專利名稱：利用非暗培養(yǎng)葉片構(gòu)建棉花bac文庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明具體涉及利用非暗培養(yǎng)葉片構(gòu)建棉花BAC文庫的方法。
背景技術(shù)：
目前，所構(gòu)建的棉花細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome, BAC)文庫大多是栽培種，且所選材料都為棉花種子催芽后暗培養(yǎng)得到的黃化苗子葉。暗培養(yǎng)處理可大大減少了葉綠體及酚類物質(zhì)的生成，降低了其在DNA提取過程中的影響且使細(xì)胞易于破裂，用暗培養(yǎng)的幼苗比較容易獲得較純的DNA。然而，傳統(tǒng)的棉花BAC文庫構(gòu)建方法取材范圍較窄，而且需要對材料進(jìn)行暗培養(yǎng)處理，操作復(fù)雜、費時；構(gòu)建BAC文庫對材料的需求量大，一般需要大于40g,傳統(tǒng)的棉花BAC文庫構(gòu)建方法用種量大,很難用于種殼較硬，發(fā)芽較難的材料，不能用于種子量少或是沒有種子的棉花材料BAC文庫構(gòu)建。為了簡化BAC文庫構(gòu)建方法，并且使此方法適合任何棉花BAC文庫的構(gòu)建，較為有效的方法是選用不需要暗處理的現(xiàn)有棉株葉片作為構(gòu)建BAC文庫的材料，這樣既節(jié)省了種子，又避免了發(fā)芽及暗培養(yǎng)操作，還可以用于種子量少的材料或沒有種子的野生棉BAC文庫的構(gòu)建。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，選用不需要暗處理的棉株葉片為材料，對BAC文庫構(gòu)建過程中的某些環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，也可以成功構(gòu)建棉花BAC文庫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人長期探索棉花BAC文庫構(gòu)建方法，選用不需要暗處理的棉株的葉片，對BAC文庫構(gòu)建過程中的細(xì)胞核DNA的提取、酶切片段的兩次選擇進(jìn)行了一些改進(jìn)，形成了一套成熟的棉花BAC文庫構(gòu)建技術(shù)體系。該方法適用于所有棉花材料的BAC文庫的構(gòu)建，包括繁殖種子量少或無種子宿生保存的棉花材料的BAC文庫的構(gòu)建，即利用非暗培養(yǎng)棉株葉片構(gòu)建BAC文庫的方法。因此，本發(fā)明的目的是提供利用非暗培養(yǎng)棉株葉片構(gòu)建BAC文庫的方法。根據(jù)本 發(fā)明的方法，包括以下步驟I)棉株葉片的收集摘取田間或花盆正常生長、剛平展的幼嫩棉花葉片；2)提取高分子量細(xì)胞核DNA，將細(xì)胞核包埋在低熔點瓊脂糖中，然后裂解釋放核DNA ；3)高分子量核DNA的酶切及兩次選擇，采用脈沖場凝膠電泳分離，對于第一次選擇脈沖的起始時間10s，選出120 300kb的DNA片段，分成120 200kb和200 300kb兩個范圍進(jìn)行第二次選擇，對于第二次選擇起始和終止時間分別為4s_4s，電泳時間14h，選出120 200kb和200 300kb的DNA片段；4)分別對存在于膠塊中的120 200kb，200 300kb DNA進(jìn)行回收，與載體連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
5)檢測陽性克隆的插入片段是否滿足實驗需要。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述方法包括步驟如下I)棉株葉片的選取選取田間或花盆生長正常、無病、無蟲害的幼嫩葉片。2)高分子量細(xì)胞核DNA的提取采用一種能盡可能去除葉綠體、線粒體以及防止酚類氧化的細(xì)胞核提取方法，提取完整的細(xì)胞核，將細(xì)胞核包埋在低熔點瓊脂糖中形成膠塊防止核DNA的機(jī)械斷裂。將膠塊置于裂解液中于50°C下將細(xì)胞核裂解，使核DNA釋放出來。3)高分子量DNA的部分酶切及兩次選擇構(gòu)建BAC文庫所需要的是120 300kb范圍內(nèi)的DNA，需要將完整的細(xì)胞核DNA進(jìn)行酶切，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所用的限制性內(nèi)切酶為Hindlll，采用一系列的酶濃度來確定最適的酶切濃度，選取酶切后大部分DNA片段集中到120 300kb的酶濃度為最適酶濃度，以此最適酶濃度對所有膠塊進(jìn)行大量酶切；為了使插入片段整齊一致，對酶切后的DNA采用兩次選擇，采用脈沖場凝膠電泳這一技術(shù)來分離大片段。第一次選擇選出120 300kb的DNA，分成120 200kb，200 ·300kb兩個范圍進(jìn)行第二次選擇。4)大片段DNA的回收、連接及轉(zhuǎn)化采用一種對DNA分子粘性末端破壞程度較小的電洗脫的方法分別對存在于膠塊中的120 200kb，200 300kbDNA進(jìn)行回收；通過設(shè)置多種DNA和載體的連接比例來確定最適連接摩爾比，然后以最適連接摩爾比進(jìn)連接；連接產(chǎn)物采用一種轉(zhuǎn)化效率高的電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。5)插入片段的檢測隨機(jī)挑取陽性克隆，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，檢測陽性克隆的插入片段的大小及有無。與傳統(tǒng)BAC文庫構(gòu)建方法相比，本發(fā)明具以下優(yōu)點I)避免了傳統(tǒng)BAC文庫構(gòu)建過程中利用種子發(fā)芽進(jìn)行暗培養(yǎng)處理來獲取大量黃化苗子葉這一復(fù)雜步驟。2)首次利用非暗培養(yǎng)的成株葉片進(jìn)行棉花BAC文庫構(gòu)建，避免了大量發(fā)芽，使得材料的獲取簡單易行。3)利用非暗培養(yǎng)的成株葉片作為實驗材料，對于有種子的棉花材料而言所需種子量減小；對于沒有種子的棉花材料而言就不需要用種子了，只要棉花植株即可。4)從取材方面來看，利用成株葉片構(gòu)建BAC文庫，解決了某些野生棉發(fā)芽困難的問題，使無種子或種子量少的材料構(gòu)建BAC文庫成為可能。5)在傳統(tǒng)BAC文庫構(gòu)建方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，擴(kuò)大了 BAC文庫構(gòu)建的材料來源，該法可適用于所有棉花材料，包括栽培棉和野生棉，也包括栽培棉的無毒棉(低酚棉)類型。6)BAC文庫構(gòu)建過程中，對第一次選擇這一環(huán)節(jié)的時間進(jìn)行了改進(jìn)，即將之前使用的起始脈沖時間50s改為了 10s，結(jié)果回收到了以前實驗過程中期望得到，但是一直沒有得到的100 200kb范圍內(nèi)的DNA片段，回收到的片段很集中(圖4)，大大提高了轉(zhuǎn)化效率。7) BAC文庫構(gòu)建過程中，對第二次選擇時凝膠的選取進(jìn)行了改進(jìn)將之前在低熔點瓊脂糖凝膠中進(jìn)行，改為在普通瓊脂糖中進(jìn)行，通過下一步電洗脫過程中適當(dāng)延長洗脫時間可對DNA進(jìn)行了較好的回收。這一改進(jìn)大大簡化了實驗步驟，節(jié)省了實驗費用。


圖I :非暗培養(yǎng)毛棉成株葉片細(xì)胞核包埋制備的膠塊。圖2 :大片段DNA的質(zhì)量檢測。M PFGE Marker ;2_8泳道為將膠塊切成1/2、1/4、1/8膠塊中的DNA。圖3 :大片段DNA最適酶用量的確定。M PFGE Marker ;2_7泳道為l/2plug分別用 0. 4U、0. 8U、1. 2U、3U、4U、5U 的酶切結(jié)果。圖4-1 :脈沖時間改進(jìn)前后兩次選擇對比，改進(jìn)前的兩次選擇其中，A為DNA酶切后第一次選擇，B為第二次選擇，第一次選擇脈沖電泳條件為起始時間50s，終止時間50s ；第二次選擇脈沖電泳條件為起始時間4s，終止時間4s。圖4-2 :脈沖時間改進(jìn)前后兩次選擇對比，改進(jìn)后的兩次選擇其中，A為DNA酶切 后第一次選擇，B為第二次選擇。第一次選擇脈沖電泳條件為起始時間10s，終止時間50s ；第二次選擇脈沖電泳條件與改進(jìn)前相同。圖5 電洗脫回收的大片段DNA濃度估測。1_9泳道為\ DNA,數(shù)字代表\ DNA的濃度(ng/ii L) ；10和11泳道為回收的120-200kb的待測DNA0圖6 :120 200kb DNA片段連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化結(jié)果。圖7 =BAC克隆插入片段大小檢測。1-14泳道為BAC單克隆；15_16為混合克隆的NotI酶切結(jié)果。
具體實施例方式實施例I利用毛棉非暗培養(yǎng)成株葉片構(gòu)建BAC文庫I.毛棉成株材料的選取選取大田生長正常、無病、無蟲害的非暗培養(yǎng)幼嫩葉片作為實驗材料。2.高分子量細(xì)胞核DNA的提取取葉片40g,迅速轉(zhuǎn)入液氮中研磨約Ih,然后將粉末轉(zhuǎn)入400mL預(yù)冷的Washbuffer(0. 08M KCl,0. OlM Trizma base,0. OlM EDTANa2, ImM Spermidine,ImMSpermine,0. 5MSucrose, 2%PVP40,0. 13%DIECA,0. 15% ^ -巰基乙醇和 0. 5%TritonX_100)中，冰上輕輕攪拌15-20min，用兩層紗布和2層微細(xì)濾布過濾到預(yù)冷的50mL離心管中，4°C、3200rpm、離心20min，去除上清。如果此次離心沉淀時還有一些綠色沉淀，可用毛刷將表層的綠色沉淀輕輕刷出，然后用Wash buffer對沉淀再次懸浮，并且適當(dāng)?shù)亟档碗x心速度，就可去除綠色沉淀。向沉淀中加入500 ii LI X HB (只是不含0. 5%TritonX_100，其他配方與Washbuffer相同)，用小毛刷輕輕懸浮沉淀，合并各離心管的懸浮液于一個離心管中，向離心管中加滿I XHB混勻，4°C、4000rpm、離心15min，用I XHB重復(fù)此步驟3次，最后在沉淀中加入適量的IXHB (不含￠-巰基乙醇)調(diào)整細(xì)胞核的濃度。將細(xì)胞核懸浮液和I. 5%的低熔點瓊脂糖于45°C水浴5min,然后兩者等體積混勻，45°C水浴5min,迅速將混合液加入plug mold中，冰上冷卻30min，待其充分凝固后，將膠塊放入含有蛋白酶K (lmg/mL)的裂解液中，在50°C雜交爐中裂解36h，中間換一次裂解液。去除裂解液，加入含PMSF (ImM)的50mL預(yù)冷的T10E10 (IOmM Tris-HClUOmM EDTA)，冰上輕輕震蕩2次，每次lh，再將膠塊放在不含PMSF的T10E1 (IOmMTris-HClUmM EDTA)中冰上清洗4次，每次lh，隨后將膠塊置于TltlE1中，4°C保存?zhèn)溆谩ｋS機(jī)挑取兩個膠塊進(jìn)行脈沖電泳，檢測膠塊質(zhì)量。脈沖電泳條件為1%瓊脂糖，0. 5 X TBE 緩沖液，11°C，泵 70，角度 120。, 6v/cm, 50s_50s, 18h。此法以非暗培養(yǎng)成株葉片為材料，采用細(xì)胞核包埋法來制備膠塊，雖然膠塊顏色發(fā)褐，可能有部分酚類物質(zhì)的氧化(圖1)，然而經(jīng)脈沖場凝膠電泳檢測，大片段DNA較為集中且主帶明顯，DNA發(fā)生降解或機(jī)械斷裂較少(圖2)，這說明提取的DNA能夠滿足后面實驗的需要，酚類物質(zhì)的存在對提取高分子量的細(xì)胞核DNA幾乎無影響。3.部分酶切最佳酶量的確定如果膠塊已放置了較長時間，在部分酶切前應(yīng)先進(jìn)行預(yù)電泳以除去一些小片段，預(yù)電泳條件為電壓6V/cm，5S-5S，4h，然后進(jìn)行部分酶切，所用的限制性內(nèi)切酶 為Hindlll。把一個膠塊平分為2塊，放入HindIII酶切緩沖液(IXHindIII buffer,2mMspermidine,0. lmg/mL BSA)中，冰上輕搖Ih,更換一次酶切緩沖液,繼續(xù)搖Ih,再把小膠塊切成大小相同的4塊，每4小塊為一個反應(yīng)，加入酶量分別為0. 4U、0. 6U、1. 2U、2. 4U、3. 6U、4. 8U的內(nèi)切酶，冰上輕搖lh，37°C酶切30min，脈沖電泳檢測，脈沖電泳條件1%瓊脂糖，0.5XTBE緩沖液，irC，泵70，角度120。，6v/cm，10s-50s，18h。根據(jù)所得到的最適酶量，進(jìn)行大量酶切。如圖3所示，每1/2膠塊的酶用量為I. 2U時，酶切片段集中在100 300kb之間，因此，確定酶濃度I. 2U為最適酶用量。4大片段DNA的兩次選擇與回收大量酶切后的DNA經(jīng)第一次選擇后，以marker為對照，分別切下120 200kb,200 300kb范圍的膠塊，將切下的膠塊分別放入合適大小的膠孔中進(jìn)行第二次選擇，電泳結(jié)束后切下兩邊含部分DNA樣品的膠塊進(jìn)行溴化乙啶染色，以染色的部分DNA樣品條帶所在位置為對照，從未染色的凝膠中切下目的片段并回收。第一次選擇脈沖電泳條件改進(jìn)前的起始時間50s，改進(jìn)后為10s，其他條件同部分酶切的電泳條件。第二次選擇的脈沖電泳條件為起始和終止時間分別為4s-4s，電泳時間14h，其他條件同部分酶切的電泳條件。采用電洗脫方法回收膠塊中的大片段DNA，以未酶切的已知濃度的、DNA濃度梯度為對照，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收的大片段DNA的濃度。如圖4-1中“B”所示為起始脈沖時間改進(jìn)前的結(jié)果圖，第二次選擇后200 300kb、300 400kb的DNA片段會更加集中，然而100 200kb這部分DNA片段拖尾嚴(yán)重，沒有主帶，所以沒法進(jìn)行切膠回收。片段越小轉(zhuǎn)化效率越高，與其他兩個范圍DNA相比，100 200kb這部分DNA片段轉(zhuǎn)化效率較高，是我們希望得到的。如圖4-2中“B”所示為起始脈沖時間改進(jìn)后的結(jié)果圖，第二次選擇后200 300kb、300 400kb的DNA片段也會很集中。而且100 200kb的DNA片段也很集中，主帶明顯，可以進(jìn)行切膠回收。說明脈沖時間的改變對會影響100 200kb這部分DNA片段的回收，經(jīng)后續(xù)步驟檢測后發(fā)現(xiàn)這部分片段轉(zhuǎn)化后插入片段大小能滿足實驗需要，這一改進(jìn)大大提高了轉(zhuǎn)化效率，節(jié)省了實驗時間且降低了實驗費用。本發(fā)明對BAC文庫構(gòu)建過程的大片段DNA第二次選擇時，凝膠的選取進(jìn)行了改進(jìn)之前的實驗過程中第二次選擇是在低熔點瓊脂糖凝膠中進(jìn)行，因為低熔點瓊脂糖篩孔相對較大，利于DNA的回收，然而其價格較貴，凝膠時間過長，一般需要過夜凝固，膠凝固后過于柔軟。操作中我們需要進(jìn)行切膠、膠塊回收、染色、完整凝膠的拼接、凝膠照相等步驟，凝膠柔軟且容易斷裂，不僅操作復(fù)雜麻煩有時會造成凝膠中DNA的丟失。因此本次實驗用普通瓊脂糖代替了低熔點瓊脂糖，雖然普通瓊脂糖糖凝膠篩孔較小，但是可以在下一步的電洗脫過程中適當(dāng)延長洗脫時間對DNA進(jìn)行了較好的回收，用已知濃度的入DNA為對照，用0. 8%瓊脂糖膠估計待測DNA的濃度 (圖5 )，DNA濃度與5和6泳道亮度相當(dāng)，估測其濃度為5. 5ng/UL，完全滿足實驗的需要。這一改進(jìn)大大降低了實驗操作的困難性也降低了實驗費用。5.大片段DNA的連接與轉(zhuǎn)化根據(jù)測得的回收片段的濃度，將其與pIndigoBAC-5載體按照插入片段與載體的摩爾比為1:6，1:9，1:10，1:12的比例進(jìn)行連接。載體與大片段DNA混勻后于55°C水浴lOmin，然后4°C冷卻約15min，加入10XT4DNA連接酶緩沖液、T4DNA連接酶及ATP (ImM)，16°C連接16h，最后65°C水浴20min，滅活酶活性。連接產(chǎn)物用0. 025 u m的濾膜懸浮在ddH20中冰上脫鹽2h，然后懸浮在30%PEG8000 (T10E1配制)中冰上濃縮lh。取2. 5 y L連接產(chǎn)物加入到18-20 u L DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電壓360V。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到ImL SOC培養(yǎng)基中，37°C、225r/min復(fù)蘇lh，培養(yǎng)液涂布在含有12. g/mL氯霉素、60ii g/mL X_gal和14 u g/mL IPTG的LB平板上，37 °C避光培養(yǎng)16h。實驗中發(fā)現(xiàn)對連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽濃縮這一步很重要，與不進(jìn)行濃縮和脫鹽的連接產(chǎn)物相比能有效地提高轉(zhuǎn)化效率和減少假陽性。對于濃縮后的連接產(chǎn)物，需要盡快轉(zhuǎn)化以免降低轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化后每200 ii LSOC復(fù)蘇液涂一個培養(yǎng)皿(d=12cm)。120-200kb的片段I次轉(zhuǎn)化2. 5 y L連接產(chǎn)物可得到6000個左右的克隆(圖6)，重組率大于96%，而200 300kb的DNA只能得到800個左右的克隆。這說明片段越大，連接轉(zhuǎn)化效率越低。6插入片段的檢測從LB平板中隨機(jī)挑取白色單菌落接種到含12. 5 U g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)20h。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，NotI酶切，脈沖電泳檢測插入片段的有無及大小，電泳條件1%瓊脂糖，ll°C，5s-15s，0. 5XTBE，120°，6V/cm，16h。當(dāng)確定插入片段適合構(gòu)建BAC文庫時，立即進(jìn)行大量轉(zhuǎn)化。用滅菌的牙簽挑取單克隆，接種到含冷凍培養(yǎng)基的384孔板中，37°C過夜培養(yǎng)，于_80°C保存。在本實施例所構(gòu)建的BAC文庫中，隨機(jī)挑取一定量的單克隆提取質(zhì)粒，NotI酶切檢測插入片段的大小及有無，檢測結(jié)果顯示(圖7):插入片段大多數(shù)集中在100-150kb，空載
率小于4%。
權(quán)利要求
1.利用非暗培養(yǎng)葉片構(gòu)建棉花BAC文庫的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)棉株葉片的收集摘取田間或花盆正常生長、剛平展的幼嫩棉花葉片；2)提取高分子量細(xì)胞核DNA，將細(xì)胞核包埋在低熔點瓊脂糖中，然后裂解釋放核DNA； 3)高分子量核DNA的酶切及兩次選擇，采用脈沖場凝膠電泳分離， 對于第一次選擇脈沖的起始時間10s，選出120 300kb的DNA片段，分成120 200kb和200 300kb兩個范圍進(jìn)行第二次選擇， 對于第二次選擇起始和終止時間分別為4s-4s，電泳時間14h，選出120 200kb和200 300kb的DNA片段； 4)分別對存在于膠塊中的120 200kb，200 300kbDNA進(jìn)行回收，與載體連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞； 5)檢測陽性克隆的插入片段是否滿足實驗需要。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，第一次選擇中，脈沖條件為1% 瓊脂糖，0. 5 X TBE 緩沖液，11°C，泵 70，角度 120。，6v/cm，10s_50s，18h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，第二次選擇中，脈沖條件為1% 瓊脂糖，0. 5 X TBE 緩沖液，11 °C，泵 70，角度 120°，6V/cm，4s_4s，14h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟3)中，第二次選擇中，使用普通瓊脂糖凝膠進(jìn)行脈沖電泳。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明具體涉及利用非暗培養(yǎng)葉片構(gòu)建棉花BAC文庫的方法。所述方法包括步驟1)棉株葉片的選??；2)高分子量細(xì)胞核DNA的提取；3)高分子量DNA的部分消化及兩次選擇；4)大片段DNA的回收、連接及轉(zhuǎn)化；5)插入片段的檢測。該方法適用于構(gòu)建所有棉花材料的BAC文庫，包括種子量少或無種子但宿生保存的棉花材料。
文檔編號C12N15/63GK102747427SQ20121021585
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者劉方, 張香娣, 彭仁海, 王坤波, 王春英, 王玉紅, 王省芬, 馬峙英, 高海燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所