專利名稱：一種雞源性抗雞新城疫病毒p蛋白的單鏈抗體zl1、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗雞新城疫病毒的基因工程單鏈抗體ZLl、表達(dá)該單鏈抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞、該單鏈抗體的制備方法以及其用途，所述單鏈抗體能與雞新城疫病毒P蛋白特異性結(jié)合活性。
背景技術(shù)：
雞新城疫是新城疫病毒引起的禽類急性、高度接觸性和致死性的傳染病，對(duì)我國(guó) 乃至世界養(yǎng)禽業(yè)的危害及其嚴(yán)重，被國(guó)際獸醫(yī)局確定為A類傳染病，也是我國(guó)禽肉出口檢疫的重要疾病之一。對(duì)于病毒性傳染病，目前尚沒有特異性治療藥物。單鏈抗體等基因工程抗體，以其獨(dú)特的抗病毒作用及可以大規(guī)模工程化制備的優(yōu)勢(shì)，顯示了巨大的研發(fā)抗病毒藥物的潛力，受到該領(lǐng)域高度重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的基因工程單鏈抗體ZL1，該單鏈抗體能夠與雞新城疫病毒P蛋白特異性結(jié)合，可用于雞新城疫的預(yù)防和/或治療。一種雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl，其至少具有如SEQ ID No. I所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)、如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和位于輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間的中間連接肽，所述中間連接肽為(Gly4Ser)3。上述單鏈抗體具有如SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼所述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl的基因，其具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。為了方便地對(duì)單鏈抗體進(jìn)行檢測(cè)純化和進(jìn)一步的操作，可以在上述序列的基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)和識(shí)別序列，優(yōu)選進(jìn)一步含有內(nèi)切酶位點(diǎn)Notl、NcoI和識(shí)別序列。其中包括 NcoI =CCATGG NotI :GCGGCCGC。本發(fā)明的再一目的是提供一種含有編碼上述單鏈抗體的基因的表達(dá)載體。上述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，優(yōu)選為P0PE101-XP載體。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體(ZLl)的方法，包括以下步驟(I)采用RT-PCR直接從ND GA/VA疫苗免疫的雞脾臟RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；(2)利用SOE-PCR法將linker與VH基因和VL基因相連構(gòu)建雞源性單鏈抗體編碼
基因;(3)將步驟(2)的雞源性單鏈抗體編碼基因克隆到原核表達(dá)載體pOPElOl-XP中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；
(4)將步驟(3)的原核表達(dá)載體pOPElOl-XP轉(zhuǎn)化入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，培養(yǎng)、表達(dá)單鏈抗體；(5)將步驟(4)表達(dá)的單鏈抗體用以原核表達(dá)的新城疫病毒P蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA進(jìn)行篩選，陽(yáng)性克隆即為抗新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體；(6)分離純化步驟(5)所得陽(yáng)性克隆培養(yǎng)產(chǎn)物，即獲得所述雞源性抗雞新城疫病毒的單鏈抗體。(按照上海意泓生物科技有限公司純化柱說(shuō)明書操作進(jìn)行)需要說(shuō)明的是，以上各步驟采用的實(shí)驗(yàn)材料均為正規(guī)公司獲得的標(biāo)準(zhǔn)材料，所用方法均為標(biāo)準(zhǔn)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書所述方法(見相應(yīng)的實(shí)施例)，各步驟獲得的中間產(chǎn)品及最后的終產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)證明可以重復(fù)獲得，其生物學(xué)性質(zhì)保持穩(wěn)定一致。說(shuō)明本發(fā)明各試驗(yàn)步驟所涉及的中間產(chǎn)品和終產(chǎn)品均可以按照本發(fā)明所陳述的發(fā)法準(zhǔn)確獲得.本發(fā)明的再一目的是提供上述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體在用于 制備雞新城疫的預(yù)防、治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)原理是采用RT-PCR直接從ND (新城疫)GA/VA疫苗株免疫的雞脾臟RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因。利用SOE-PCR(重組鏈延伸反應(yīng))法將linker與VH基因和VL基因相連構(gòu)建雞源性單鏈抗體(ScFv)基因，并將其克隆到原核表達(dá)載體P0PE101-XP中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)，間接ELISA篩選原核表達(dá)的抗NDV單鏈抗體的陽(yáng)性克隆，測(cè)序后進(jìn)行Clustalw多序列比較，證明該單鏈抗體屬于雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體。本發(fā)明的有益效果是抗雞新城疫病毒的基因工程抗體能與雞新城疫病毒P蛋白特異性結(jié)合，能夠用于雞新城疫的預(yù)防和治療。


圖I是實(shí)施例I的p0PE101-XP重組載體的結(jié)構(gòu)圖。圖2是單鏈抗體ZLl的編碼基因及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I雞源性抗雞新城疫病毒的單鏈抗體的制備I :將雞新城疫疫苗(Bio ND VG/GA購(gòu)自梅里亞集團(tuán))按使用說(shuō)明免疫雞(羅曼母雞，4月齡、體重I. 5kg，購(gòu)自上海思甜家禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社)，用常規(guī)(參照F.M.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)大于1:20000時(shí)，收獲雞脾臟，經(jīng)勻漿研磨后，用Trizol法(TRIZ0L Reagent購(gòu)自TaKaRa公司)提取總RNA。以提取的總RA為模版，采用Oligo primer,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(cDNA第I鏈合成試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司)的產(chǎn)品說(shuō)明操作步驟，合成第I鏈cDNA。2 :根據(jù)GenBank已公布的雞抗體編碼基因可變區(qū)序列(AJ298107. I)的FR區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增抗體輕、重鏈的引物(表1)，其中VHlF和VHlR用于擴(kuò)增VH區(qū)；VL1F和VLlR用于擴(kuò)增VL區(qū)；VH2R、VH2F用于VH基因加入酶切位點(diǎn)和Linker序列；VL2R、VL2F用于VL基因加入酶切位點(diǎn)和Linker序列。其中，VH2F、VL2R分別含有Not I和Nco I酶切位點(diǎn)；VH2R、VL2F含互補(bǔ)的Linker序列(酶切位點(diǎn)和Linker序列在表I中用下劃線標(biāo)示出)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
表I擴(kuò)增抗體可變區(qū)的引物及其擴(kuò)增片段大小
權(quán)利要求
1.一種雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl，是與原核表達(dá)的新城疫病毒P蛋白結(jié)合的單鏈抗體，其至少具有如SEQ ID No. I所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)、如SEQ IDNo. 2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和位于輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間的中間連接肽。
2.如權(quán)利要求I所述的單鏈抗體ZLl，其特征在于其具有如SEQID No. 3所示的氨基酸序列。
3.—種編碼如權(quán)利要求I所述的單鏈抗體的基因，其特征在于其具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列中進(jìn)一步包含內(nèi)切酶位點(diǎn)NotI、NcoI，其中 NcoI 為 CCATGG，NotI 為 GCGGCCGC。
5.含有權(quán)利要求3-4任一項(xiàng)所述的基因的表達(dá)載體。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述載體為原核表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述載體為pOPElOl-XP載體。
8.一種制備如權(quán)利要求I所述的雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體的方法，包括以下步驟 (1)采用RT-PCR直接從NDGA/VA疫苗免疫的雞脾臟RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因； (2)利用SOE-PCR法將linker與VH基因和VL基因相連構(gòu)建雞源性單鏈抗體編碼基因； (3)將步驟(2)的雞源性單鏈抗體編碼基因克隆到原核表達(dá)載體pOPElOl-XP中，構(gòu)建重組質(zhì)粒； (4)將步驟(3)的原核表達(dá)載體pOPElOl-XP轉(zhuǎn)化入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)、表達(dá)單鏈抗體； (5)將步驟(4)表達(dá)的單鏈抗體用以原核表達(dá)的新城疫病毒P蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA進(jìn)行篩選，陽(yáng)性克隆即為抗新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl ； (6)分離純化步驟(5)所得陽(yáng)性克隆培養(yǎng)產(chǎn)物即獲得所述雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl。
9.如權(quán)利要求I或2所述的雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的單鏈抗體ZLl在用于制備雞新城疫的預(yù)防和/或治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用分子生物學(xué)手段制備雞源性抗雞新城疫病毒P蛋白的基因工程單鏈抗體ZL1，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和位于輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間的中間連接肽。ELISA實(shí)驗(yàn)證明，獲得的抗雞新城疫病毒的基因工程單鏈抗體能與原核表達(dá)的雞新城疫病毒P蛋白特異性結(jié)合，顯示了該單鏈抗體具有一定的結(jié)合新城疫病毒P蛋白的活性，可以用于雞新城疫的預(yù)防和/或治療。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102746398SQ201210228688
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者張艷玲, 朱建國(guó), 李本強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)