專利名稱：煙堿生物合成dao基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙堿(Nicotin)，又稱尼古丁，化學(xué)名稱為I-甲基-2_(2_吡啶基)吡咯烷，分子式為CltlH4N2，是ー種天然存在于煙草中的生物堿，是煙草中特有的。煙堿能夠?qū)θ水a(chǎn)生一定的生理刺激作用，是使煙草具有商品價(jià)值的主要因素。隨著煙堿的生物活性越來 越受到人們的重視，其應(yīng)用也越來越廣泛，對(duì)它們的開發(fā)已經(jīng)逐漸深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用用化工等多個(gè)領(lǐng)域，應(yīng)用前景非常廣闊。如煙草替代品生產(chǎn)需要大量的煙堿目前對(duì)煙草依賴的治療方法包括藥物治療、心理治療、針灸和中藥治療等，經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的治療方案和藥物主要有煙堿替代療法如煙堿貼劑、ロ膠、鼻噴霧劑和吸入劑等，采用nAChR抑制劑藥物治療，如安非他酮和注射劑如酒石酸瓦倫尼克林，還有美卡拉、去甲替林、可樂定和抗焦慮藥等，這些煙堿替代物的生產(chǎn)需要大量提取煙堿作為原料；另外，煙堿還廣泛應(yīng)用于環(huán)保農(nóng)藥的開發(fā)以及特種疾患藥物的生產(chǎn)煙堿系列農(nóng)藥屬植物殺蟲劑，因其具有蒸薫、胃毒、觸殺功能及迅速降解無殘留等特點(diǎn)廣泛用于糧食、油料、蔬菜、水果、牧草等農(nóng)作物的殺蟲劑，是生產(chǎn)綠色食品的理想的高效殺蟲劑和生物性農(nóng)藥，它還廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥エ業(yè)上，是研制治療心血管、皮膚病、蛇毒等疾患藥物的特種原料。還可用其所制得的檸檬酸煙堿應(yīng)用于高級(jí)香煙的品種改良劑組分等，而且隨著煙草エ業(yè)、精細(xì)化工、制藥、有機(jī)合成、國防、農(nóng)藥等的迅速發(fā)展。市場(chǎng)對(duì)煙堿的需求與日俱增，特別是高純煙堿的需求更大。煙堿分子包含ー個(gè)吡咯烷環(huán)和吡啶環(huán)，而吡啶環(huán)是由NAD途徑合成的，吡咯烷環(huán)是由基本氨基酸經(jīng)過中間產(chǎn)物腐胺形成的。參與煙堿生物合成的蛋白包括ニ胺氧化酶(diamine oxidase, DAO),鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC),喹啉酸合成酶(quinolinate synthase, QS),天冬氨酸氧化酶(aspartate oxidase, AO),喹啉酸憐酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(quinolinate phospho-ribosyltransferase, QPT),腐胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶(putrescine N-methytransferase,PMT) (Katoh et al. , 2005; Cane et al. , 2005),編碼這些蛋白的基因都可以在Λ中找到。其中腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶由三個(gè)基因編碼(PMTI，ΡΜΤ2, ΡΜΤ3) (Shoji et al.，2000)。如果要通過編碼這些酶類的基因來調(diào)控?zé)焿A的合成，則首先應(yīng)當(dāng)找到其對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供ー種可對(duì)煙堿生物合成起調(diào)控作用的DAO基因啟動(dòng)子及其嵌合基因。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列為
(I)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或(2)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列經(jīng)重復(fù)、缺失、替換或移位等常規(guī)技術(shù)手段改造而形成的具有同等功能的核苷酸序列。擴(kuò)增上述DAO基因啟動(dòng)子的引物對(duì)，具有SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的核
苷酸序列?！N嵌合基因，其中包含上述煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子以及與之可操作連接的、編碼目的基因的序列。ー種植物轉(zhuǎn)化載體，其中包含上所述嵌合基因。ー種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中包含上述嵌合基因。
ー種轉(zhuǎn)基因植物組織，其中包含上述嵌合基因。上述煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子或上述嵌合基因在調(diào)控?zé)焿A生物合成中的應(yīng)用。本發(fā)明具有積極有益的效果
1.找到并提取出了煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子；
2.煙堿DAO基因啟動(dòng)子區(qū)域產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控區(qū)域能夠?qū)Σ煌沫h(huán)境條件作出應(yīng)答，對(duì)煙堿合成基因的表達(dá)水平做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)(根據(jù)需要進(jìn)行上調(diào)或下調(diào))，進(jìn)而對(duì)煙草種植生產(chǎn)出適量煙堿含量的煙葉以及生產(chǎn)出高品質(zhì)的煙堿提取原料有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖I為PCR擴(kuò)增煙堿基因啟動(dòng)子電泳圖，其中左圖以N. tabacum基因組DNA為模板，右圖以N. sylvestris基因組DNA為模板；
圖2為DAO，QPT, AO, QS等基因啟動(dòng)子中含有的保守的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)框架圖；通過使用Genomatix公司的FrameWorker軟件分析單個(gè)的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建的框架圖；轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的的組織(包括DNA鏈的特異性，相對(duì)順序)都是保守的；不同基因啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的距離變化非常?。徊煌喩聿煌D(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)；單線上面的符合代表轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)位于有義鏈，而單線下面的符合代表轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)位于反義鏈；
圖3為DAO，QPT,A0, QS等基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子示意模式圖；該模式圖由Genomatix公司的Fast軟件分析得到；模式圖中變化距離反應(yīng)了三個(gè)基因啟動(dòng)子序列中不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)之間的距離。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所涉及的試驗(yàn)方法或分析方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法，所用試劑如無特別說明，均為市售。實(shí)施例I煙堿合成基因的分離、鑒定
煙堿合成基因DAO, AO, QS, QPT, ODC, PMTI, PMT2和PMT3啟動(dòng)子序列均從Λsylvestris基因組序列中提取得到，這些基因在基因組中的位置如下表I所示。其中煙堿合成基因DAO啟動(dòng)子序列的如SEQ ID NO. I所示。表I各啟動(dòng)子在Λ基因組中的位置
權(quán)利要求
1.一種煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列為 (1)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或 (2)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列經(jīng)重復(fù)、缺失、替換或移位改造修飾而成的具有同等功能的核苷酸序列。
2.擴(kuò)增權(quán)利要求I所述DAO基因啟動(dòng)子的引物對(duì)，其特征在于，具有SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
3.一種嵌合基因，其中包含權(quán)利要求I所述煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子以及與之可操作連接的、編碼目的基因的序列。
4.ー種植物轉(zhuǎn)化載體，其中包含權(quán)利要求3所述的嵌合基因。
5.ー種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中包含權(quán)利要求3所述的嵌合基因。
6.ー種轉(zhuǎn)基因植物組織，其中包含權(quán)利要求3所述的嵌合基因。
7.權(quán)利要求I所述煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子或權(quán)利要求3所述嵌合基因在調(diào)控?zé)焿A生物合成中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該煙堿生物合成DAO基因啟動(dòng)子從N.sylvestris基因組序列中提取得到，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。煙堿DAO基因啟動(dòng)子區(qū)域產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控區(qū)域能夠?qū)Σ煌沫h(huán)境條件作出應(yīng)答，對(duì)煙堿合成基因的表達(dá)水平做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)(根據(jù)需要進(jìn)行上調(diào)或下調(diào))，進(jìn)而對(duì)生產(chǎn)出高品質(zhì)的煙堿提取原料有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102851289SQ20121022140
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月30日
發(fā)明者張松濤, 劉國順, 崔紅, 楊永鋒, 云菲 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)