專利名稱：菊糖芽孢乳桿菌的d-乳酸脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)的
D-乳酸脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
3-苯基乳酸，即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種重要的化學(xué)合成前體，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和生物合成等領(lǐng)域。近幾年來，它作為一種新型的抑菌劑又受到食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。3-苯基乳酸的第二個(gè)碳原子是手性碳，有兩種構(gòu)型，即D-苯基乳酸和L-苯基乳 酸，這兩種構(gòu)型化合物對(duì)生物體的作用及其在醫(yī)藥、化工方面的應(yīng)用不同。D-苯基乳酸，又名D-3-苯基乳酸、D-2-羥基-3-苯丙酸或(R) -2-羥基-3-苯基丙酸(CAS號(hào)7326_19_4)。D-苯基乳酸可用于合成降血糖藥、驅(qū)腸蟲藥，并對(duì)人體內(nèi)類固醇的水平有一定的調(diào)節(jié)作用。D-苯基乳酸是用于制備4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸的手性砌塊，也是制備降血糖助劑英格列酮以及15N-標(biāo)記苯基丙氨酸的起始物。3-苯基乳酸的制備主要為化學(xué)合成法。3-苯基乳酸的化學(xué)合成主要有以下幾種方法(I)吖內(nèi)酯鋅汞齊還原法；(2)由β -苯基丙烯酸鋅汞齊還原法；(3)用苯甲醛經(jīng)縮合、開環(huán)、水解、還原等幾步反應(yīng)制得。這些方法都在不同程度上存在技術(shù)復(fù)雜、污染環(huán)境、產(chǎn)品不純、光學(xué)純度低而不能得到單一構(gòu)型化合物等缺點(diǎn)，因而近幾年來轉(zhuǎn)向了生物合成法的開發(fā)與研究。1996年，日本學(xué)者Hashimoto等從土壤中篩選到了一株假單胞菌(Pseudomonas sp.),能夠轉(zhuǎn)化苯乙醒_氰醇為D-苯基乳酸,生成的D-苯基乳酸光學(xué)純度僅為75%。2002年，Katrin等從青忙草中也分離到了一株植質(zhì)乳桿菌(Lactobacillusplantarum),它產(chǎn)生的D-苯基乳酸光學(xué)純度僅為90%。美國Diversa公司開發(fā)了利用腈酶(EC 3. 5. 5. I)制備光學(xué)純度大于99%的D-苯基乳酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白，該蛋白來源于菊糖芽 包乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)。本發(fā)明所提供的具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脫氫酶活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。序列表中序列I由335個(gè)氨基酸殘基組成。為了便于所述蛋白的純化，可在由序列表中序列I的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
表標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脫氫酶活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子是編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因；所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子 1)編碼序列為序列表中序列2的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有80%以上同源性且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；所述重組載體為重組克隆載體或重組表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求I所述的蛋白在作為D-乳酸脫氫酶中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的蛋白、或權(quán)利要求2或3所述的基因在如下(a)或(b)中的應(yīng)用 (a)催化丙酮酸生成D-乳酸； (b)催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸。
7.一種制備D-乳酸脫氫酶的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，即為D-乳酸脫氫酶。
8.利用權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)生產(chǎn)D-苯基乳酸的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)、苯基丙酮酸、和NADH或NADPH，在27-35°C，pH5. 0-6.0的條件下反應(yīng)，得到D-苯基乳酸。
9.利用權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)生產(chǎn)D-乳酸的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)、丙酮酸、和NADH或NADPH，在27-35°C，pH5. 0-6. 0的條件下反應(yīng)，得到D-乳酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)的D-乳酸脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的D-乳酸脫氫酶是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脫氫酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的D-乳酸脫氫酶能夠以NADH為輔酶，也可以NADPH為輔酶，催化丙酮酸生成D-乳酸，也能以NADH為輔酶催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸，且生成產(chǎn)物光學(xué)純度可達(dá)100%(無L型產(chǎn)物生成)，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102766608SQ20121021073
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者于波, 朱凌峰, 王麗敏, 馬延和 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所