專利名稱：一種重組的hec-c8orf4腫瘤細胞及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于抗腫瘤技術領域，涉及一種重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞及其應用。
背景技術：
腫瘤相關基因C80RF4 (chromosome 8 open reading frame 4),位于 8pll_12,其cDNA全長1327bp，其對應的Genbank號為NM_020130，也稱為甲狀腺癌相關基因l(thy-roidcancer-1, TC-1)，是 2000 年由 Chua 等[Genomics, 2000，69(3) :342-347]從乳頭狀甲狀腺癌組織與正常甲狀腺組織的差異基因中篩選得到的新基因，廣泛表達于脊椎動物，高度表達于多種惡性腫瘤組織中。C80RF4蛋白的二級結構絕大部分為a螺旋(>55%)，P折疊結構極少(〈5%)，且沒有穩(wěn)定的三級結構，屬于固有無序化蛋白質(天然無折疊蛋白質)中的一種[Cancer Res, 2004, 64(8) :2766-2773]。該基因編碼一種含有106個氨基酸的蛋白，該 蛋白參與一些通路和成纖維細胞生長因子受體2 (FGFR-2)通路的調節(jié)，促進腫瘤細胞的惡性行為，也參與NF-kB通路，調節(jié)炎性反應及熱休克反應。有研究顯不胃癌細胞甲狀腺癌相關基因蛋白與Chibby結合，措抗Chibby對某些信號通路的抑制作用，該研究證實其與腫瘤細胞的增殖、轉移等密切相關，說明該基因可能通過該信號通路參與胃癌細胞增殖、轉移(Cancer Res. 2006,66(2) :723-8.)。隨后Gall等研究也發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌相關基因參與影響某些信號通路(ProteinSci. 2007, 16(11) :2510-8. )。KM等對臨床胃癌組織研究中發(fā)現(xiàn)，與胃癌分期、瘤細胞分化程度、侵襲、轉移密切相關(Clin Cancer Res. 2006, 12(11 Pt I) :3541-8. )。Yang 等在研究乳腺癌中發(fā)現(xiàn)其通過(FGFR-2)及信號通路的調控，參與乳腺癌的發(fā)生(22-23)。C80RF4參與Wnt信號轉導通路的激活，可以促進多種癌基因表達上調，與甲狀腺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的惡性轉化和進展有關。C80RF4蛋白可以激活環(huán)磷腺苷依賴的蛋白激酶A和蛋白激酶C，也可以被它們磷酸化，從而形成一個環(huán)路相互調節(jié)。已有很多研究證明蛋白激酶A和蛋白激酶C是甲狀腺細胞主要的信號轉導通路[J Mol Biol, 1999, 294(5):1351-1362. Horm Metab Res Suppl1990,23(1) :51-61]，表明TC-I蛋白與甲狀腺細胞的惡變密切相關。2007年Zeng等[IntJ Cancer, 2007, 121 (11) : 1265-1273]運用反轉錄病毒和慢病毒構建載體，轉導C80RF4基因至人乳腺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)乳腺上皮細胞錨著非依賴生長和生長因子非依賴性增殖良好，實驗發(fā)現(xiàn)該基因的表達與FGFR-2信號通路密切相關，應用高特異性FGFR/VEGFR抑制劑PD173074阻斷后，C80RF4基因的表達受到明顯抑制，表明該基因是FGFR信號通路的下游基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的問題在于一種重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞及其應用，通過將C80RF4基因轉染到HEC細胞中重組成C80RF4穩(wěn)定高表達的重組細胞，可應用于抗腫瘤藥物的篩選。
本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)一種重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞，以HEC細胞為宿主細胞，轉染含有C80RF4基因片段并能夠在me細胞中表達的外源性載體。所述的C80RF4基因的外源性表達抑制HEC-C80RF4腫瘤細胞的凋亡。所述的外源性載體為p3FLAG-CMV-C80RF4表達載體或pTRE3G_C80RF4表達載體；所述的p3FLAG-CMV-C80RF4表達載體是將C80RF4基因克隆到p3FLAG_CMV載體中；所述的PTRE3G-C80RF4表達載體是將C80RF4基因克隆到pTRE3G載體中。所述的重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞在抗子宮癌藥物的篩選中的應用。
所述的抗子宮癌藥物是以C80RF4基因或C80RF4蛋白為作用靶點的藥物。所述的抗子宮癌藥物為抵抗或消除C80RF4基因或C80RF4蛋白抑制腫瘤細胞凋亡作用的藥物。所述的抗子宮癌藥物為抑制C80RF4基因表達的藥物。所述的抗子宮癌藥物為與C80RF4蛋白拮抗或結合的藥物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果I、本發(fā)明構建了腫瘤相關基因C80RF4的真核p3FLAG-CMV_C80RF4表達載體，獲得了高表達C80RF4蛋白的腫瘤細胞，測序結果與基因庫編號NM_020130的C80RF4 mRNA序列完全一致，它們所編碼的氨基酸與NP_064515也完全一致；p3FLAG-CMV-C80RF4載體脂質體法轉染HEC細胞，獲得瞬時高表達C80RF4蛋白的腫瘤細胞株。在此的基礎上，構建了腫瘤相關基因C80RF4的真核pTRE3G_C80RF4表達載體，并將其轉染方法轉染ffiC細胞，經(jīng)過篩選獲得了獲得穩(wěn)定、高表達C80RF4分子的重組HEC-C80RF4腫瘤細胞株。2、pTRE3G-C80RF4載體轉染HEC腫瘤細胞后，發(fā)現(xiàn)C80RF4基因所翻譯的蛋白高表達時，對HEC細胞的凋亡有顯著影響C80RF4基因的表達抑制HEC腫瘤細胞的凋亡。實時定量PCR顯示在某些腫瘤性強的細胞中，C8orf4的基因表達有顯著增高。這表明C80RF4基因是子宮癌相關的癌基因，從而揭示C80RF4基因可以成為抗子宮癌的藥物的篩選靶點。3、C80RF4高表達的HEC-C80RF4重組細胞應用于以C80RF4為靶點的抗子宮癌藥物的篩選抵抗或消除C80RF4基因或C80RF4蛋白抑制腫瘤細胞凋亡作用的藥物，或者抑制C80RF4基因表達的藥物，或者與C80RF4蛋白拮抗或結合的藥物。4、C80RF4高表達的HEC-C80RF4重組腫瘤細胞提高了腫瘤細胞中C80RF4的表達，從而為以C8orf4為靶點的藥物提高其篩選特異性及靈敏性，為進一步研究其生物學特性及C8orf4通路蛋白的差異性比較研究，提高發(fā)現(xiàn)功能蛋白的有效性提供細胞模型。構建外源重組質粒應用于癌基因或其蛋白的生物學特性研究，提高研究的準確及有效性。


圖1-1是p3FLAG-CMV載體的質粒圖譜；1_2是pTRE3G質粒圖譜；圖2是western blotting檢測C8orf4基因在轉染瞬時腫瘤細胞及穩(wěn)定高表達細胞中的蛋白檢測圖，包括在細胞質及細胞核上的表達；圖3是流式細胞術檢測穩(wěn)定高表達C8orf4蛋白對腫瘤細胞凋亡具有顯著抑制作用；圖4是免疫組化檢測C8orf4在子宮癌組織中的表達的結果圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定 。I、構建真核表達載體 p3FLAG-CMV-C80RF4培養(yǎng)HEC細胞，提取該細胞總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。設計包含酶切位點EcoRI和Asp718的引物對，再以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得目的基因C80RF4，用EcoRI和Asp718酶切該基因，同時用EcoRI和Asp718酶切p3FLAG-CMV載體(其質粒圖譜如圖1_1所示，購自Sigma公司)；分別純化回收C80RF4片段和載體p3FLAG_CMV大片段，然后通過T4DNA連接酶連接，16°C條件下反應20小時，構建真核表達載體p3FLAG-CMV-C80RF4。將所得載體轉化大腸菌DH5a，在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板中37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中可見散在的菌落，作菌落克隆PCR，該PCR的一對引物如下上游引物5’GGATTTCCAA GTCTCCAC-3’ 18bp ；下游引物5，GGGGTACCTCAGTGAACTTT GATGGAATAT TTCCG-3’ 35bp ；其中，上游引物含CMV酶切位點，下游引物含ASP718酶切位點?？寺CR 反應條件為Taq DNA 多聚酶 0. I ii L ;10XBuffer (Mg+) I. 5 ii L ;dNTPMix I. 5 u L ;上游引物(sense, 100 u mol/L) 0. 15 u L ;下游引物(antisense, 100 u mol/L)0. 15u L ；ddH20 11. 6u L ;模板為挑克??；總量15y L。該PCR的反應條件為95°C預變性Imin ;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin,循環(huán)數(shù)35 ;72°C延伸3min。作凝膠電泳檢測轉化成功的克隆,測序結果與基因庫C80RF4基因序列完全一致，說明真核表達載體P3FLAG-CMV-C80RF4構建成功。然后大量質粒提取，獲得p3FLAG-CMV-C80RF4的DNA質粒。2、p3FLAG-CMV-C80RF4表達載體轉染HEC細胞及其蛋白表達檢測采用脂質體2000試劑盒(Invitrogen公司)將質粒轉入HEC細胞。在轉染前一天，在24孔板內鋪上0. 5 X IO5細胞，500ul無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，到轉染時使細胞達到80% 90%的匯合率。將DNA質粒溶于50ul無血清的Opti — MEMI Reduced Serum Medium 中?；旌暇鶆?。將適量 Lipofectamine 2000 溶于 50ul 無血清的Opti -MEM I中，混合均勻。在室溫下孵育5分鐘，然后，將上述兩種混合物混合(總體積lOOul)。輕輕混合均勻在室溫下孵育25分鐘。在24孔板中每孔加入IOOul的復合物以及適量培養(yǎng)基。十字法混合均勻。細胞在37° C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后檢測。采用western blotting法檢測轉化細胞中C80RF4表達。轉染的HEC細胞，用RIPA裂解細胞提取細胞總蛋白，98°C變性5min，蛋白定量。取25 u I變性后蛋白上樣于12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體硝酸纖維素薄膜上，5%BAS/PBS封閉I小時，以兔抗人C80RF4抗體為一抗，4°C孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG為二抗孵育30min，經(jīng)過顯影，對細胞質和細胞核中C80RF4的表達檢測，如圖2所示。
其中A:轉染pTRE3G-C80RF4的細胞c8orf4在胞質中表達。B:未轉染的細胞c8orf4在胞質中表達。E:轉染p3FLAG-CMV-C80RF4的細胞c8orf4在胞質中表達。F:未轉染的細胞c8orf4在胞質中表達。結果顯示構建的p3FLAG-CMV-C80RF4-HEC高表達C80Rf4基因及蛋白的細胞株，western blotting檢測顯示轉染C80Rf4在胞質及核中均有高表達。3、構建真核表達質粒pTRE3G-C80RF4取p3FLAG-CMV-C80RF4 質粒，用 Sacl 酶切該質粒取質粒 DNA 2ul, IOXL Buffer2ul, ddH20 14ul，Seal 2ul，總量20ul，37 ° C 5-6小時，然后純化，取該步驟純化DNA32ul, IOXK Buffer 4ul，Asp7184ul，總量 40ul，37。Cl 小時，再純化。對該純化的DNA末端進行平滑化(使用碧云天公司的末端平滑試劑盒具體操作按試劑盒說明操作)，再進行5’末端的磷酸化后，獲得的DNA與pTRE3G載體進行連接取上述獲得的DNA 4ul，pTRE3G (其質粒圖譜如1-2所示，可商購獲得)lul，ligation mix 5ul,總量IOul, 16° C 30min,常規(guī)轉化大腸菌DH5a,在含氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板中37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中可見散在的菌落，作菌落克隆PCR，可獲得pTRE3G-C80RF4質粒，完成該質粒的構建。4、pTRE3G-C80RF4表達載體轉染HEC細胞及其蛋白表達檢測在轉染前一天，在24孔板內鋪上0. 5 X IO5細胞，500ul無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，到轉染時使細胞達到80% 90%的匯合率。轉染第一孔細胞，將DNA質粒3ul溶于97ulXfect buffer 中為試劑 1，I. 5ul Xfect polymer, 98. 5ulXfect buffer 為試劑 2,將試劑 I與2混合，靜置lOmin，加入到培養(yǎng)液中，37° C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，換培養(yǎng)液。轉染第二孔細胞，取DNA 質粒 2ul, IOOng puro-marker 2ul,溶于 96. 8ulXfectbuffer 中為試劑 I, I. 5ul Xfect polymer,98. 5ul Xfect buffer 為試劑 2,將試劑 I 與 2混合，靜置lOmin，加入到培養(yǎng)液中，37° C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，換培養(yǎng)液。上述第一孔細胞24小時后,棄去培養(yǎng)液,加Iml無血清培養(yǎng)液,再將3ul expresstransactivation, 2. 5ul intensif ier reagent 加到 200ul 無血清培養(yǎng)液中，混合后，加到上述2孔細胞中，37° C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I小時后，加含血清培養(yǎng)液lml，37° C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后，檢測第一孔細胞中C80RF4的轉染效率，采用western blotting法，方法同前所述，結果如圖5所示。上述第二孔細胞換為含2ug/ml的嘌磷霉素(sigma公司試劑)進行穩(wěn)定細胞的篩選。6-8周左右挑單克隆細胞15個，在96孔板中培養(yǎng)，然后將15個細胞移到24孔板培養(yǎng)，細胞生長達到50-60%的匯合率時，棄去培養(yǎng)液，加Iml無血清培養(yǎng)液，再將3ul expresstransactivation, 2. 5ul intensif ier reagent 加到 200ul 無血清培養(yǎng)液中，混合后，加到上述各孔細胞中，37° C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I小時后，加含血清培養(yǎng)液lml，37° C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二孔轉染細胞加pUix)-marker，目的可以進行單克隆篩選，而第一空不具備單克隆篩選條件。24-48小時,分別提取每孔細胞蛋白，采用western blotting法檢測轉染成功的穩(wěn)定高表達C80RF4的細胞株。western blotting檢測結果如圖2所不，其中C:轉染pTRE3G_C80RF4的細胞、c8orf4在胞核中表達。D:未轉染的細胞c8orf4在胞核中表達。G:轉染p3FLAG-CMV-C80RF4的細胞c8orf4在胞核中表達。H:未轉染的細胞c8orf4在胞核中表達。結果顯示無論是轉染P3FLAG-CMV-C80RF4的瞬時表達細胞，還是轉染PTRE3G-C80RF4的穩(wěn)定表達細胞，C80Rf4基因及蛋白在胞質及核中均有高表達。5、對穩(wěn)定高表達C80RF4細胞的檢測C80RF4對HEC細胞凋亡的抑制IXlO6Ail轉染不同時期的HEC細胞(以轉染C8orf4未高表達的細胞作為對照)力口入 500ul 的binding buffer懸浮，加 2ul Annexin V-FITC混勻后，加 5ul Propiium Iodide 混勻(試劑為Invitrogen公司)，避光室溫20分鐘，流式細胞儀檢測，結果由四個象限組成的細胞直方圖，每個象限的細胞數(shù)目就是在檢測細胞總數(shù)在所點的組份。左下象限代表正常細胞(An-PI-)，右下象限代表早期凋亡細胞(An+PI-)，右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞(An+PI+)，左上象限代表細胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞(An-PI+)，結果如圖3所示左側一列為轉然后C8orf4高表達的細胞(A、C、E)，右側一列(B、D、F)為轉染C8orf4未高表達的細胞，分別檢測了兩組細胞Ohr (A)，24hr (C)，48hr (E)，圖3顯示轉染后C8orf4高表達細胞凋亡數(shù)顯著少于未高表達組，C8orf4基因表達的蛋白對腫瘤細胞凋亡有顯著抑制作用。在HEC細胞中對致瘤性強的瘤細胞(致瘤性強的瘤細胞的篩選為通過腫瘤標記物在流式細胞儀中分離獲得)C80RF4基因含量有顯著性增高。實時定量PCR檢測(具體采用Takara公司實時定量PCR試劑來操作)，檢測結果如下表所示
權利要求
1.一種重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞，其特征在于，以HEC細胞為宿主細胞，轉染含有C80RF4基因片段并能夠在HEC細胞中表達的外源性載體。
2.如權利要求I所述的重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞，其特征在于，所述的C80RF4基因的外源性表達抑制HEC-C80RF4腫瘤細胞的凋亡。
3.如權利要求I所述的重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞，其特征在于，所述的外源性載體為 p3FLAG-CMV-C80RF4 表達載體或 pTRE3G_C80RF4 表達載體； 所述的P3FLAG-CMV-C80RF4表達載體是將C80RF4基因克隆到p3FLAG_CMV載體中； 所述的PTRE3G-C80RF4表達載體是將C80RF4基因克隆到pTRE3G載體中。
4.權利要求I所述的重組的HEC-C80RF4腫瘤細胞在抗子宮癌藥物的篩選中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的抗子宮癌藥物是以C80RF4基因或C80RF4蛋白為作用靶點的藥物。
6.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的抗子宮癌藥物為抵抗或消除C80RF4基因或C80RF4蛋白抑制腫瘤細胞凋亡作用的藥物。
7.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的抗子宮癌藥物為抑制C80RF4基因表達的藥物。
8.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的抗子宮癌藥物為與C80RF4蛋白拮抗或結合的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組的HEC-C8ORF4腫瘤細胞及其應用，以HEC細胞為宿主細胞，轉染含有C8ORF4基因片段并能夠在HEC細胞中表達的外源性載體。重組的HEC-C8ORF4腫瘤細胞在抗子宮癌藥物的篩選中的應用篩選以C8ORF4基因或C8ORF4蛋白為作用靶點的藥物。
文檔編號C12Q1/02GK102747037SQ201210224850
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月2日 優(yōu)先權日2012年7月2日
發(fā)明者任淑婷, 劉潔, 張彥民, 王毓, 王雨楠, 羅文娟, 郭遠文 申請人:西安交通大學