專利名稱：一種耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和應用。
背景技術：
木聚糖是半纖維素中最豐富的一類物質，廣泛存在于硬木(15-30%)、軟木(7-10%)和草本類植物(少于30%)。木聚糖的基本糖單元是D-吡喃木糖，它的主鏈由、木糖以3 -I, 4糖苷鍵連接形成，側鏈上被各種不同的取代基所修飾，同時，這些側鏈取代基團通過化學鍵互相交聯，形成復雜的結構(Collins et a I. FEMS MicrobiologyReviews. 2005，29:3-23.)。木聚糖的降解需要主鏈水解酶和支鏈水解酶的協同作用，主鏈酶包括￠-1,4-木聚糖酶和P -木糖苷酶，側鏈水解需要a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，a-葡萄糖醒酸，乙酰木聚糖酯酶等輔酶。其中，阿拉伯呋喃糖苷酶(a -L-arabinofuranosidase,EC 3.2.1.55)能從含有阿拉伯糖殘基的多聚物如阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖等的非還原末端水解生成一個阿拉伯糖分子。目前，人們已將細菌、真菌和植物來源的a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶進行分離純化、或者通過基因克隆、異源表達之后，深入研究酶的各種性質。來源于微生物的阿拉伯呋喃糖苷酶的最適反應PH為酸性至中性之間(pH
3.0-7. 0)，最適反應溫度介于40-70°C之間。作為半纖維素降解酶系之一，a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶參與低價的農產品殘渣的再利用，產生可用于發(fā)酵生成燃料乙醇的單糖及其他副產品。在纖維素發(fā)酵生產燃料乙醇的過程中，有約70%的原材料將不能被完全降解生成單糖，適當的纖維素預處理過程可以加大纖維素的利用率。利用酶預處理的方法則減少了這些問題的發(fā)生。阿拉伯呋喃糖酶是半纖維素的側鏈降解酶，它能促進半纖維素的完全降解。另外，阿拉伯糖呋喃糖苷酶作為一種飼料添加劑，去除了木聚糖上阿拉伯糖側鏈，促進木聚糖的降解，易于被動物消化吸收。阿拉伯呋喃糖苷酶還被廣泛應用于食品行業(yè)中，L-阿拉伯糖做為一種低攝入量的甜味劑能代替?zhèn)鹘y的蔗糖，適于老年人和高血糖患者食用。阿拉伯呋喃糖苷酶還能增加釀酒過程中萜烯醇的濃度，提高酒的香味，增加果汁的澄清度，而被應用于果汁生產工業(yè)。因此，阿拉伯呋喃糖苷酶的產生、純化、性質特征及其在飼料加工、釀酒工業(yè)、果汁加工、以及能源等領域的應用正在不斷深入。工業(yè)生產需要酶進行短期高溫處理，目前多數阿拉伯呋喃糖苷酶最適溫度在50°C左右，但較差的熱穩(wěn)定性質不能滿足飼料制粒，釀造加工等工業(yè)的高溫生產要求。因此獲得熱穩(wěn)定性優(yōu)良的酶能降低生產成本，滿足不同工業(yè)對酶性質的要求。本發(fā)明中來源于脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus sp. B8的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8具有以下性質最適pH6. 0，并在pH5. 0 8. 0范圍內具有40%以上的酶活力，具有很好的pH穩(wěn)定性，37°C下作用Ih后，在pH 4.0-11.0之間，剩余酶活性均在80%以上。最適溫度60°C，8(TC下仍具有50%以上的活性，良好的熱穩(wěn)定性，70°C都有較好的穩(wěn)定性，保溫60min后酶活幾乎不損失。良好的pH和熱穩(wěn)定性等特性使其在飼料，食品工業(yè)應用上具有很大的潛力。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應用的耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶的基因工程方
法。 本發(fā)明的另一目的提供上述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶的應用。本發(fā)明從脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus sp. B8中分離得到一種新的耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。本發(fā)明提供了一種耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。SEQ ID NO. I MSKSIARMTIDPQYQLADVDPRLFGSFIEHLGRAVYGGIYEPDHPSADEMGFRQDVLELVRELQVPIVRYPGGNFVSGYRWEDGVGPLASRPAQLDLAWRSLEPNRVGVNEFVEWAKRANSEVMMAVNLGTRGIDEAKQIVEYCNHPGGSYWSDLRKSHGYEQPHGIKVffCLGNEMDGPWQIGHKTAEEYGRIAEEAAKVMKWVDPSIELVACGSSGSKMPTFPDWERIVLEHTYDHVEYISMHSYYGNRENDLATYLAQSLDMDHFIRSVIATCDYVKAKKRSKKTINISFDEWNVWFHSNEADKQVAPWQVGPPLLEDVYTVEDALVVGCLLITLLRHADRVKMACLAQLVNVIAPIMTENGGVSWKQTIYYPFLHASRYGRGKVMHCSLQSPKYDCKEFTDVPLVESVAVWNQDIGELTIFAVNRSQDGGIELECDIRGFAQASVIEHTVLVHSDLKAANTKEEPQEVIPQHAQGAKVDGGLLFAPLPKLSWNVIRLRV其中，該酶包含502個氨基酸,無信號肽序列。本發(fā)明篩選到脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus sp. B8，其產生阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，該酶同時具有好的熱穩(wěn)定性，在常溫下在中性的范圍內均具有高活性，其最適pH值為6. 0，在pH5. 0 7.0的范圍內維持60%以上的酶活性；最適溫度為60°C，在40 80 0C仍具有50 %以上的酶活力。本發(fā)明提供了編碼上述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶的基因abf51B8。具體地，該基因的基因組序列如SEQ IDN0. 2所不atgtccaagtcgattgcacgtatgacgattgatccgcagtaccagctcgccgatgtcgatccaaggttgttcgggtcgttcatcgagcatctcgggcgcgccgtatatgggggtatttacgagcctgatcacccgtctgccgacgaaatgggtttccgtcaggacgtcctcgaactggtgcgcgaactccaggtgcccatcgtgcgctacccgggaggcaactttgtgtcaggttaccgttgggaagacggggtggggccgcttgcgtccaggcccgcccaactcgatctcgcttggcgaagcttggaacccaatcgtgtaggtgtcaacgaatttgtcgagtgggccaagcgggcaaactccgaagtcatgatggctgtcaatctcggcacgcgtggtatcgacgaagcgaagcagattgtcgagtactgcaatcatcctggcggcagttattggagcgatctacgaaaatcgcatggctatgaacagccgcacggcatcaaggtgtggtgcctgggcaacgagatggatggcccgtggcaaattgggcacaaaacggccgaagaatacggccgaatcgctgaagaagcggctaaggtcatgaaatgggtcgatccgtcgatagagcttgtcgcatgcggtagctccggctcgaaaatgcctacgtttcccgattgggaacgaattgtcctcgaacacacatacgatcacgtcgagtacatttccatgcacagctactacggaaatcgcgagaatgacctcgcgacgtaccttgctcaatcgctcgatatggaccatttcatccgttcggtgattgcgacatgtgactatgtcaaagcgaaaaaacgcagcaagaaaaccatcaacatctcgtttgacgagtggaatgtgtggtttcactcaaacgaagcggacaaacaagttgcaccgtggcaggttggcccgccgttgcttgaggacgtatatacggtcgaagatgcgcttgttgtcgggtgtttgttgatcacgcttttgcgccatgcggatcgggtgaagatggcgtgtcttgctcagttggtcaatgtgattgcgcccatcatgacggagaacggcggggtgtcctggaaacagaccatttactatccctttttgcacgcttcgcggtacggtagagggaaagtgatgcactgctcgctacaatcgccgaagtacgattgtaaggaatttaccgacgtgccgctggtcgagagcgttgcagtgtggaatcaggatatcggagagttgaccatttttgcggtcaaccgttcgcaagatggcggcatcgagttggaatgtgacatccgcgggtttgctcaagccagcgtgatcgagcatacggtgcttgtgcattcggatttgaaagcggcgaacacgaaagaagagccacaggaagtgattccgcagcatgcacaaggcgcaaaggtcgatgggggcttgctcttcgctccattacccaaactgtcttggaacgtcattcgattgcgcgtgtaa根據本發(fā)明的具體實施例，通過PCR的方法分離克隆了阿拉伯呋喃糖苷酶abf51B8, DNA全序列分析結果表明，阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8全長1509bp。成熟蛋白理論分子量為56. 6kDa，將阿拉伯呋喃糖苷酶abf51B8序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對,該基因與來源于Geobacillus StearothermophiIus T6的阿拉 伯呋喃糖苷酶序列一致性為68%。說明Abf51B8是一種新的阿拉伯呋喃糖苷酶。本發(fā)明還提供了包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶abf51B8的重組載體，優(yōu)選為pPET-abf51B8。將本發(fā)明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到質粒pPET_30a(+)上的Nde I和NotI限制性酶切位點之間，得到重組酵母表達質粒pPET-abf51B8。本發(fā)明還提供了包含上述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21/abf51B8。本發(fā)明還提供了一種制備耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的方法，包括以下步驟I)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組阿拉伯呋喃糖苷酶表達；以及3)回收并純化所表達的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組原核表達質粒轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)，得到重組菌株 BL21/abf51B8。本發(fā)明還提供了上述阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的應用。本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的、適合于在飼料、釀酒、食品工業(yè)中應用新的阿拉伯呋喃糖苷酶。本發(fā)明的阿拉伯呋喃糖苷酶最適pH為6. 0，在pH5. 0 7. 0都有較高的酶活性；pH穩(wěn)定性好。其耐高溫特性，可使其在需求高溫環(huán)境的工業(yè)生產上應用。本發(fā)明的阿拉伯呋喃糖苷酶適用于飼料工業(yè)，可與木聚糖酶協同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗營養(yǎng)作用。在釀酒工業(yè)中，可有效降解可溶性和不可溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麥芽汁的粘度提高過濾效率澄清啤酒。另夕卜，在白酒、清酒的釀造中有助于增加釀酒過程中萜烯醇的濃度，增加香味。因此，本阿拉伯呋喃糖苷酶在食品工業(yè)中的應用顯示出其巨大的潛力。


圖I重組阿拉伯呋喃糖苷酶的最適pH。圖2重組阿拉伯呋喃糖苷酶的pH穩(wěn)定性。 圖3重組阿拉伯呋喃糖苷酶的最適溫度。圖4重組阿拉伯呋喃糖苷酶的熱穩(wěn)定性。
具體實施例方式試驗材料和試劑I、菌株及載體本發(fā)明從脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus sp.B8中分離得到一種新的耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。大腸桿菌表達載體pPET-30(a)及菌株EcoliBL21 (DE3)購自于 Invitrogen 公司。2、酶類及其它生化試劑內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-arabionfuranoside (pNPAf)購自 Sigma 公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(I)Alicyclobacillus sp. B8 培養(yǎng)基為 MEA 培養(yǎng)基麥芽提取物，17. Og/1 ;蛋白胨，3. Og/1 ;瓊脂。通過I: I (w/w)的檸檬酸調整pH值為3. 5(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、l%NaCl，pH7. 0)。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例I脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus sp. B8阿拉伯呋喃糖苷酶編碼基因abf51B8的克隆提取瓶霉Alicyclobacillus sp.B8 基因組 DNA:將液體培養(yǎng)3天的菌體離心后放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min,每隔IOmin混勻一次，在4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗漆兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于_20°C備用。根據第51家族阿拉伯呋喃糖苷酶基因的保守(GNEMDG和DEWNVW)序列設計合成了簡并引物P1，P2Pl:5' -GGNAAYGARATGGAYGG-3'；P2:5’-CCANACRTTCCAYTCRTC-3’)。以Alicyclobacillus sp. B8總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為94°C變性5min ;然后94°C變性30sec，5(TC退火30sec，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后72°C保溫IOmin0得到一約378bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。根據測序得到的核苷酸序列，設計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設計在sp I的內側，sp3位于sp2的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規(guī)定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl, usp2, usp3(上游特異性引物),dspl, dsp2, dsp3 (下游特異性引物)見表I。表I.阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8TAIL_PCR特異性引物
權利要求
1.一種阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8，其特征在于，編碼權利要求I所述的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51A4。
3.如權利要求2所述的耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.包含權利要求3所述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的重組載體。
5.包含權利要求3所述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的重組載體pPET-abf51B80
6.包含權利要求3所述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的重組菌株。
7.一種制備耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf51B8的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組阿拉伯呋喃糖苷酶表達； 3)回收并純化所表達的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8。
8.權利要求I所述耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種耐高溫阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和應用。本發(fā)明提供了一種來源于脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillussp.B8的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述阿拉伯呋喃糖苷酶的編碼基因abf51B8。本發(fā)明的阿拉伯呋喃糖苷酶的具有以下性質最適pH6.0，最適溫度60℃，在70℃具有很好的熱穩(wěn)定性。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于飼料，食品、能源工業(yè)等。
文檔編號C12N1/19GK102719417SQ201210223320
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月2日 優(yōu)先權日2012年7月2日
發(fā)明者詹志春, 顧愛玲 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司