專(zhuān)利名稱(chēng)：一種間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的美容產(chǎn)品(如蘋(píng)果干細(xì)胞)已經(jīng)為大眾所接受，而且學(xué)術(shù)界對(duì)于來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞的分泌素的潛在醫(yī)療用途正展開(kāi)深入的探討，近年已有分泌素的正面醫(yī)療效果的文獻(xiàn)出現(xiàn)，如改善皮膚皺紋，心衰竭，腦退化，視力，壽命延長(zhǎng)，等等。近年有大量文獻(xiàn)亦指出分泌素的其它潛在醫(yī)藥價(jià)值，暫時(shí)研究得最深入的便是其改善心臟衰竭的功用，研究指出干細(xì)胞分泌物中所含的外吐小體(exosome)具有一定醫(yī)療用途如美國(guó)專(zhuān)利2011/0003008A1所揭示的。雖然間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的市場(chǎng)潛力很大，但是其大量培養(yǎng)存在較大的困難，主要表現(xiàn)為人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)所需要較大的表面積。 現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)主要是讓間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)數(shù)天，而后將培養(yǎng)液更換為不含牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24至48小時(shí)后取其上清液便是間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素?，F(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)為I、主要利用細(xì)胞培養(yǎng)瓶去收集分泌素，而由于間充質(zhì)干細(xì)胞的依附生長(zhǎng)之特性，大量生產(chǎn)分泌素所需要的細(xì)胞數(shù)目會(huì)花上非常多的培養(yǎng)瓶及空間，培養(yǎng)起來(lái)花時(shí)而且成本聞昂；2、收集分泌素時(shí)需要大量的培養(yǎng)液，成本非常高；3、分泌素中的蛋白質(zhì)在濃縮時(shí)會(huì)大量流失，而且產(chǎn)品中帶有高鹽分及細(xì)胞培養(yǎng)液等雜質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種能大量生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品純度高的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的采用的技術(shù)方案是，一種間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟a.在生物反應(yīng)器中對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到目標(biāo)數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液對(duì)生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細(xì)胞和微載體進(jìn)行清洗；b.向生物反應(yīng)器中注入細(xì)胞培養(yǎng)基底液和磷酸鹽緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)；c.收集生物反應(yīng)器中的上清液，并將所述上清液濃縮得到蛋白質(zhì)濃縮液；d.以純水稀釋所述蛋白濃縮液，置于生物反應(yīng)器中，重復(fù)步驟b、c，得到的蛋白濃縮液中的蛋白即為間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素。優(yōu)選地，所述步驟a之前還包括培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細(xì)胞，并將間充質(zhì)干細(xì)胞注入到含有細(xì)胞培養(yǎng)液和微載體的生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細(xì)胞不少于I千萬(wàn)個(gè)每升。優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)液包含MEM培養(yǎng)基底液、牛血清以及抗生素。優(yōu)選地，所述步驟a中控制生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為40_60rpm，溫度36_38攝氏度，并提供二氧化碳?xì)怏w供應(yīng)的條件下對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述步驟a還包括在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中，于第24小時(shí)和第72小時(shí)分別向生物反應(yīng)器中注入新的細(xì)胞培養(yǎng)液。優(yōu)選地，所述步驟b中細(xì)胞培養(yǎng)基底液為DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基底液，所述DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基底液與所述磷酸鹽緩沖液的體積比為1/5至1/2。
優(yōu)選地，所述步驟c中通過(guò)以下方法進(jìn)行濃縮將上清液通過(guò)切向流過(guò)濾膜的方法進(jìn)行濃縮，得到蛋白濃縮液。優(yōu)選地，所述步驟d還包括對(duì)所述間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素進(jìn)行蛋白定量和分裝的步驟，最后通過(guò)冷凍干燥將所述間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素制成粉末，低溫保存。本發(fā)明的有益效果是I、本發(fā)明利用了生物反應(yīng)器技術(shù)替代傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶去制作間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素，大幅縮減成本及所需空間；例如要制作來(lái)自兩億個(gè)干細(xì)胞的分泌素，在傳統(tǒng)的方法上需要500個(gè)T150的細(xì)胞培養(yǎng)瓶；而本發(fā)明只需要一個(gè)3公升的生物反應(yīng)器，只相等于20個(gè)T150細(xì)胞培養(yǎng)瓶的體積；2、本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞兼容性高，可配合不同的間充質(zhì)干細(xì)胞作為源材料而制作出不同的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素如脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞等等；3、本發(fā)明于收集間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的過(guò)程中，通過(guò)向生物反應(yīng)器中注入細(xì)胞培養(yǎng)基底液和磷酸鹽緩沖液可以稀釋生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)液，達(dá)到安全地持續(xù)刺激間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞分泌蛋白的作用，從而能提高充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞分泌素的產(chǎn)量；4、傳統(tǒng)的方法只針對(duì)蛋白的濃縮而沒(méi)有去鹽的考慮，但是培養(yǎng)液中殘余的離子會(huì)讓產(chǎn)品使用者的血液離子濃度在短時(shí)間內(nèi)被大幅提升，影響體內(nèi)器官(尤其是心臟)的健康；本發(fā)明通過(guò)純水稀釋蛋白濃縮液的步驟，使產(chǎn)物得到去鹽純化處理(去鹽效果達(dá)95%以上)，能有效地去除分泌素中的非間充質(zhì)干細(xì)胞，大幅提高產(chǎn)品的安全性及效果，讓所生產(chǎn)出的分泌素能夠適合各方面的應(yīng)用。5、本發(fā)明所制作出的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素凍干粉含有完整的外吐小體，是間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的有效成份。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I:培養(yǎng)2億個(gè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素首先將4百萬(wàn)個(gè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞置于含有細(xì)胞培養(yǎng)液的T-150培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液包含有10%的牛血清、1%的抗生素以及alpha-MEM培養(yǎng)基底液，培養(yǎng)出3千萬(wàn)個(gè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；然后將上述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至放有3克微載體和400亳升細(xì)胞培養(yǎng)液的3公升生物反應(yīng)器中，在轉(zhuǎn)速維持于40rpm的條件下培養(yǎng)；于第24小時(shí)及第72小時(shí)分別向生物反應(yīng)器中注入200毫升及500毫升的細(xì)胞培養(yǎng)液.持續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)至脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目到達(dá)2億個(gè)的水平(約需6天)；當(dāng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目達(dá)標(biāo)時(shí)利用磷酸鹽緩沖液將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及其附著的微載體清洗三次，然后向生物反應(yīng)器中注入2升磷酸鹽緩沖液及I升DMEM/F12培養(yǎng)基底液，繼續(xù)培養(yǎng)，于48小時(shí)后收集生物反應(yīng)器中的上清液，利用0.22um的濾膜過(guò)濾上清液以移除當(dāng)中殘余的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，再使用帶有濾孔為5kDa的濾膜的切向流過(guò)濾器將上清液中的蛋白濃縮及去鹽，最后將濃縮液的蛋白利用冷凍干燥機(jī)制成粉末并保存于-80度，得到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素成品。實(shí)施例2:培養(yǎng)2億個(gè)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素本實(shí)施例與實(shí)施例I的培養(yǎng)方法大致相同，只是利用了牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞代替脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，于3公升生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)時(shí)間可由總時(shí)間9天減少至6天，而收集牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的時(shí)間可增加至72小時(shí)。實(shí)施例3:培養(yǎng)2千萬(wàn)個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素本實(shí)施例的培養(yǎng)方法與實(shí)施例I也大致相同，只是利用了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞代替脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，將剛解凍的4百萬(wàn)個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞直接放入含有0. 8克微載體和300亳升培養(yǎng)液的500亳升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，于72小時(shí)生物反應(yīng)器更新細(xì)胞培養(yǎng)液，生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)時(shí)間可由總時(shí)間9天增長(zhǎng)至10至12天.實(shí)施例4:培養(yǎng)2億個(gè)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素本實(shí)施例的培養(yǎng)方法與實(shí)施例I也大致相同，只是利用了牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞代替脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，收集牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素后的微載體上的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞可用膠原蛋白酶消化I小時(shí)以釋出其中的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞，得到的細(xì)胞可被再培養(yǎng)或冷凍備用。作為上述實(shí)施方式中培養(yǎng)方法的替代方案，還可以用透析膜代替切向流過(guò)濾器將間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素進(jìn)行去鹽，以及可以用食品干燥機(jī)代替凍干粉機(jī)將充質(zhì)干細(xì)胞分泌素制成粉末。最后應(yīng)說(shuō)明的是以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明而并非限制本發(fā)明所描述的技術(shù)方案；因此盡管本說(shuō)明書(shū)參照上述的各個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明已進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的精神和范圍的技術(shù)方案及其改進(jìn)，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。權(quán)利要求
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟 a.在生物反應(yīng)器中對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到目標(biāo)數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液對(duì)生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細(xì)胞和微載體進(jìn)行清洗； b.向生物反應(yīng)器中注入細(xì)胞培養(yǎng)基底液和磷酸鹽緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)； c.收集生物反應(yīng)器中的上清液，并將所述上清液濃縮得到蛋白質(zhì)濃縮液； d.以純水稀釋所述蛋白濃縮液，置于生物反應(yīng)器中，重復(fù)步驟b、c，得到的蛋白濃縮液中的蛋白即為間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟a之前還包括培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細(xì)胞，并將間充質(zhì)干細(xì)胞注入到含有細(xì)胞培養(yǎng)液和微載體的生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細(xì)胞不少于I千萬(wàn)個(gè)每升。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)液包含MEM培養(yǎng)基底液、牛血清以及抗生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟a中控制生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為40-60rpm，溫度36-38攝氏度，并提供二氧化碳?xì)怏w供應(yīng)的條件下對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟a還包括在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中，于第24小時(shí)和第72小時(shí)分別向生物反應(yīng)器中注入新的細(xì)胞培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟b中細(xì)胞培養(yǎng)基底液為DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基底液，所述DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基底液與所述磷酸鹽緩沖液的體積比為1/5至1/2。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟c中通過(guò)以下方法進(jìn)行濃縮將上清液通過(guò)切向流過(guò)濾膜的方法進(jìn)行濃縮，得到蛋白濃縮液。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟d還包括對(duì)所述間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素進(jìn)行蛋白定量和分裝的步驟，最后通過(guò)冷凍干燥將所述間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素制成粉末，低溫保存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能大量生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品純度高的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的培養(yǎng)方法，利用了生物反應(yīng)器技術(shù)替代傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶去制作間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素,大幅縮減成本及所需空間；且使用的間充質(zhì)干細(xì)胞兼容性高，能安全地持續(xù)刺激間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞分泌蛋白，提高了充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞分泌素的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102732586SQ20121021313
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者周向榮, 鄧銘權(quán), 陳詠敏 申請(qǐng)人:亞太干細(xì)胞科研中心有限公司