新鮮的大豆葉片O. I g左右，加液氮研磨葉片至粉末狀，將粉末倒入已經(jīng)加有O. 8 mL SDS微量抽提液的2 mL離心管中；將離心管置于恒溫加熱板加熱30 min，溫度調(diào)為65°C，每隔幾分鐘，輕輕搖晃離心管I次；加熱結(jié)束后，向離心管加入O. 8 mL氯仿異戊醇乙醇=76:4:20混合液后，離心管在旋轉(zhuǎn)儀上慢速旋轉(zhuǎn)10 min ;將離心管置于離心機(jī)中，在12000 rpm、4 °C條件下離心12 min ;離心后，取上清液500 yL置于新的2 mL離心管中，加入50 μ L 3 mol/L醋酸鈉和500 μ L異戊醇，輕輕搖勻，靜置3-5min ;在12000 rpm、20 °C條件下離心5 min,去上清，留沉淀；采用500 μ L 75 %乙醇清洗沉淀，在12000 rpm、20 °C條件下離心3 min,取上清留沉淀,清洗沉淀2次；超凈工作臺(tái)上吹干離心管中的殘留的乙醇；待沉淀干燥后，加入20 UL TE保存DNA。所述PCR檢測(cè)把加入了引物、模版DNA、TagDNA聚合酶、TagDNA聚合酶buffer(含有Mg2+)、2m dNTP、去離子水的PCR反應(yīng)管放入PCR儀的反應(yīng)槽中，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)；
其中檢測(cè)目的基因時(shí)設(shè)置的PCR反應(yīng)參數(shù)為94 °C預(yù)變性5min ；94 V變性30s，55 °C退火30 s，72 °C延伸90s，35個(gè)循環(huán)；最后72 °C充分延伸lOmin，采用20μ L的反應(yīng)體系(上游引物5’ -GCGCAGATCTAGATGTCTACTATCC-3’ ;下游引物:5，-GCAAGGTGACCGAGCTAGTCGGA-3，)；
檢測(cè)篩選標(biāo)記基因時(shí)設(shè)置的反應(yīng)參數(shù)為94 °C預(yù)變性5 min ；94 °C變性30 S，56 V退火30 S，72 °C延伸30 S，30個(gè)循環(huán)；最后72 1充分延伸10 min，PCR采用20 μ L的反應(yīng)體系(上游引物 5’ -CCGTACCGAGCCGCAGGAAC-3’，下游引物5’ -CAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC-3，)；
兩種PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照均為pCAMBIA3301質(zhì)粒(由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郭振飛研究員實(shí)驗(yàn)室提供)，其中包含目的基因和篩選標(biāo)記基因ifer ;陰性對(duì)照均為野生型大豆葉片總DNA。對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照，獲取電泳圖，見(jiàn)附圖6和附圖7所示。由附圖6和附圖7可知，4號(hào)植株和6號(hào)植株經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性植株。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染的裝置，其特征在于包括培養(yǎng)皿和培養(yǎng)皿蓋，在培養(yǎng)皿中固定有一基板，基板上設(shè)置有貫通柱孔，所述貫通柱孔至少下端伸出基板并保證其下端底部與培養(yǎng)皿底距離為Irnm 2mm ;所述貫通柱孔的孔內(nèi)徑大小與外植體莖徑大小相適配。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于包括培養(yǎng)皿和培養(yǎng)皿蓋，在培養(yǎng)皿中固定有一基板，所述基板為用于核苷酸片段擴(kuò)增的PCR板；切掉PCR板底部的小管形成貫通柱孔，保留PCR板四個(gè)角上的小管作為支架，置于培養(yǎng)皿中。
3.一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染方法，其特征在于包括以下步驟 (1)制備用于局部侵染處理下胚軸外植體的農(nóng)桿菌菌液； (2)獲取大豆下胚軸外植體供體材料和下胚軸外植體； (3)將下胚軸外植體插入權(quán)利要求I或2所述裝置的貫通柱孔中，使下胚軸外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下接觸培養(yǎng)皿底，權(quán)利要求I或2所述裝置的培養(yǎng)皿中倒入BA處理溶液至Imm 2mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20min后倒掉BA溶液； (4)對(duì)經(jīng)步驟(3)處理的下胚軸外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染前的預(yù)培養(yǎng)； (5)將經(jīng)過(guò)步驟(4)預(yù)培養(yǎng)后的下胚軸外植體插入權(quán)利要求I或2所述裝置的貫通柱孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下接觸培養(yǎng)皿底，權(quán)利要求I或2所述裝置的培養(yǎng)皿中倒入步驟(I)所述的農(nóng)桿菌菌液至Imm 2mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20 min后倒掉農(nóng)桿菌菌液； (6)對(duì)侵染后的下胚軸外植體進(jìn)行共培養(yǎng)； (7)對(duì)侵染后的下胚軸外植體進(jìn)行恢復(fù)再生培養(yǎng)； (8)對(duì)侵染后的下胚軸外植體再生的不定芽進(jìn)行篩選培養(yǎng)； O)抗性芽生根培養(yǎng)與抗性苗馴化移栽； 其中，步驟(4)所述預(yù)培養(yǎng)為I 2天；步驟(6)所述共培養(yǎng)為3 6天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的侵染方法，其特征在于步驟(4)所述預(yù)培養(yǎng)為I天。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的侵染方法，其特征在于步驟(6)所述共培養(yǎng)為3天。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的侵染方法，其特征在于包括以下步驟 (1)用已滅菌的接種環(huán)蘸取EHA105農(nóng)桿菌菌種菌液，在固體培養(yǎng)基上劃線接種之后，培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，再用接種針挑取單菌落接種至盛有液體農(nóng)桿菌培養(yǎng)基的大離心管中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，離心，保留沉淀，再向大離心管沉淀中加入液體共培養(yǎng)基，懸浮沉淀，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，調(diào)整菌液的OD值為O. 5 I. O ; (2)大豆種子經(jīng)滅菌后接種至無(wú)激素MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得大豆幼苗作為下胚軸外植體供體材料，從幼苗切割下胚軸切段為外植體； (3)把切割好的下胚軸外植體插入權(quán)利要求I或2所述裝置的貫通柱孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下接觸培養(yǎng)皿底，然后所述裝置的培養(yǎng)皿中倒入BA處理溶液至Imm 2mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚軸外植體，放置在無(wú)菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的BA溶液； (4)把經(jīng)過(guò)步驟(3)BA溶液處理后的外植體以豎插方式接種至無(wú)激素MSB5培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)；(5)把經(jīng)過(guò)步驟(4)預(yù)培養(yǎng)后的下胚軸外植體插入權(quán)利要求I或2所述裝置的貫通柱孔中，使外植體的形態(tài)學(xué)上端朝下接觸培養(yǎng)皿底，然后向所述裝置的培養(yǎng)皿中倒入步驟(I)所述的農(nóng)桿菌菌液至Imm 2mm深度，蓋上培養(yǎng)皿蓋，靜置20 min后倒掉農(nóng)桿菌菌液，取出下胚軸外植體，放置在無(wú)菌吸水紙上，吸去外植體表面殘留的農(nóng)桿菌菌液； (6)把經(jīng)過(guò)步驟(5)農(nóng)桿菌局部侵染后的下胚軸外植體以外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上的豎插方式接種至無(wú)抗生素的固體共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)； (7)把經(jīng)過(guò)步驟(6)共培養(yǎng)后的下胚軸外植體以外植體的形態(tài)學(xué)上端朝上的豎插方式接種至無(wú)抗生素的恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)； (8)把經(jīng)過(guò)步驟(7)所述恢復(fù)培養(yǎng)后已經(jīng)再生不定芽的下胚軸外植體以橫放方式接種至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)； (9)把經(jīng)過(guò)步驟(8)篩選培養(yǎng)后仍然鮮綠的抗性芽從外植體上切割分離Icm 2cm，以豎插方式接種至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取出生根的抗性苗，洗凈抗性苗根上的培養(yǎng)基后，栽植到干凈的細(xì)砂基質(zhì)中保濕煉苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的侵染方法，其特征在于步驟(I)所述農(nóng)桿菌培養(yǎng)基5g/L牛肉浸膏+lg/L 酵母膏+5 g/L 蛋白胨+5 g/L 鹿糖+0.4 g/100 mL MgSO4 · 7H20,用 I mg/LNaOH溶液調(diào)整pH至7. 4，培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100mg/mL氯霉素母液和50 mg/mL的卡那霉素母液,使兩者終濃度分別為100 mg/L和50 mg/L ;其中固體培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂； 步驟(I)所述液體共培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分+500 mg/L水解絡(luò)蛋白+30 g/L蔗糖+100 mg/L乙酰丁香酮，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH至5. 5;培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L ； 步驟(2)所述MSB5培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分+25 g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH值為5. 8 6. O ; 步驟(3)所述BA處理溶液的配制用I mg/L NaOH溶液充分溶解BA藥品，再用去離子水定容，配制成30 mg/L的BA處理溶液，采用I mg/L HCl溶液調(diào)整pH值為5. 8 6. O后滅菌處理； 步驟(7)所述恢復(fù)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分+25g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH值為5. 8 6. O后滅菌處理； 步驟(8)所述篩選培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分+25g/L蔗糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌劑+篩選劑+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH值為5. 8 6. 0，培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的抑菌劑母液和篩選劑母液至所定濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的侵染方法，其特征在于步驟(4)所述預(yù)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分+25 g/L鹿糖+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂,用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH值為5. 8 6. O后滅菌處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的侵染方法，其特征在于步驟(6)所述共培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分+500 mg/L水解絡(luò)蛋白+30 g/L鹿糖+100 mg/L乙酰丁香酮+8 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH值為5. 5，培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的100 mg/mL乙酰丁香酮母液，使其終濃度為100 mg/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的侵染方法，其特征在于步驟(9)所述生根培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)成分+B5培養(yǎng)基配方的有機(jī)成分+0. 5 mg/L NAA +25 g/L鹿糖+300 mg/L蛋白胨+抑菌劑+7 g/L瓊脂，用I mg/L NaOH溶液調(diào)整pH值為5. 8 6. 0，培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入經(jīng)過(guò)孔徑為O. 22微米濾膜過(guò)濾滅菌的抑菌劑母液至所定濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌局部侵染的裝置和侵染方法。為了抑制外植體表面的農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上的過(guò)旺增殖以防止植物材料的腐爛并且不使用抗生素，本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的裝置成功應(yīng)用于大豆下胚軸外植體轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染，避免把整個(gè)外植體浸泡在農(nóng)桿菌菌液中，只對(duì)有再生不定芽潛能的下胚軸上端切口附近進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染處理。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)侵染方法條件進(jìn)行了優(yōu)化。應(yīng)用本發(fā)明可以降低大豆下胚軸外植體遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的藥劑成本和提高轉(zhuǎn)化工作效率。
文檔編號(hào)C12M1/00GK102827756SQ20121020969
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者楊躍生, 劉穎, 張奇, 于磊, 郭振飛, 年海 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)