專利名稱：凝血因子vii 的糖基型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含凝血因子VII以及其它具有改變的天冬酰胺連接型糖基化模式的凝血因子的組合物。
背景技術(shù)：
與凝血級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)的蛋白包括,例如凝血因子VII,凝血因子VIII,凝血因子IX，凝血因子X，以及蛋白C，它們經(jīng)證實都可以作為有效治療劑用于治療各種病癥。因此，對包含這些蛋白并預(yù)先確定了臨床效力的單一形式可藥用配制劑的需求不斷增長。由于使用人血漿作為藥用產(chǎn)物的來源有諸多不利，優(yōu)選在重組系統(tǒng)中制備這些蛋白。但凝血蛋白都有多種多樣的翻譯和翻譯后修飾，包括，例如glu殘基的天冬酰胺連接的(N-連接的)糖基化；0_連接的糖基化；以及Y-羧基化。當(dāng)使用異源細(xì)胞作為宿主來大量制備所述蛋白時，這些修飾可能存在質(zhì)或量的差異。特別是，在異源細(xì)胞中的制備通常導(dǎo)致糖基型(glycoform)的不同排列，即相同的多肽具有不同的共價連接的寡糖結(jié)構(gòu)。在不同的系統(tǒng)中，治療性蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)的變化至少與致免疫性和體內(nèi)清除的改變有關(guān)。因此，本領(lǐng)域需要能提供凝血蛋白制劑的組合物和方法，尤其是包含重組人凝血因子VII，修飾的凝血因子VII，或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，且所述制劑具有預(yù)先確定的糖基型模式。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，它們表現(xiàn)出預(yù)先確定的糖基型模式。本文中，凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)制劑是指已經(jīng)從合成它們的細(xì)胞中分離出來的多種凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽，包括變體和化學(xué)修飾形式，以及經(jīng)蛋白裂解活化的形式(如凝血因子Vila)。糖基型是指制劑中具有多樣化結(jié)構(gòu)、并與凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽共價連接的寡糖鏈的分布。本發(fā)明一個方面提供了包含多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺連接的寡糖鏈并且具有以下一或多種特征(i)約94-100%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分；(ii)約0-7%的寡糖鏈為電中性；(iii)約16%以下(如約6-16% )的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基；(iv)約25%以下(如約6-9% )的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基；或(V)約30%以下(如約11-23% )的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基。在一些實施方案中，除了(i)-(v)的一或多項以外寡糖鏈中的所有唾液酸殘基與半乳糖經(jīng)由α2->3鍵連接；至少部分唾液酸殘基除了包含N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)以外，還包含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc);和/或寡糖鏈包含巖藻糖殘基，它通過α 1_>6鍵與核心N-乙酰葡糖胺連接。在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種含野生型凝血因子VIIa的制劑，其中約94-100%的寡糖鏈具有至少一個唾液酸殘基，且所有的唾液酸殘基都經(jīng)由α 2->3鍵與半乳糖連接。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種含野生型凝血因子VIIa的制劑，其中約94-100%的寡糖鏈具有至少一個唾液酸殘基，且至少一部分唾液酸殘基為N-乙醇酰神經(jīng)氨酸。在另一實施方案中，本發(fā)明包括一種含野生型凝血因子VIIa的制劑，其中約94-100%的寡糖鏈具有至少一個唾液酸殘基，且至少部分所述鏈包含N-乙酰半乳糖胺。本發(fā)明的制劑因此不包含已從人血漿中分離出來但未在體外經(jīng)糖苷酶處理而被修飾的野生型凝血因子VII或凝血因子Vila。本發(fā)明另一方面提供了包含多種凝血因 子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制齊U，其中所述多肽包含天冬酰胺連接的寡糖鏈且其中至少約2%的寡糖鏈包含至少一個與天線式(antennary)N-乙酰葡糖胺殘基(即，與Man殘基經(jīng)由β 1_>2，4或6鍵連接的N-乙酰葡糖胺殘基)經(jīng)由α 1->3鍵連接的巖藻糖。優(yōu)選至少約5%的寡糖鏈包含至少一個上述天線式巖藻糖殘基；更優(yōu)選至少約10%或20% ;最優(yōu)選至少約40%。本發(fā)明的制劑可包含一或多種下述物質(zhì)未經(jīng)修飾的野生型凝血因子VII ;經(jīng)過化學(xué)修飾和/或酶修飾的野生型凝血因子VII ;以及在相對于野生型凝血因子VII的氨基酸序列中包含一或多個改變的凝血因子VII變體。本發(fā)明的制劑可以衍生自，由其內(nèi)源性凝血因子VII基因表達(dá)凝血因子VII的人類細(xì)胞，或經(jīng)編程而由重組基因表達(dá)凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的細(xì)胞。本發(fā)明另一方面提供了包含凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，所述凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽表現(xiàn)出一或多種改進(jìn)的功能特性，包括，但不限于，保存穩(wěn)定性、生物可利用度和/或半壽期都提高。本發(fā)明另一方面包括對凝血因子VII和凝血因子VII相關(guān)多肽的糖基型模式進(jìn)行測定和/或最優(yōu)化的方法，包括以下步驟(a)在第一組預(yù)定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能表達(dá)凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的細(xì)胞；(b)從上述培養(yǎng)中回收凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽，以便獲得包含所述多肽的制劑；和(C)分析與所述多肽相連的寡糖的結(jié)構(gòu)，以便確定該制劑的糖基型模式。本發(fā)明還可包括將步驟(a)的培養(yǎng)條件變?yōu)榈诙M預(yù)定培養(yǎng)條件；以及重復(fù)所述步驟，直至獲得所需的糖基型模式。備選地，所述方法還可包括對制劑進(jìn)行化學(xué)處理或酶處理，以改變寡糖的結(jié)構(gòu)；并重復(fù)所述步驟，直至獲得所需糖基型模式。所述方法還可以進(jìn)一步包括以下步驟對具有預(yù)定的糖基型模式的制劑進(jìn)行至少一種檢測生物活性或其它功能(如藥代動力學(xué)特性譜或穩(wěn)定性)的試驗，并將特定的糖基型模式與特定的生物活性或功能特性聯(lián)系起來。本發(fā)明另一方面提供了制備包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑的方法，所述凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽具有預(yù)定的N-連接的糖基化模式。在一些實施方案中，所述方法通過培養(yǎng)能表達(dá)所述多肽的細(xì)胞來進(jìn)行，其中與凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽連接的至少約94%的天冬酰胺-連接型寡糖包含至少一個唾液酸殘基，例如，1、2、3、或4個唾液酸殘基。在一些實施方案中，所述方法通過培養(yǎng)能表達(dá)所述多肽的細(xì)胞來進(jìn)行，其中至少約5%的寡糖鏈包含至少一個與天線式N-乙酰葡糖胺殘基以α1_>3鍵相連的巖藻糖。在一些實施方案中，凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽，不管是何種來源，都接受酶處理，以便獲得所需糖基型模式。本發(fā)明另一方面提供了包含本發(fā)明制劑的藥用配制劑以及預(yù)防和/或治療那些應(yīng)答凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽而出現(xiàn)的綜合征的方法。所述方法包括，在增強或抑制凝血效應(yīng)的條件下，對需要治療的患者給藥所述藥用配制劑。在一組實施方案中，在希望增強凝血的情況下，給藥凝血因子VII制劑，所述情況如血友病Α，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板減少癥，或von Willebrand?。话橛心蜃右种苿┐嬖诘木C合征；外科手術(shù)或抗凝血治療之前、期間、或之后；或受創(chuàng)后。在另一組實施方案中，給藥凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑(即 相對于野生型凝血因子VII具有降低的或改變的生物活性的制劑)以便減少凝血，這類情況例如，接受血管成形術(shù)的患者，或罹患以下疾病的患者深部靜脈血栓癥，肺栓塞，休克，彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內(nèi)毒素血癥相關(guān)的肺部和腎臟纖維蛋白沉積，或心肌梗塞。根據(jù)本發(fā)明，還可以在需要改變(如降低)經(jīng)由組織因子(TF)介導(dǎo)的途徑進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的情況中給藥凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，以便治療，例如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答綜合征(SIRS)，溶血性尿毒綜合征(HUS)，多發(fā)性器官功能衰竭(MOF)，以及血小板減少性紫癜(TTP)。本申請涉及下述各項。I.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中94-99%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分。2.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約1-7%的寡糖鏈為電中性。3.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約6-16%的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基。4.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約6-9%的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基。5.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約11-23%的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基。6.含有多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中約2%的寡糖鏈包含至少一個以α 1->3構(gòu)型與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。7.項1-6任一項的制劑，其中所述寡糖鏈中的唾液酸殘基以α 2_>3鍵與半乳糖連接。8.項1-7任一項的制劑，其中所述唾液酸殘基包含N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)和N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)。9.項1-8任一項的制劑，其中所述寡糖包含以α 1->6鍵與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖。10.項1-9任一項的制劑，其中約95-98%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。
11.項1-10任一項的制劑，其中約96-97%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。12.項1-11任一項的制劑，其中約2-4%的寡糖鏈為電中性。13.項1-12任一項的制劑，其中約8-12%的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基。14.項1-13任一項的制劑，其 中約7-8%的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳
糖胺殘基。15.項1-14任一項的制劑，其中約12-18%的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖或
N-乙酰半乳糖胺殘基。16.項1-15任一項的制劑，其中至少約5%的寡糖鏈包含至少一個以α 1_>3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。17.項1-16任一項的制劑，其中至少約10%的寡糖鏈包含至少一個以α 1->3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。18.項1-17任一項的制劑，其中至少約20%的寡糖鏈包含至少一個以α 1->3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。19.項1-18任一項的制劑，其中至少約40%的寡糖鏈包含至少一個以α 1->3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。20.項1-19任一項的制劑，其中所述多肽具有野生型凝血因子VII的氨基酸序列。21.項1-20任一項的制劑，其中所述多肽是野生型凝血因子Vila。22.項1-19任一項的制劑，其中所述凝血因子VII多肽選自S52A_凝血因子VII，S60A-凝血因子VII，在殘基290和291之間被蛋白裂解的凝血因子VII，在殘基315和316之間被蛋白裂解的凝血因子VII ;以及氧化型凝血因子VII。23.項1-19任一項的制劑，其中所述凝血因子VII相關(guān)多肽選自R152E_凝血因子VII，S344A-凝血因子VII，F(xiàn)FR-凝血因子VII，以及缺乏Gla結(jié)構(gòu)域的凝血因子Vila。24.包含多種凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，并且其中(i)約94-100%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分，且(ii)約6-9%的寡糖鏈包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基。25.項24的制劑，其中所述凝血因子VII多肽具有野生型凝血因子VII的序列。26.包含多種凝血因子VIIa多肽的制劑，所述多肽具有野生型凝血因子VII的序列，并且所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，其中約94-99%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。27.包含多種凝血因子VIIa多肽的制劑，所述多肽具有野生型凝血因子VII的序列，并且所述多肽包含天冬酰胺-連接的寡糖鏈，其中至少約2%的寡糖鏈包含至少一個以α 1->3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖部分。28.項1-27任一項的制劑，其中所述多肽產(chǎn)生于選自真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或脊椎動物細(xì)胞的宿主細(xì)胞。29.項28的制劑，其中所述細(xì)胞是哺乳動物的細(xì)胞。30.項29的制劑，其中所述哺乳動物細(xì)胞來自倉鼠。31.項30的制劑，其中所述倉鼠細(xì)胞選自CHO細(xì)胞或BHK細(xì)胞。32.項29的制劑，其中所述哺乳動物細(xì)胞來自人類。
33.項32的制劑，其中所述人類細(xì)胞是HEK細(xì)胞。34.項1-33任一項的制劑，其中所述制劑具有參照制劑的至少約110%的生物可利用度，其中參照制劑中約93%或更少的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分。35.項34的制劑，其中所述制劑具有參照制劑的至少約120%的生物可利用度。36.項35的制劑，其中所述制劑具有參照制劑的至少約130%的生物可利用度。37.項36的制劑，其中所述制劑具有參 照制劑的至少約140%的生物可利用度。38.測定凝血因子VII和凝血因子VII相關(guān)多肽的糖基型模式的方法，該方法包括(a)在第一組預(yù)定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能表達(dá)凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的細(xì)胞；(b)從上述培養(yǎng)中回收凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽，以獲得包含這些多肽的制劑；和(C)分析與這些多肽連接的寡糖的結(jié)構(gòu),從而確定所述制劑的糖基型模式。39.項38的方法，還包括(dl)改變步驟(a)的培養(yǎng)條件，得到第二組預(yù)定的培養(yǎng)條件；(el)重復(fù)步驟(b)-(dl)，直至獲得所需的糖基型模式。40.項38的方法，還包括(d2)對所述制劑進(jìn)行化學(xué)處理或酶處理，以改變寡糖的結(jié)構(gòu)；和(e2)重復(fù)步驟(b)_(d2)，直至獲得所需糖基型模式。41.制備含有凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相關(guān)多肽的制劑的方法，所述多肽具有預(yù)定的N-連接型糖基化模式，所述方法包括培養(yǎng)能表達(dá)所述多肽的細(xì)胞，所用的培養(yǎng)條件使所述多肽上至少約94%的天冬酰胺-連接型寡糖包含至少一個唾液酸殘基。42. 一種藥用配制劑，其包含項1-37任一項的制劑和一種可藥用載體或添加劑。43.治療凝血因子VII-應(yīng)答性綜合征的方法，所述方法包括，在使出血減少和/或使凝血增加的條件下，對需要相應(yīng)治療的患者給藥項42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII多肽。44.項43的方法，其中所述綜合征選自血友病A，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板減少癥，von Wi 11 ebrand病，凝血因子抑制劑的存在，外科手術(shù)，創(chuàng)傷或抗凝治療。45.預(yù)防不希望發(fā)生的出血的方法，所述方法包括，在使出血減少和/或使凝血增加的條件下，對需要相應(yīng)治療的患者給藥項42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII多肽。46.預(yù)防不希望發(fā)生的凝血的方法，所述方法包括，在能有效抑制凝血的條件下，對需要相應(yīng)治療的患者給藥項42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII相關(guān)多肽。47.預(yù)防組織因子介導(dǎo)的反應(yīng)的方法，所述方法包括，在能有效抑制凝血的條件下，對需要相應(yīng)治療的患者給藥項42所述的藥用配制劑，其中所述配制劑包含凝血因子VII相關(guān)多肽。48.項46的方法，其中所述不希望發(fā)生的凝血與選自下組的疾病有關(guān)血管成形術(shù)，深部靜脈血栓，肺栓塞，休克，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的肺或腎內(nèi)纖維蛋白沉積，或心肌梗塞。49.項47的方法，其中所述組織因子介導(dǎo)的反應(yīng)與選自SIRS，ARDS, MOF, HUS，或TTP的疾病有關(guān)。50.項1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑的用途，用于制備治療凝血因子VII應(yīng)答性綜 合征的藥物。51.項50的用途，其中所述綜合征選自血友病A，血友病B，凝血因子XI缺陷，凝血因子VII缺陷，血小板減少癥，von Wi 11 ebrand病，凝血因子抑制劑的存在，外科手術(shù)，創(chuàng)傷或抗凝治療。52.項1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑的用途，用于制備預(yù)防不希望發(fā)生的出血的藥物。53.項1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑的用途，用于制備預(yù)防不希望發(fā)生的凝血的藥物。54.項53的用途，其中所述不希望發(fā)生的凝血與選自下組的疾病有關(guān)血管成形術(shù)，深部靜脈血栓，肺栓塞，休克，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的肺或腎內(nèi)纖維蛋白沉積，或心肌梗死。55.項1-37任一項所述的包含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑的用途，用于制備預(yù)防組織因子介導(dǎo)的反應(yīng)的藥物。56.項55的用途，其中所述組織因子介導(dǎo)的反應(yīng)與選自SIRS，ARDS, MOF, HUS，或TTP的疾病有關(guān)。發(fā)明詳述本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，具有預(yù)定的糖基型模式的凝固蛋白的制劑表現(xiàn)出改進(jìn)的功能特性。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及提供這些蛋白制劑的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及包含凝血因子VII多肽和凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，所述制劑具有預(yù)定的特異性天冬酰胺-連接型(N-連接型)寡糖模式。本發(fā)明的制劑表現(xiàn)出改變的特性，包括，但不限于，改進(jìn)的藥代動力學(xué)特性和改進(jìn)的臨床效力。本發(fā)明還包括含有這些制劑的藥用配制劑，以及應(yīng)用這些配制劑進(jìn)行的治療方法。凝血因子VII多肽和凝血因子VIl相關(guān)多肽本發(fā)明涉及凝血因子VII多肽，如具有美國專利4，784，950中公開的氨基酸序列的那些(野生型凝血因子VII)。本文中，“凝血因子VII”或“凝血因子VII多肽”包括野生型凝血因子VII，以及生物學(xué)活性與野生型凝血因子VII相比實質(zhì)上相同或有改進(jìn)的凝血因子VII變體。術(shù)語“凝血因子VII”旨在包括凝血因子VII多肽的未切割形式(酶原形式)，以及經(jīng)過蛋白裂解性加工產(chǎn)生了各自的生物活性形式的那些多肽，它們可稱為凝血因子Vila。通常，凝血因子VII在殘基152和153之間切割而產(chǎn)生凝血因子Vila。本文中，“凝血因子VII相關(guān)多肽”包括多肽和變體，其中凝血因子VIIa的生物學(xué)活性與野生型凝血因子VIIa相比得到實質(zhì)上的修飾或已減弱。這些多肽包括，但不限于，經(jīng)過化學(xué)修飾的凝血因子VII或凝血因子Vila，以及引入了特異性氨基酸序列改變從而修飾或破壞了該多肽的生物活性的凝血因子VII變體。凝血過程中，凝血因子VIIa的生物學(xué)活性源于其以下能力⑴與組織因子(TF)結(jié)合，和(ii)催化凝血因子IX或凝血因子X的蛋白裂解性切割，從而產(chǎn)生活化的凝血因子IX或X (分別為凝血因子IXa或Xa)。為了本發(fā)明的目的，凝血因子VIIa的生物學(xué)活性可以通過利用凝血因子VII-缺陷型血漿和凝血酶致活酶測量制劑促進(jìn)凝血的能力來定量，如美國專利5，997，864所述。在該試驗中，將生物學(xué)活性表示為凝血時間相對于對照樣品的減少，并將其與含有I單位/ml凝血因子VII活性的人血清標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較而轉(zhuǎn)換為“凝血因子VII單位”。定量凝血因子VIIa的生物學(xué)活性的另一種方法是(i)測量凝血因子VIIa在含有包埋于脂質(zhì)膜中的TF的系統(tǒng)中產(chǎn)生凝血因子Xa的能力以及產(chǎn)生凝血因子X的能力(Persson 等，J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997) ；(ii)測量凝血因子 X 在含水系統(tǒng)中的水解(參見下文實施例5) ； (iii)測量其與TF的物理結(jié)合，使用基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振(surface plasmonresonance)的儀器(Persson, FEBS Letts. 413:359-363，1997) ； (iv)測量合成底物的水解(參見下文實施例4);和(V)測量TF-非依賴性體外系統(tǒng)中凝血酶的產(chǎn)生。具有與野生型凝血因子VIIa相比實質(zhì)上相同或有改進(jìn)的生物學(xué)活性的凝血因子VII變體包括在上述凝血試驗、蛋白裂解試驗和/或 TF結(jié)合試驗中測得，比活性為相同細(xì)胞類型產(chǎn)生的野生型凝血因子VIIa的至少約25%，優(yōu)選至少約50%，更優(yōu)選至少約75%，最優(yōu)選至少約90%的那些。具有與野生型凝血因子VIIa相比實質(zhì)上減弱的生物學(xué)活性的凝血因子VII變體包括在上述凝血試驗、蛋白裂解試驗和/或TF結(jié)合試驗中測得，比活性為相同細(xì)胞類型產(chǎn)生的野生型凝血因子VIIa的至少約25%，優(yōu)選至少約10%，更優(yōu)選至少約5%，最優(yōu)選至少約1%的那些。具有與野生型凝血因子VII相比有實質(zhì)修飾的生物學(xué)活性的凝血因子VII變體包括，但不限于，具有TF-非依賴性凝血因子X的蛋白裂解活性的凝血因子VII變體，以及結(jié)合TF但不裂解凝血因子X的那些。凝血因子VII的變體，無論是具有與野生型凝血因子VII實質(zhì)上相同或更好的生物活性，還是具有與野生型凝血因子VII相比有實質(zhì)修飾的或減弱的生物活性，這樣的變體可包括，但不限于具有因插入、缺失、或取代一或多個氨基酸而不同于野生型凝血因子VII的氨基酸序列的多肽。具有與野生型凝血因子VII相比實質(zhì)上相同的生物學(xué)活性的凝血因子 VII 變體包括S52A-FVIIa, S60A_FVIIa(lino 等，Arch. Biochem.Biophys. 352:182-192，1998);具有增強的蛋白裂解穩(wěn)定性的FVIIa變體，其公開在美國專利5，580, 560中；已經(jīng)在殘基290和291之間或殘基315和316之間被蛋白裂解的那些凝血因子 Vila(Mollerup 等，Biotechnol. Bioeng. 48:501-505，1995);以及氧化型凝血因子 Vila(Kornfelt 等，Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54，1999)。具有與野生型凝血因子VII相比實質(zhì)上減弱或有修飾的生物學(xué)活性的凝血因子VII變體包括R152E-FVIIa (Wildgoose 等，Biochem29 : 3413-3420, 1990) , S344A-FVIIa (Kazama等，J. Biol. Chem. 270:66-72，1995)，F(xiàn)FR-FVIIa (Holst 等，Eur. J. Vase. Endovasc.Surg. 15:515-520，1998)，以及缺乏 Gla 結(jié)構(gòu)域的凝血因子 Vila (Nicolaisen 等，F(xiàn)EBSLetts. 317:245-249, 1993)?；瘜W(xué)修飾的凝血因子VII多肽以及序列變體的非限制性實例參見，例如，美國專利5，997，864。 天冬酰胺-連接型糖基化本發(fā)明提供了凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相關(guān)多肽的制劑，它包含特定譜的凝血因子VII糖基型，即具有預(yù)定的天冬酰胺-連接型(N-型)寡糖鏈的凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽。本文中，N-連接型糖基化的“模式”或糖基型“模式”，“分布”，或“譜”，是指給定的凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽群體內(nèi)具 體的寡糖結(jié)構(gòu)。這類模式的非限制性實例包括寡糖鏈的以下相關(guān)部分(i)具有至少一個唾液酸殘基；(ii)缺乏任何唾液酸殘基(即，為電中性)具有至少一個末端半乳糖殘基；(iv)具有至少一個末端N乙酰半乳糖胺殘基；(V)具有至少一個“未加帽”的天線(antenna)，S卩，具有至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基；或(vi)具有至少一個以α 1->3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺殘基連接的巖藻糖。本文中，寡糖鏈?zhǔn)侵概c單個天冬酰胺殘基共價連接的整個寡糖結(jié)構(gòu)。凝血因子VII通常在Asn 145和Asn 322發(fā)生糖基化。人體中原位產(chǎn)生的凝血因子VII上的N-連接型寡糖鏈可以是雙-，三，或四天線式，每一天線中，Neu5Ac ( α 2->3或a 2_>6)Gal ( β 1_>4)GlcNAc 與 Man 殘基以(β1_>2，4，或 6)連接，所述 Man 殘基與 Man ( β 1_>4) GlcNAc ( β 1_>4)GlcNAc-Asn以(α 1->3或6)連接。(Neu5Ac表示N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺，Man表示甘露糖)。寡糖鏈還可包含巖藻糖殘基，其可與GlcNAc以α 1_>6連接。當(dāng)凝血因子VII在人體中原位產(chǎn)生時，一些寡糖鏈缺失核心的巖藻糖殘基；所有鏈缺乏天線式巖藻糖殘基；且所有鏈都幾乎被徹底唾液酸化，即，每一天線的末端糖是與半乳糖經(jīng)α 2->3或α 2_>6鍵連接的N-乙酰神經(jīng)氨酸。但是，在其它情況下產(chǎn)生時，凝血因子VII可能包含以下寡糖鏈，它們在一或多個天線上具有不同末端結(jié)構(gòu)，如缺乏唾液酸殘基；包含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)殘基；包含末端N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)殘基以替代半乳糖；等等。如果是在有牛血清時培養(yǎng)的BHK細(xì)胞中產(chǎn)生，凝血因子VII具有以下寡糖模式—87-93%的寡糖鏈包含至少一個單個的唾液酸殘基；—7-13%為中性(無任何唾液酸)；—9-16%包含至少一個末端半乳糖殘基；-19-29%包含至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基；和—30-39%包含至少一個未加帽的天線，S卩，包含至少一個末端半乳糖或N-乙酰
半乳糖胺殘基。本發(fā)明人制備了包含預(yù)定的特異性寡糖模式的凝血因子VII制劑，其寡糖模式不同于已經(jīng)描述的那些。本發(fā)明涉及含有凝血因子VII多肽或凝血因子VII-相關(guān)多肽的制齊U，所述多肽具有一或多種下述糖基型模式(i)約94-100%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基，如約94-99%，約95-98%，或約96-97%。在不同的實施方案中，至少約94%，95%，96%，或97%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基。(ii)6%或更少的寡糖鏈為中性，如約I. 5-6%或約2-4%。(iii)約16%以下，優(yōu)選約10%以下的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖，如約6-10% 或約 8-9% ；(iv)約25%以下，優(yōu)選約10%以下的寡糖鏈包含至少一個末端GalNAc殘基，如約69% 或約 7-8% ；(V)約30%以下，優(yōu)選約25%以下的寡糖鏈包含至少一個未加帽的天線，如約11-23%或約 12-18% ;和(vi)至少約2 %，優(yōu)選至少約5 更優(yōu)選至少約10 %或20 最優(yōu)選至少約40%的寡糖鏈包含至少一個與天線式N-乙酰葡糖胺殘基以al->3連接的巖藻糖(即，以β 1->2，4，或6鍵與Man殘基連接的N-乙 酰葡糖胺殘基)?？梢岳斫?，上述(i)-(vi)的每一項代表了包含在本發(fā)明中的一種不同的糖基型模式，即，本發(fā)明的制劑可以用上述(i)-(vi)中的僅一項來描述。也可以根據(jù)具體的糖基型模式，用上述(i)-(vi)的不止一項來描述本發(fā)明的制劑。此外，本發(fā)明的制劑可以用上述(i)-(vi)中的一或多項結(jié)合一或多個其它結(jié)構(gòu)特征來描述。例如，本發(fā)明包括含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，所述多肽中的唾液酸殘基(Neu5Ac或Neu5Gc)與半乳糖僅以α 2_>3構(gòu)型連接。本發(fā)明還包括含凝血因子VII多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，所述多肽包含以α 1->6鍵與核心的N-乙酰葡糖胺連接和/或以α 1->3鍵與天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖。在一系列實施方案中，本發(fā)明的制劑包含下述凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽，其中99%以上的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基且(a)所述唾液酸殘基僅以α2_>3構(gòu)型連接和/或(b)具有與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖殘基和/或(C)可檢測的數(shù)量的天線止于N-乙酰半乳糖胺。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有野生型凝血因子VIIa的制劑，所述因子中，99%以上的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基且該唾液酸殘基與半乳糖僅以α 2->3構(gòu)型連接。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含野生型凝血因子VIIa的制劑，所述因子中，99%以上的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基且至少部分寡糖鏈包含N-乙酰半乳糖胺。本發(fā)明不涉及從人血漿中分離出來并且未通過用糖苷酶處理而回體(ex vivo)修飾的野生型凝血因子VII或野生型凝血因子Vila。在一個實施方案中，凝血因子Vila制劑包含下述寡糖鏈，其有單個巖藻糖以α 1->3構(gòu)型與N-乙酰葡糖胺連接。在另一實施方案中，凝血因子VIIa制劑包含下述寡糖鏈，其具有以α 1->3構(gòu)型與雙天線寡糖的每一天線N-乙酰葡糖胺殘基連接的巖藻糖殘基(唾液酸Lewis X結(jié)構(gòu))。在另一實施方案中,凝血因子VIIa制劑包含下述寡糖鏈(i)具有與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖，和(ii)具有以al->3構(gòu)型與一個天線式N-乙酰葡糖胺連接的單個巖藻糖。在另一實施方案中，凝血因子VIIa包含以下寡糖鏈(i)具有與核心N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖，和(ii)具有以α 1->3構(gòu)型與雙天線寡糖的每一天線式N-乙酰葡糖胺連接的巖藻糖殘基。在實施本發(fā)明時，N-連接的寡糖的模式可以用本領(lǐng)域任何已知方法確定，如高效液相層析(HPLC);毛細(xì)電泳(CE);核磁共振(NMR);利用諸如高速粒子(fast-atom)轟擊或電噴射等離子化技術(shù)，或基質(zhì)輔助激光解析(MALDI)進(jìn)行的質(zhì)譜分析(MS);氣相色譜(GC);以及用外切糖苷酶進(jìn)行處理并結(jié)合陰離子交換(AIE)-HPLC，大小排阻層析(SEC),或 MS0 參見，例如 Weber 等，Anal. Bio-chem. 225:135 (1995) ; Klausen 等，J. Chromatog. 718 :195 (1995) ; Morris 等， in Mass Spectrometry of BiologicalMaterials, McEwen 等編,Marcel Dekkerj (1990)，pp 137167; Conboy 等，Biol. Mass Spectrom.21:397，1992;HellerqvistjMeth. EnzymoL 193:554 (1990);Sutton 等，Anal.Biohcem. 318:34(1994) ;Harvey 等，Organic Mass Spectrometry 29:752(1994)。在用上述任一種方法(或能分辨具有不同結(jié)構(gòu)的寡糖鏈的其它任何方法)分辨出凝血因子VII-衍生的寡糖鏈之后，可將分辨出的種類分配到上述(i)-(v)中。將上述
(i)-(v)中每一種的相對含量計算為，被分配到該組的寡糖總量相對于樣品中寡糖鏈總含
量的比率。
例如，利用AIE-HPLC進(jìn)行分辨時，可從BHK產(chǎn)生的重組凝血因子VII制劑中分辨出13個或更多個N-連接型寡糖峰，例如，參見Klausen等，Mol. Biotechnol. 9:195, 1998。其中5個峰(在Klausen等人的文章中命名為1_5)不包含唾液酸，有8個峰(6，7，和10-15)包含唾液酸?？梢岳斫猓诰唧w的分析中，包含唾液酸的鏈和缺乏唾液酸的鏈的數(shù)量和分布取決于(a)所要表達(dá)的多肽；(b)細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件；以及(C)所采用的分析方法，而且所得到的模式也會因此有所不同。任何情況下，一旦將含有唾液酸的寡糖與不含唾液酸的寡糖分辨清楚，就可以用常規(guī)數(shù)據(jù)分析程序來計算每一峰以下的面積；總的峰面積；以及具體的峰占總峰面積的百分比。如此一來，對于給定的制劑而言，含唾液酸的峰的總面積/總的峰面積X 100就是本發(fā)明制劑的％唾液酸化值(即，具有至少一個唾液酸殘基的寡糖鏈的比例)。用類似的方法可以計算不具有唾液酸或至少有一個半乳糖或N-乙酰葡糖胺的鏈的百分比。制備具有預(yù)定的N連接型寡糖模式的凝血因子VII制劑的方法具有預(yù)定的N-連接型寡糖模式的凝血因子VII、凝血因子VII變體、或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑，可以用表達(dá)凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的任何合適的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。宿主細(xì)胞在一些實施方案中，宿主細(xì)胞是表達(dá)內(nèi)源性凝血因子VII基因的人類細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，所述內(nèi)源基因可以是完整的或者可以被原位修飾，或者凝血因子VII基因以外的一種序列可以被原位修飾，使該內(nèi)源性凝血因子VII基因的表達(dá)被改變?？梢允褂萌魏文鼙磉_(dá)內(nèi)源性凝血因子VII基因的人類細(xì)胞。在其它實施方案中，異源宿主細(xì)胞經(jīng)過改造后能由重組基因表達(dá)人凝血因子VII。所述宿主細(xì)胞可以是脊椎動物、昆蟲或真菌的細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞是能表達(dá)哺乳動物的N-連接型糖基化；O-連接型糖基化；和Y-羧基化的所有形式的哺乳動物細(xì)胞。參見，例如美國專利4，784，950。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞系包括CH0(ATCC CCL 61)，C0S-1 (ATCCCRL 1650)，幼年倉鼠腎細(xì)胞(BHK)和 HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham 等，J. Gen.Virol. 36:59-72, 1977)細(xì)胞系。優(yōu)選的 BHK 細(xì)胞系是 tk—tsl3BHK 細(xì)胞系(Waechter和 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110，1982)，后文稱 BHK 570 細(xì)胞。BHK570細(xì)胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301Parklawn Dr.，Rockville, MD 20852獲得，其ATCC保藏號為CRL 10314。tk_tsl3BHK細(xì)胞系也可以選用ATCC CRL 1632。還可使用其它多種細(xì)胞系，包括大鼠H印1(大鼠肝細(xì)胞癌；ATCC CRL 1600)，大鼠H印11(大鼠肝細(xì)胞癌；ATCC CRL1548), TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065), NCTC1469 (ATCCCCL 9. I)和 DUKX 細(xì)胞(CH0 細(xì)胞系)(Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad.Sci.USA 77:4216-4220,1980)。(DUKX 細(xì)胞也稱為 CXBll 細(xì)胞)，和 DG44(CH0 細(xì)胞系)(Cell, 33:405，1983，和 SomaticCelland MolecularGenetics 12:555，1986)。也可以使用3T3細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞，骨髓瘤以及骨髓瘤與其它細(xì)胞的融合體。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞是已經(jīng)適應(yīng)了在沒有血清的條件下生長、并已經(jīng)經(jīng)過改造能表達(dá)凝血因子VII的BHK 21細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞可以是表達(dá)糖基化酶(糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶)的突變細(xì)胞或重組細(xì)胞，但其表達(dá)的量或質(zhì)量不同于天然表達(dá)這些酶的細(xì)胞類型。所述細(xì)胞也可以被改造為表達(dá)其它異源肽或蛋白，包括，如截短型凝血因子VII。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是下 述CHO細(xì)胞，其經(jīng)過改造可以共表達(dá)所需凝血因子VII多肽(即，凝血因子VII或凝血因子-VII相關(guān)多肽)和另一種異源肽或多肽，如修飾酶或凝血因子VII片段。方法本發(fā)明涉及制劑制備方法，所述制劑包含上述(i)-(Vi)的任一種糖基型模式，在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明涉及使凝血因子VII和凝血因子VII相關(guān)多肽的糖基型分布最優(yōu)化的方法。這些方法包括以下步驟(a)在第一組預(yù)定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能表達(dá)凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的細(xì)胞；(b)從上述培養(yǎng)中回收凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽，以獲得包含這些多肽的制劑；和(C)分析與這些多肽連接的寡糖的結(jié)構(gòu)，從而確定糖基型模式。所述方法還包括(dl)改變步驟(a)的培養(yǎng)條件，得到第二組預(yù)定的培養(yǎng)條件；(el)重復(fù)步驟(b)-(dl)，直至獲得所需的糖基型模式。或者,所述方法還包括(d2)對所述制劑進(jìn)行化學(xué)處理和/或酶處理，以改變寡糖的結(jié)構(gòu)；和(e2)重復(fù)步驟(b)_(d2)，直至獲得所需糖基型模式。這些方法可能還包括，使具有預(yù)定糖基型模式的制劑接受至少一種有關(guān)生物活性(包括，如凝血活性，使凝血因子X裂解的活性，或TF結(jié)合的活性)或其它功能(如動力學(xué)譜或穩(wěn)定性)的檢驗，并將具體的糖基型模式與具體的生物活性或功能特性相關(guān)聯(lián)，從而鑒定出所需糖基型模式。步驟(dl)中可能被改變的培養(yǎng)條件包括，但不限于細(xì)胞來源，如來自不同于起始物種的另一物種；或突變細(xì)胞或重組細(xì)胞，它們在糖基化機(jī)制中的一或多種糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶或其它成分中具有改變(參見，Grabenhorst等，GlycoconjugateJ. 16:81, 1999 ; Bragonzi 等，Biochem. Biophys. Acta 1474: 273, 2000 ; Weikert, NatureBiotechnol. 17:1116, 1999);多肽的表達(dá)水平；代謝條件，如葡萄糖或谷氨酰胺濃度；有或無血清；維生素K的濃度；蛋白水解物，激素，痕量金屬，鹽以及諸如溫度、溶氧量和pH等參數(shù)。步驟(d2)中可能用于改變制劑的寡糖模式的酶處理包括，但不限于，依次用一或多種唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)，半乳糖苷酶，巖藻糖苷酶；半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，和/或唾液酸轉(zhuǎn)移酶，在能使具有特定末端結(jié)構(gòu)的寡糖鏈的分布發(fā)生所需改變的條件下，進(jìn)行處理。糖基轉(zhuǎn)移酶可以購自Calbiochem (La Jolla，CA)，糖苷酶可以購自Glyko, Inc. , (Novato, CA)。在一系列實施方案中，表達(dá)凝血因子VII或相關(guān)多肽的宿主細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，所述條件能使所述細(xì)胞分泌具有所需寡糖結(jié)構(gòu)的所需模式的糖基化凝血因子VII多肽，如上述(i)-(vi)任一項所述。這樣的培養(yǎng)條件包括，但不限于，血清減量或完全缺乏。優(yōu)選宿主細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)后能在無血清的條件下生長，并且是在生長期和生產(chǎn)期都缺乏血清的條件下培養(yǎng)。對這類適應(yīng)過程的描述參見Scharfenberg等，Animal Cell TechnologyDevelopments towards the 21St Century,E.C. Beuvery 等(編)，Kluwer AcademicPublishers, pp. 619-623, 1995 (BHK和CHO細(xì)胞)；Cruz, BiotechnoLTech. 11:117-120，1997(昆蟲細(xì)胞)；Keen, Cytotechnol. 17:203-211，1995(骨髓瘤細(xì)胞)；Berg等，Biotechniques 14:972-978，1993 (人類腎293細(xì)胞)。在一優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基不含蛋白或分離自動物組織或動物細(xì)胞培養(yǎng)的任何成分。參見，例如以下實施例I。一般情況下，除了常規(guī)成分以外，適于制備凝血 因子VII的培養(yǎng)基包含O. l-50mg/L維生素K，這是凝血因子VII中的谷氨酰胺殘基發(fā)生Y-羧基化所必需的。在另一系列的實施方案中，本發(fā)明的糖基型是通過對凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑中的N-連接型寡糖進(jìn)行酶修飾和/或化學(xué)修飾而制備的。凝血因子VII制劑本文中，“凝血因子VII制劑”是指多種凝血因子VII多肽，凝血因子VIIa多肽，或凝血因子VII相關(guān)多肽，包括變體和化學(xué)修飾形式，它們已經(jīng)從合成它們的細(xì)胞中被分離出來。將多肽從它們的細(xì)胞來源中分離可以用本領(lǐng)域已知的任何方法實現(xiàn)，包括，但不限于，從貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物上取出包含所需產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基；離心或過濾以便除去未貼壁的細(xì)胞；等等。任選地，凝血因子VII多肽可以被進(jìn)一步純化。純化可以用本領(lǐng)域任何已知方法實現(xiàn)，包括，但不限于，在諸如抗-凝血因子VII抗體柱上進(jìn)行親和層析(參見，例如Wakabayashi 等，J. Biol. Chem. 261:11097, 1986;和 Thim 等，Biochem. 27:7785, 1988)；疏水相互作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳(如制備型等電聚焦(IEF))，差異溶解(如硫酸銨沉淀)，或提取等等。一般性描述參見，Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NewYork, 1982 ；和 Protein Purification, J. -C. Janson 和 LarsRyden, editors, VCHPubIishers, New York, 1989。純化后，制劑中可能含有總重量的約10%以下、更優(yōu)選約5%以下、最優(yōu)選約I %以下的、來源于宿主細(xì)胞的非-凝血因子VII蛋白。凝血因子VII和凝血因子VII相關(guān)多肽可通過蛋白裂解性切割來活化，其使用凝血因子XIIa或其它具有胰蛋白酶-樣特異性的蛋白酶，如凝血因子IXa，激肽釋放酶，凝血因子Xa,和凝血酶。參見，例如Osterud等，Biochem. 11:2853(1972) ; Thomas,美國專利4，456，591 ;和 Hedner 等，J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)?；蛘?，凝血因子 VII 可以因通過離子交換層析柱，如MonoQ (Pharmacia)等而被活化。所得活化的凝血因子VII然后可以如下配制并給藥。凝血因子VII制劑的功能特性本發(fā)明具有預(yù)定的寡糖模式的凝血因子VII多肽和凝血因子VII相關(guān)多肽的制齊U，具有相對于參照制劑改進(jìn)的功能特性。所述改進(jìn)的功能特性可包括，但不限于a)物理特性，如保存穩(wěn)定性；b)藥代動力學(xué)特性，如生物可利用度和半壽期；和(3)在人體中的致免疫性。參照制劑是指與將要用于比較的本發(fā)明制劑包含相同的多肽、但具有不同的天冬酰胺-連接型糖基化模式的制劑(如野生型凝血因子VII或具體變體或化學(xué)修飾形式)。例如，參照制劑通常包含一或多種以下糖基型模式(i)約93%以下(如約92%以下或約90%以下)的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基；(ii)至少約6% (如至少約7. 5%或至少約10%)的寡糖鏈不含任何唾液酸(即，為中性)至少約10% (如至少約12. 5%或至少約15% )的寡糖鏈包含至少一個末端半乳糖殘基；(iv)至少約15% (如至少約20%至少約25% )的寡糖鏈包含至少一個N-乙酰半乳糖胺殘基；(V)至少約25% (如至少約30%或至少約35%)的寡糖鏈包含至少一個未加帽的天線(即，包含至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基)；或(vi)基本上不可 能檢測到的(如約O. 2%以下)的天線式巖藻糖殘基。凝血因子VII制劑的保存穩(wěn)定性可以通過測定如下特性來評估(a)制劑在25°C以干粉形式保存時，損失20%的生物活性所需的時間；和/或(b)使制劑中凝血因子VIIa聚集物的比例加倍所需的時間。在一些實施方案中，在25°C以干粉形式保存時，本發(fā)明的制劑損失20%的生物活性所需的時間，比參照制劑發(fā)生同樣現(xiàn)象所需的時間增加至少約30%，優(yōu)選至少約60%，更優(yōu)選至少約100%。生物活性可以用以下任一種試驗來測定凝血試驗、蛋白裂解試驗、TF-結(jié)合試驗，或TF-非依賴性凝血酶生成的試驗。在一些實施方案中，在25°C以干粉形式保存時，本發(fā)明的制劑使聚集物加倍所需的時間比參照制劑增加至少約30%，優(yōu)選至少約60%，更優(yōu)選至少約100%。聚集物的含量可通過在 Protein Pak 300SW 柱(7. 5x 300mm) (Waters, 80013)上進(jìn)行凝膠滲透 HPLC 而確定，方法如下將層析柱用洗脫液A(0. 2M硫酸銨,5%異丙醇,用磷酸將pH調(diào)至2. 5,然后用三乙胺將pH調(diào)至7. O)平衡，然后加載25 μ g樣品。用洗脫液A以O(shè). 5ml/min的流速洗脫30min，檢測215nm的吸光值。聚集物的含量用凝血因子VII聚集物的峰面積/所有凝血因子VII (單體和聚集物)的峰的總面積來計算?！吧锟衫枚取笔侵冈谀蜃覸II或凝血因子VII相關(guān)制劑給藥后的預(yù)定時間點可檢測到的給藥劑量的比例。通常，生物可利用度如下檢測對動物給藥約25-250 μ g/kg該制劑；在給藥后的預(yù)定時間點獲得血漿樣品；和用凝血試驗(或任何生物試驗)、免疫分析或等效的試驗中的一或多種試驗測定樣品中凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的含量。數(shù)據(jù)通常用[凝血因子VII]對時間的圖來表示，生物可利用度則表示為曲線下的面積(AUC)。待測制劑的相對生物可利用度是指，待測制劑與參照制劑的AUC之比。在一些實施方案中，本發(fā)明的制劑具有參照制劑的生物可利用度的至少約110%，優(yōu)選至少約120%，更優(yōu)選至少約130%，最優(yōu)選至少約140%。生物可利用度可以在任何哺乳動物物種中測定，優(yōu)選狗，用于計算AUC的預(yù)定時間點從IOmin漸增至8h?！鞍雺燮凇笔侵改蜃覸II多肽或凝血因子VII相關(guān)多肽的血漿濃度從一個具體值減少至它的一半所需的時間。半壽期可以用測定生物可利用度的方法來測定。在一些實施方案中，本發(fā)明制劑比參照制劑的半壽期增加至少約O. 25h，優(yōu)選至少約O. 5h，更優(yōu)選至少約Ih,最優(yōu)選至少約2h。制劑的“致免疫性”是指該制劑給藥至人體后，激發(fā)有害的體液和/或細(xì)胞免疫的能力。目前不清楚凝血因子VIIa多肽和凝血因子VIIa相關(guān)多肽能否在人體內(nèi)激發(fā)可檢測的免疫應(yīng)答。但是在任何亞人群中，可能存在對具體給藥蛋白敏感的個體。致免疫性可以如下檢測用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法定量敏感個體中抗-凝血因子VII抗體和/或凝血因子VII-應(yīng)答型T-細(xì)胞的存在。在一些實施方案中，本發(fā)明制劑對敏感個體的致免疫性為參照制劑對敏感個體的致免疫性的至少約10%，優(yōu)選至少約25%，更優(yōu)選至少約40%，最優(yōu)選至少約50%。藥用組合物和應(yīng)用方法本發(fā)明制劑可用于治療任何凝血因子VII- 應(yīng)答性綜合征，如出血疾病，包括但不限于，因凝血因子缺乏所致的疾病(如血友病A和B或凝血因子XI或VII缺陷)；血小板減少癥或von Will ebrand病,或因凝血因子抑制劑所致疾病，或因任何原因所致過量出血。所述制劑還可以配合手術(shù)或其它創(chuàng)傷來給藥，或給藥至接受抗凝治療的患者。包含本發(fā)明凝血因子VII相關(guān)多肽的制劑相對于野生型凝血因子VII的生物活性實質(zhì)上減弱，它們可用作抗凝劑，用于例如正在接受血管形成術(shù)或其它有可能增加血栓或血管阻塞危險的手術(shù)的患者(如在再狹窄中發(fā)生的那樣)。其它可以開出抗凝劑處方的臨床指征包括，但不限于，深部靜脈血栓，肺栓塞，休克，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的肺或腎內(nèi)纖維蛋白沉積，或心肌梗塞；急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答綜合征(SIRS)，溶血性尿毒綜合征(HUS)，MOF，和TTP。包含本發(fā)明凝血因子VII和凝血因子VII相關(guān)制劑的藥用組合物，主要用于非胃腸道給藥，從而進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性處理。優(yōu)選所述藥用組合物通過非胃腸道途徑給藥，即，靜脈給藥，皮下給藥或肌肉內(nèi)給藥。它們可以通過連續(xù)或脈動型(pulsatile)輸注方式給藥。藥用組合物或配制劑包含本發(fā)明的制劑，其組合了，優(yōu)選溶于，可藥用載體，優(yōu)選含水載體或稀釋劑。有多種含水載體可以使用，如水，緩沖水，O. 4%的鹽水，O. 3%的甘油等等。本發(fā)明的制劑也可以配制成用于運送或靶向損傷部位的脂質(zhì)體制劑。脂質(zhì)體制劑的一般性描述可參見美國專利4，837，028,4, 501, 728，和4，975，282。所述組合物可以通過常規(guī)的已知滅菌技術(shù)滅菌。所得含水溶液可以包裝備用或在無菌條件下過濾并凍干，凍干制劑可以在給藥前與無菌水溶液混合。所述組合物可以包含可藥用的輔助物質(zhì)或添加劑，包括但不限于，pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)劑，如乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣等。這些配制劑中凝血因子VII或凝血因子VII相關(guān)多肽的濃度可以有很大差異(gp，從O. 5%重量以下，通常為或至少約1%重量至15或20%重量)，主要依據(jù)與所選的具體給藥方式相應(yīng)的流體體積、粘度等來選擇。因此，用于靜脈輸注的典型藥用組合物可包含250ml無菌Ringer溶液和IOmg所述制劑。可以進(jìn)行非胃腸道給藥的組合物的真實制備方法為本領(lǐng)域已知或很明顯，更詳細(xì)的描述可參見 Remington’ s Pharmaceutical Sciences, 18th ed. , Mack PublishingCompany, Easton, PA(1990)。包含本發(fā)明制劑的組合物可以為了預(yù)防性和/或治療性處理的目的而給藥。在治療性處理中，組合物是給予如上所述的已經(jīng)患病的受試者，給藥量足以治愈、緩解或部分控制所述疾病及其并發(fā)癥。足以完成這些目的的量就是“治療有效量”。每種目的的有效量取決于疾病或損傷的嚴(yán)重性以及受試者的體重和總體狀態(tài)。但一般情況下，有效量通常為約O. 05mg 一約500mg制劑/日/70kg受試者，更常用的是約I. Omg 一約200mg制劑/日?？梢岳斫獾氖?，能用常規(guī)試驗確定合適的劑量，方法是構(gòu)建關(guān)于值的矩陣，并測試該矩陣中的不同點。本發(fā)明制劑的局部運送，例如，局部應(yīng)用，可以，例如通過噴射、灌注、雙氣囊導(dǎo)管(double balloon catheters)、支架、摻入脈管移植物或支架、用于包被氣囊導(dǎo)管的水凝膠、或其它成熟的方法來進(jìn)行。在任一種情況中，所述藥用組合物應(yīng)該提供足以有效治療受試者的制劑量。本發(fā)明的藥用組合物還可以包含其它生物活 性制劑，如非-凝血因子VII-相關(guān)的凝血劑或抗凝劑。以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明，并非限制。實施例I :制備并分析具有改變的糖基型模式的凝血■因子VII制劑用以下實驗制備具有改變的糖基型模式的凝血因子VII制劑。I.制備用編碼凝血因子VII的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BHK細(xì)胞系經(jīng)過適應(yīng)，能在沒有血清的情況下在懸浮培養(yǎng)中生長。將所述細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(spinnerculture)中連續(xù)傳代,隨著細(xì)胞數(shù)的增加，體積因加入新培養(yǎng)基而逐漸增大。最后，將6L育種(seed)培養(yǎng)物接種至含有大孔Cytopore I載體(Pharmacia)的100-升制備型反應(yīng)器中，懸浮細(xì)胞因此被固定在所述載體上。將培養(yǎng)物維持在36°C、pH6. 7-6. 9和50%的DO中。隨著細(xì)胞數(shù)的增加，制備型反應(yīng)器中的體積因加入新培養(yǎng)基而逐漸增大。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約2X IO6細(xì)胞/ml時，開始進(jìn)入生產(chǎn)期，每24小時更換培養(yǎng)基終止攪拌，使含有細(xì)胞的載體沉降，然后收獲80%的培養(yǎng)上清，代之以新的培養(yǎng)基。所收獲的培養(yǎng)上清經(jīng)過濾除去未被捕獲的細(xì)胞和細(xì)胞殘渣，然后轉(zhuǎn)移以備進(jìn)一步加工。在生產(chǎn)期，細(xì)胞達(dá)到3-6X IO6細(xì)胞/ml，滴度為2_7mg凝血因子VII/升。II.對重組凝血因子VII的糖基型樽式的分析比較以下制劑的寡糖模式(a)第I部分中所述的重組凝血因子VII制劑(n=7)；以及兩種參照制劑；(b)在有牛血清的情況下于BHK細(xì)胞中產(chǎn)生的重組凝血因子VII制劑(n=10);和(c)從人血漿純化得到的凝血因子VII制劑。所述多肽經(jīng)過化學(xué)切割(肼解作用，使用GlycoPreplOOO設(shè)備，OxfordGlycoSciences)或酶切割(N-糖苷酶 F,如來自 Boehringer Mannheim)而釋放N-連接型寡糖。將所釋放的寡糖用2-氨基苯甲酰胺進(jìn)行標(biāo)記(使用單個標(biāo)記試劑盒，K-404, Oxford Glyco-Sciences或Glyko)。被標(biāo)記的寡糖在配有保護(hù)柱(4x50mm, Dionex, P/N 43054)的 CarboPac PAlOO 柱(4x250mm, Dionex, P/N43055)上通過陰離子交換HPLC進(jìn)行分析。該柱用150mM氫氧化鈉平衡，用0-150mM乙酸鈉的梯度、150mM氫氧化鈉來洗脫。寡糖用熒光來檢測，激發(fā)波長為330nm，發(fā)射波長為420nm。各種凝血因子VII的寡糖結(jié)構(gòu)(Klausen等，1998)的相對含量用陰離子交換HPLC分析中糖峰的相對峰面積來計算。根據(jù)每種寡糖的結(jié)構(gòu)元素，將其如下分配(i)包含至少一個唾液酸的鏈；( )缺乏任何唾液酸(S卩，中性)的鏈；(iii)含有至少一個半乳糖殘基的鏈；(iv)含有至少一個末端N-乙酰半乳糖胺殘基的鏈；和(V)含有至少一個未加帽的天線(即，至少一個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基)的鏈。最后，分配至每一組的寡糖鏈的相對含量的總和用總寡糖鏈的百分比來計算。測定值的標(biāo)準(zhǔn)差為O. 08% (一天內(nèi)的差異)；0.7% (不同天之間的差異)；和0.5% (1-100 μ g間隔)。所得糖基型模式見下表
權(quán)利要求
1.制備包含多種因子VII多肽或因子VII相關(guān)多肽的組合物的方法，所述方法包括使中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞適應(yīng)在血清缺失下生長并在生長期和生產(chǎn)期都缺失血清下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
2.依照權(quán)利要求I的方法，其中所述CHO細(xì)胞為CHOKl細(xì)胞(ATCCCCL61)。
3.依照權(quán)利要求I或2的方法，其中所述組合物包含選自人S52A-因子VII;人S60A-因子VII ;已經(jīng)在殘基290和291之間蛋白水解切割的因子VII ；已經(jīng)在殘基315和316之間蛋白水解切割的因子VII ;已經(jīng)氧化的因子VII ;R152E-因子VII，S344A-因子VII，F(xiàn)FR-因子VII和缺少Gla結(jié)構(gòu)域的因子VIla的多肽。
4.依照權(quán)利要求I至3任一項的方法，其中使所述細(xì)胞適應(yīng)在動物衍生組分缺失下生長并在生長期和生產(chǎn)期都缺失動物衍生組分下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
5.包含多種因子VII多肽或因子VII相關(guān)多肽的組合物，其中所述組合物可通過依照權(quán)利要求I至4任一項的方法獲得。
6.依照權(quán)利要求5的組合物，其包含多種因子VII多肽或因子VII相關(guān)多肽，在血清缺失下在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中生成，其中使所述細(xì)胞適應(yīng)在血清缺失下生長并在生長期和生產(chǎn)期都缺失血清下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
7.依照權(quán)利要求5或6的組合物，其中所述組合物所具有的生物利用度是參照制劑的生物利用度的至少110%。
8.依照權(quán)利要求7的組合物，其中所述組合物所具有的生物利用度是參照制劑的生物利用度的(a)至少120%, (b)至少130%，或(c)至少140%。
9.依照權(quán)利要求5或6的組合物，其中所述組合物所展現(xiàn)的生物利用度是參照制劑的生物利用度的至少約110%，其中參照制劑中約93%或更少的寡糖鏈包含至少一個唾液酸部分。
10.藥用配制劑，其包含依照權(quán)利要求5至9任一項的組合物和可藥用載體或稀釋劑。
11.依照權(quán)利要求5至9任一項的組合物或依照權(quán)利要求10的藥用配制劑，其用于治療出血病癥。
12.依照權(quán)利要求11的組合物或藥用配制劑，其用于治療出血病癥，其中所述出血病癥選自下組血友病A，血友病B，因子XI缺陷，因子VII缺陷，血小板減少癥，vonWillebrand病，外科手術(shù)，和創(chuàng)傷。
13.依照權(quán)利要求5至9任一項的組合物或依照權(quán)利要求10的藥用配制劑，其用于預(yù)防不希望發(fā)生的出血。
14.中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞在制備包含多種因子VII多肽或因子VII相關(guān)多肽的組合物中的用途，其中使所述CHO細(xì)胞適應(yīng)在血清缺失下生長并在生長期和生產(chǎn)期都缺失血清下培養(yǎng)所述CHO細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及凝血因子VII的糖基型。本發(fā)明涉及包含凝血因子VII和其它凝血因子的制劑，所述因子具有改變的天冬酰胺-連接型糖基化模式。
文檔編號C12N9/64GK102766668SQ201210226379
公開日2012年11月7日 申請日期2001年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月2日
發(fā)明者尼爾斯.K.克勞森, 漢斯.K.平格爾 申請人:諾沃挪第克健康護(hù)理股份公司