專利名稱：一種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有高分化潛能的細(xì)胞與一般的體細(xì)胞不同，擁有分化成多種身體組織，如骨骼，皮膚，心臟，神經(jīng)，等等，的能力。它在再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用個案在近年不斷上升，細(xì)胞來源主要從人類組織提取并經(jīng)過體外培植而獲得所需數(shù)目的干細(xì)胞供治療時使用，但由于細(xì)胞體外增植時所用的傳統(tǒng)培養(yǎng)液也含有5%至20%的動物血清，如果所用血清含有不能治愈的病毒或病原體(如瘋牛癥的朊毒體(prion))，接受細(xì)胞治療的病人便會因而染病，后果十分嚴(yán)重。由于培養(yǎng)液中主要刺激細(xì)胞生長的成份是血清，科 學(xué)家便嘗試用人類血清代替動物血清(Patent US 7，951，593 B2)。另外由于血清中刺激細(xì)胞生長的物質(zhì)是一些生長因子(cytokine)，亦有研究小組將不同的生長因子組合加入現(xiàn)有的培養(yǎng)基(如DMEM，RPMI)中以取代傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)液(Jung SH et al.，2011)。現(xiàn)有技術(shù)中的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液主要有以下技術(shù)方案利用人類血清加上胰島素及bFGF去代替動物血清以培養(yǎng)牙齦干細(xì)胞(Patent US 7，951，593B2);利用5%血小板裂解物(platelet lysate)加上2IU/ml heparin代替10%牛血清去培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞(Doucet C et al.，2005);利用 DMEM:F_12 培養(yǎng)基加上 L-glutamine, Iipidconcentrate, sodium biocardonate，HEPES， insulin, transferring, putrescine，progesterone, fetuin，hydrocortisone,L—ascorbic acid—2-phosphate，human serumalbumin, b-FGF, TGF-bate 1，但該配方不能加入抗生素培養(yǎng)人類骨髓干細(xì)胞(Jung SHet al.，2011);利用 GMEM 培養(yǎng)基力口上 L-glutamine, non essential amino acids, humanbFGF, human EGF, human thrombin, B27, N2. Glucose, ARAC,培養(yǎng)人類脂肪干細(xì)胞以懸浮性的方式生長(Dromard C et al. , 2011);等等。上述現(xiàn)有方案的缺點是I、含有血清的配方方案中，會用到來源自動物的血清，但血清的內(nèi)含有各種未確定的物質(zhì)及蛋白，細(xì)胞容易受被科學(xué)界確定的動物病毒和細(xì)菌所污染；2、現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)液是用成份未能完全確定的血制品代替血清，細(xì)胞受污染的風(fēng)險也不比利用血清的低；3、現(xiàn)有用于間充質(zhì)干細(xì)胞生長的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)數(shù)代后干細(xì)胞便開始分化而失去干細(xì)胞之可塑性及醫(yī)療效能；4、現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)液配方十分復(fù)雜，所需材料成本比起用動物血清為高，令其普及性十分低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種配方簡單、成本低且安全性高的無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液。
本發(fā)明實現(xiàn)發(fā)明目的采用的技術(shù)方案是，一種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，包含有無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基、B27無血清添加劑、bFGF和EGF，所述培養(yǎng)液還包含有0. 5-2mg/ml的胎球蛋白以及抗生素。優(yōu)選地,所述抗生素由青霉素和鏈霉素組成,青霉素的含量為50-150units/ml,鏈霉素的含量為50-150units/ml。優(yōu)選地，所述無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基為alpha-MEM培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述B27無血清添加劑的添加量為所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液體積的1-3%。優(yōu)選地，所述bFGF的含量為10-50ng/ml。優(yōu)選地，所述EGF的含量為10-50ng/ml。本發(fā)明的有益效果是I、本發(fā)明的培養(yǎng)液中不含有動物血清，具有較高的安全性，且配方成分確定，適合臨床治療之用；2、相對于利用GMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的無血清培養(yǎng)液(Dromard C et al.，2011),月旨肪干細(xì)胞會在培養(yǎng)瓶中以懸浮性的方式生長，有別于一般間充質(zhì)干細(xì)胞附底生長的特性而令其生長速度較慢；而一些無血清的配方則不能加入抗生素，但此舉會增加培養(yǎng)時細(xì)胞受細(xì)菌的污染機會(Jung SH et al.,2011);本發(fā)明可以讓人類脂肪干細(xì)胞正常的附于培養(yǎng)器皿的表面生長，配方成分中可加入抗生素，相比一般的無血清培養(yǎng)液的配方簡單；3、相對于現(xiàn)有配方培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，細(xì)胞于兩代后便開始分化而生長減慢，而采用本發(fā)明配方培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)測試未發(fā)現(xiàn)分化和生長減慢的現(xiàn)象，十分適合脂肪干細(xì)胞及牙齦干細(xì)胞之生長。
具體實施例方式實施例I:將20cc脂肪組織用磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入膠原蛋白酶(Type II，50-100U/ml)消化組織一小時，將消化物離心并利用磷酸鹽緩沖液清洗所得細(xì)胞3次；將細(xì)胞混合7ml培養(yǎng)液放入T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，本實施例的培養(yǎng)液組分為alpha-MEM培養(yǎng)基、體積比1%的B27無血清添加劑、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的EGF、0. 5mg/ml的胎球蛋白、各100units/ml的青霉素和鏈霉素，采用以上培養(yǎng)液，每3天更換培養(yǎng)液一次，當(dāng)細(xì)胞生長滿一個T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶時檢測，已培養(yǎng)出了不少于一百萬個的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。實施例2 用體積比70%的乙醇溶液給人體消毒口腔，然后利用2mm直徑的活檢器在人體牙銀中抽取組織樣本(不少于2_x2_x2mm),用磷酸鹽緩沖液清洗3次,加入膠原蛋白酶(Type II，50-100U/ml)消化組織一小時，將消化物離心并利用磷酸鹽緩沖液清洗所得細(xì)胞3次；將牙齦組織細(xì)胞混合IOml培養(yǎng)液放入T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，本實施例的培養(yǎng)液組分為DMEM/F12無血清培養(yǎng)基、體積比3%的B27無血清添加劑、50ng/ml的bFGF、50ng/ml的EGF、2mg/ml的胎球蛋白、各150units/ml的青霉素和鏈霉素,采用以上培養(yǎng)液,每3天更換培養(yǎng)液一次，當(dāng)細(xì)胞生長滿一個T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶時檢測，已培養(yǎng)出了不少于一百萬個的牙齦組織間充質(zhì)干細(xì)胞。、
本實施例相對于利用專利(US 7，951，593B2)的配方培養(yǎng)牙齦干細(xì)胞，專利(US7，951，593B2)的培養(yǎng)液配方中需要血小板裂解物，但裂解物中的成份是未能完全確定的，安全性低，而本實施例相對而言具有更高的安全性。實施例3 將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(不少于40萬個細(xì)胞)解凍至37度，利用磷酸鹽緩沖液清洗所得細(xì)胞2次，將細(xì)胞混合20ml培養(yǎng)液放入T-150細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，本實施例的培養(yǎng)液組分為alpha-MEM培養(yǎng)基、體積比2%的B27無血清添加劑、20ng/ml的bFGF、20ng/ml的EGF、lmg/ml的胎球蛋白、各100units/ml的青霉素和鏈霉素,采用以上培養(yǎng)液,每3天更換培養(yǎng)液一次，當(dāng)細(xì)胞生長滿一個T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶時檢測，已培養(yǎng)出了不少于三百萬個的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。相比于利用Dromard C et al.，2011的無血清培養(yǎng)液配方培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞會在培養(yǎng)瓶中以懸浮性的方式生長，而本實施例的間充質(zhì)干細(xì)胞可附于培養(yǎng)瓶生長，形成面生長的特性。應(yīng)當(dāng)理解的是，作為本發(fā)明上述實施例的擴展，參考專利(US7，109，032B2)的配方培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，也可以加入以下多種生長因子roGF，F(xiàn)GF-2, IGF-1, HF, SCF, EGF中的一種或多種，但為控制培養(yǎng)液的成本，發(fā)明只需加入EGF，bFGF, B27三種生長因子，具有較低的成本。同時，相比于Jung SH et al.，2011的無血清培養(yǎng)液配方培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，本發(fā)明能加入抗生素，從而大大減少細(xì)胞受細(xì)菌感染的機會。作為具體實施方式
，本發(fā)明中的B27無血清添加劑可直接購買型號為B-27 Serum-Free Suppl ement (50X)的無血清添加劑。最后應(yīng)說明的是以上實施例僅用以說明本發(fā)明而并非限制本發(fā)明所描述的技術(shù)方案；因此盡管本說明書參照上述的各個實施例對本發(fā)明已進行了詳細(xì)的說明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對本發(fā)明進行修改或等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的精神和范圍的技術(shù)方案及其改進，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，包含有無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基、B27無血清添加劑、bFGF和EGF，其特征在于所述培養(yǎng)液還包含有0. 5-2mg/ml的胎球蛋白以及抗生素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述抗生素由青霉素和鏈霉素組成，青霉素的含量為50-150units/ml，鏈霉素的含量為50_150units/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基為alpha-MEM培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述B27無血清添加劑的添加量為所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液體積的1_3%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述bFGF的含量為10_50ng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述EGF的含量為10_50ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供一種配方簡單、成本低且安全性高的無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，包含有無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基、B27無血清添加劑、bFGF和EGF,所述培養(yǎng)液還包含有胎球蛋白以及抗生素。本發(fā)明的培養(yǎng)液中不含有動物血清，具有較高的安全性，且配方成分確定，適合臨床治療之用；同時，可以讓人類脂肪干細(xì)胞正常的附于培養(yǎng)器皿的表面生長,配方成分中可加入抗生素,相比一般的無血清培養(yǎng)液的配方簡單；相對于現(xiàn)有配方培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞,細(xì)胞于兩代后便開始分化而生長減慢，而采用本發(fā)明配方培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)測試未發(fā)現(xiàn)分化和生長減慢的現(xiàn)象，十分適合脂肪干細(xì)胞及牙齦干細(xì)胞之生長。
文檔編號C12N5/0775GK102703385SQ20121021312
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者周向榮, 杜潔華, 鄧銘權(quán) 申請人:亞太干細(xì)胞科研中心有限公司