專利名稱：生產(chǎn)尸胺的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)尸胺的方法。更特別地，本發(fā)明涉及重組微生物的用途，所述重組微生物包含生產(chǎn)尸胺所必需的以去調(diào)節(jié)形式存在的DNA分子。
現(xiàn)有技術(shù)JP 2002223770公開了通過將賴氨酸脫羧基因和/或賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運蛋白基因引入賴氨酸生產(chǎn)微生物來生產(chǎn)尸胺的方法。JP 2004222569公開了通過培養(yǎng)具有賴氨酸脫羧酶活性和高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型的重組棒桿菌來生產(chǎn)尸胺。
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發(fā)明簡述在一方面，本發(fā)明提供了通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法，所述重組微生物具有去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶和至少一種去調(diào)節(jié)的基因，該基因選自那些在賴氨酸的生物合成途徑中所必需的基因。在另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)聚酰胺的方法，其包括如上所述的用于生產(chǎn)尸胺的步驟，并將尸胺與二羧酸相反應。發(fā)明詳述在接下來的說明書中，廣泛地使用了大量術(shù)語。此處提供了定義來促進對發(fā)明的理解。術(shù)語尸胺意味著1，5- 二氨基戊烷。啟動子.指導結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA的DNA序列。通常啟動子定位于基因的5’區(qū)域，鄰近結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子。如果啟動子是誘導型啟動子，那么轉(zhuǎn)錄效率會響應于誘導試劑而提高。相反，如果啟動子是組成型啟動子，轉(zhuǎn)錄效率則不受誘導試劑調(diào)節(jié)。增強子.啟動子元件.增強子可增加特定基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的效率，無論增強子相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的距離或方向。表達·表達是從結(jié)構(gòu)基因生產(chǎn)多肽的過程。該過程涉及將基因轉(zhuǎn)錄成mRNA并將此mRNA翻譯成多肽?？寺≥d體.DNA分子，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、或噬菌體，其具有在宿主細胞中自主復制的能力，并可用來轉(zhuǎn)化細胞用于基因操作?？寺≥d體通常含有一個或少數(shù)的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點，外源DNA序列可以確定的形式在不損失載體的必需生物功能的情況下插入這些位點，以及適合用于鑒定和篩選克隆載體轉(zhuǎn)化過的細胞的標志基因。標志基因通常包括那些提供四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性的基因。表達載體.包含克隆的編碼外源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的DNA分子，所述DNA分子提供外源蛋白質(zhì)在重組體宿主中的表達。通常，將克隆基因的表達置于特定調(diào)節(jié)序列例如啟動子和增強子序列的控制下(即，有效連接)。啟動子序列可為組成型的或誘導型的。重組宿主.重組宿主可以是任何原核的或真核的細胞，其含有克隆載體或表達載體。該術(shù)語也意味著包括那些經(jīng)遺傳工程操作的在宿主細胞染色體或基因組中含有克隆基因的原核或真核細胞。合適宿主的例子見Sambrook等人，MOLE⑶LAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)[" Sambrook"]。如此處所用的，基本純的蛋白質(zhì)意味著目的純化蛋白是基本上無污染的細胞組分，如通過在聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)之后的單條帶所證實的。術(shù)語“基本上純的”進一步意味著描述某分子通過本領域技術(shù)人員所用的一種或多種純度或均一性特征來表征是均一的。例如，基本上純的賴氨酸脫羧酶在某些參數(shù)標準的實驗偏差內(nèi)將顯示恒定的和可重復的特征，所述參數(shù)如下分子量、色譜遷移、氨基酸組成、氨基酸序列、封閉的或未封閉的N末端、HPLC洗脫圖譜、生物活性、和其它此類參數(shù)。然而，該術(shù)語并不意味著排除賴氨酸脫羧酶與其它化合物的人工的或合成的混合物。另外，該術(shù)語并不意味著排除分離自重組宿主的賴氨酸脫羧酶融合蛋白。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生 產(chǎn)尸胺的方法，所述微生物具有去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因和至少一種去調(diào)節(jié)的選自下列的基因(i)包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫批唳二羧酸琥拍酰酶(succinylase)、琥拍酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶，如果天冬氨酸激酶作為基因(i)而去調(diào)節(jié)，則必須有除天冬氨酸激酶之外的另一種基因(i)被去調(diào)節(jié)。本發(fā)明的方法描述了如此處所述的和/或以導致尸胺產(chǎn)生的方式培養(yǎng)的重組微生物，其優(yōu)選地包括載體或基因(例如，野生型和/或突變型基因)。術(shù)語“重組”微生物包括已經(jīng)遺傳改變、修飾或工程化(例如遺傳工程化的)的微生物(例如，細菌、酵母細胞、真菌細胞等等)，以便其展示與其所來源的天然存在的微生物相比改變的、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如，當遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時)。術(shù)語“去調(diào)節(jié)的”包括基因產(chǎn)物的表達(例如，賴氨酸脫羧酶)處于低于或高于在微生物操作前或在未經(jīng)操作的相當?shù)奈⑸镏兴磉_水平的表達水平。在一個實施方案中，微生物可經(jīng)遺傳操作(例如，遺傳工程化的)來表達比微生物操作前所表達的水平或未經(jīng)操作的相當微生物中的表達水平更低或更高水平的基因產(chǎn)物。遺傳操作可包括但不限于，改變或修飾調(diào)節(jié)序列或與特定基因的表達相關的位點(例如，通過除去強啟動子，誘導型啟動子或多重啟動子)、修飾特定基因的染色體位置、改變與特定基因例如核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子鄰近的核酸序列、減少特定基因的拷貝數(shù)量、修飾涉及特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制子、增強子、轉(zhuǎn)錄激活因子等等)、或本領域中慣用的去調(diào)節(jié)特定基因表達的其它常規(guī)方法(包括但不限于使用翻譯核酸分子、或其它方法來敲除或阻斷靶蛋白的表達)。術(shù)語“去調(diào)節(jié)基因活性”例如去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶，還意味著將基因活性例如賴氨酸脫羧酶活性引入微生物，所述微生物中各自基因活性例如脫羧酶活性在此前并未發(fā)現(xiàn)過，例如優(yōu)選通過遺傳工程的方法將一個或多個拷貝的異源基因例如賴氨酸脫羧酶基因引入微生物。賴氨酸脫羧酶催化L-賴氨酸脫羧化為尸胺。該酶被分類為E.C.4. I. I. 18。分離自大腸桿菌(Escherichia coli)的具有賴氨酸脫羧酶活性的酶是cadA基因產(chǎn)物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entryb4131)和 IdcC 基因產(chǎn)物(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes, EntryJWO181)。SEQ ID NO: I公開了大腸桿菌cadA的氨基酸序列，SEQ ID NO: 2公開了大腸桿菌IdcC的氨基酸序列。編碼大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因的DNA分子可通過利用具有反向翻譯自氨基酸序列SEQ ID NO: I或2的多核苷酸的探針篩選cDNA或基因組文庫來獲得。備選地，大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因可通過利用相互引發(fā)長寡核苷酸來 合成 DNA 分子而獲得。見例如，Ausubel 等人，(eds. )，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY, 8· 2·8 至 8. 2. 13 頁(1990)[ " Ausubel"]·另外，見 Wosnick 等人.，Gene 60:115(1987);和 Ausubel 等人(eds. )，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,第 3 版，8-8 至 8-9 頁(John ffiley&Sons, Inc. 1995)。利用聚合酶鏈式反應的確定技術(shù)提供了合成長度為至少2千堿基的DNA分子的可能。Adang等人，Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993);Bambot 等人，PCR Methods and Applications2:266 (1993) ; Dillon 等人，"Use of the Polymerase Chain Reaction for the RapidConstruction of Synthetic Genes, "in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 15:PCRPROTO⑶LS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White(ed. ), 263-268 頁，(HumanaPress, Inc. 1993) ; Holowachuk 等人，PCR Methods Appl. 4:299 (1995)。可生產(chǎn)與母酶相比含有保守氨基酸改變的大腸桿菌賴氨酸脫羧酶的變體。S卩，可獲得含有SEQ ID N0:1或2的一個或多個氨基酸替換的變體，其中用烷基氨基酸替換賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的烷基氨基酸，用芳香族氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的芳香族氨基酸，用含硫氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的含硫氨基酸，用羥基氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的含羥基氨基酸，用酸性氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的酸性氨基酸，用堿性氨基酸替換大腸桿菌賴氨酸脫羧酶氨基酸序列中的堿性氨基酸。在共同的氨基酸中，例如“保守氨基酸替換”可列舉為下列組之一中的氨基酸間的替換(1)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸，
(3)半胱氨酸和甲硫氨酸，(4)絲氨酸和蘇氨酸，(5)天冬氨酸和谷氨酸，(6)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(7)賴氨酸、精氨酸和組氨酸。大腸桿菌賴氨酸脫羧酶中的保守氨基酸改變可通過用核苷酸替換SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2中所述的核苷酸來引入。此類“保守氨基酸”變體可通過例如寡核苷酸定向誘變、接頭掃描誘變、利用聚合酶鏈式反應的誘變等等得到。Ausubel等人，前述，8. O. 3-8. 5. 9 頁;Ausubel 等人(eds.), SHORT PROTO⑶LS IN MOLECULAR BIOLOGY,第三版，8-10 至8-22 頁(John ffiley&Sons, Inc. 1995)。通常還可見，McPherson (ed.)，DIRECTEDMUTAGENESIS:A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)。此類變體將 L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的能力可利用標準的酶活性測定法例如此處所述的測定法來測定。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的賴氨酸脫羧酶是來自大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶及其等同基因，其與相應的“原始”基因產(chǎn)物有高達80%、優(yōu)選地90%和最優(yōu)選的95%和98%的序列同一性(基于氨基酸序列)，并仍具有賴氨酸脫羧酶的生物學活性。這些等同基因可容易地由本領域已知的方法通過引入核苷酸替換、缺失或插入來構(gòu)建。本發(fā)明的 另一優(yōu)選的實施方案是大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶(SEQ IDN0:1和NO: 2),通過應用谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutmicum)的密碼子選擇將其回譯成DNA。這些賴氨酸脫羧酶多核苷酸序列對于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物特別是谷氨酸棒桿菌中賴氨酸脫羧酶的表達是有用的。除了去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因外，根據(jù)本發(fā)明的微生物必須具有至少一種選自組(i)的去調(diào)節(jié)的基因。組(i)是在賴氨酸的生物合成中發(fā)揮關鍵作用的一組基因，并由下列基因組成天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶。根據(jù)本發(fā)明的方法至少一種組(i)的基因必須被去調(diào)節(jié)。優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的微生物中多于一種組Q)的基因,例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種基因被去調(diào)節(jié)。組(i)的基因和基因產(chǎn)物是本領域中公知的。EP1108790公開了高絲氨酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶基因中的突變，其對于重組棒桿菌在賴氨酸生產(chǎn)中的生產(chǎn)能力具有有益影響。W00063388公開了天冬氨酸激酶基因中的突變，其對重組棒桿菌在賴氨酸生產(chǎn)上的生產(chǎn)能力具有有益影響。引用EP1108790和W00063388作為與上述這些基因突變有關的參考。下列的表中提及了各個基因的每一種基因/基因產(chǎn)物可能的去調(diào)節(jié)方式。在表的“去調(diào)節(jié)”列中所引用的文獻和文件在此引用作為與基因去調(diào)節(jié)有關的參考。表中所提到的方式是各自基因去調(diào)節(jié)的優(yōu)選實施方案。表I
權(quán)利要求
1.通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法，所述重組微生物具有增量調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因和至少ー種去調(diào)節(jié)的選自組α)的基因，組α)由下列組成增量調(diào)節(jié)的天冬氨酸激酶、増量調(diào)節(jié)的天冬氨酸半醛脫氫酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氫吡啶ニ羧酸合酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氫吡啶ニ羧酸還原酶、増量調(diào)節(jié)的四氫吡啶ニ羧酸琥珀酰酶、増量調(diào)節(jié)的琥珀酰-氨基-酮基庚ニ酸轉(zhuǎn)氨酶、増量調(diào)節(jié)的琥珀酰-ニ氨基-庚ニ酸脫琥珀酰酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氨基庚ニ酸表異構(gòu)酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氨基庚ニ酸脫氫酶、増量調(diào)節(jié)的精氨酰-tRNA合成酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氨基庚ニ酸脫羧酶、増量調(diào)節(jié)的丙酮酸羧化酶、増量調(diào)節(jié)的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、増量調(diào)節(jié)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、増量調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)酮醇酶、増量調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)醛醇酶、増量調(diào)節(jié)的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、増量調(diào)節(jié)的果糖1，6- ニ磷酸酶、減量調(diào)節(jié)的高絲氨酸脫氫酶、減量調(diào)節(jié)的烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、減量調(diào)節(jié)的琥珀酰輔酶A合成酶、減量調(diào)節(jié)的甲基丙ニ酰輔酶A變位酶，條件是如果天冬氨酸激酶作為基因(i)被増量調(diào)節(jié)，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二種基因(i)必須被去調(diào)節(jié)，其中所述微生物屬于棒桿菌屬，其中所述賴氨酸脫羧酶是具有SEQ ID NO: I或2的多肽序列，或與SEQ ID NO: I或2有至少80%同一性的多肽序列的賴氨酸脫羧酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中増量調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶對所述微生物是異源的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述重組微生物具有來自埃希氏菌屬的賴氨酸脫羧酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述賴氨酸脫羧酶具有SEQID NO: I或2的多肽序列，或與SEQ ID NO: I或2有至少80%同一性的具有賴氨酸脫羧酶活性的多肽序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述微生物的ニ氨基庚ニ酸脫氫酶活性被增量調(diào)節(jié)。
7.生產(chǎn)聚酰胺的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求I生產(chǎn)尸胺，并將尸胺與ニ羧酸反應。
8.重組微生物，其具有増量調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因和至少ー種去調(diào)節(jié)的選自組(i)的基因，組(i)由下列組成増量調(diào)節(jié)的天冬氨酸激酶、増量調(diào)節(jié)的天冬氨酸半醛脫氫酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氫吡啶ニ羧酸合酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氫吡啶ニ羧酸還原酶、増量調(diào)節(jié)的四氫吡啶ニ羧酸琥珀酰酶、増量調(diào)節(jié)的琥珀酰-氨基-酮基庚ニ酸轉(zhuǎn)氨酶、増量調(diào)節(jié)的琥珀酰- ニ氨基-庚ニ酸脫琥珀酰酶、增量調(diào)節(jié)的ニ氨基庚ニ酸表異構(gòu)酶、增量調(diào)節(jié)的ニ氨基庚ニ酸脫氫酶、増量調(diào)節(jié)的精氨酰-tRNA合成酶、増量調(diào)節(jié)的ニ氨基庚ニ酸脫羧酶、増量調(diào)節(jié)的丙酮酸羧化酶、増量調(diào)節(jié)的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、増量調(diào)節(jié)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、増量調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)酮醇酶、増量調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)醛醇酶、増量調(diào)節(jié)的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、増量調(diào)節(jié)的果糖1，6- ニ磷酸酶、減量調(diào)節(jié)的高絲氨酸脫氫酶、減量調(diào)節(jié)的烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、減量調(diào)節(jié)的琥珀酰輔酶A合成酶、減量調(diào)節(jié)的甲基丙ニ酰輔酶A變位酶，條件是如果天冬氨酸激酶作為基因(i)被増量調(diào)節(jié)，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二種基因(i)必須被去調(diào)節(jié)，其中所述微生物屬于棒桿菌屬，其中所述賴氨酸脫羧酶是具有SEQ ID ΝΟ:1或2的多肽序列，或與SEQ ID NO: I或2有至少80%同一性的多肽序列的賴氨酸脫羧酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的重組微生物，其中増量調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶來自于埃希氏菌屬。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的重組微生物，其中所述微生物的ニ氨基庚ニ酸脫氫酶活性被增量調(diào)節(jié)。
全文摘要
通過構(gòu)建重組微生物并培養(yǎng)所述微生物來生產(chǎn)尸胺的方法，所述重組微生物具有去調(diào)節(jié)的賴氨酸脫羧酶基因和至少一種去調(diào)節(jié)的選自組(i)的基因，組(i)由下列組成天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1,6-二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶，條件是如果天冬氨酸激酶作為基因(i)被去調(diào)節(jié)，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二種基因(i)必須被去調(diào)節(jié)。
文檔編號C12N1/21GK102732578SQ20121021647
公開日2012年10月17日 申請日期2007年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者A·赫羅爾德, C·克洛普羅格, H·施羅德, O·策爾德爾, W·K·曾 申請人:巴斯夫歐洲公司