擬南芥erip2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬南芥ERIP2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物蓮座或子葉大小相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，該蛋白可以調(diào)控植物子葉和蓮座等表型，對(duì)培育葉片和蓮座增加的植物品種，特別是培育食用十字花科等蔬菜類植物品種有重要意義。
【專利說(shuō)明】擬南芥ERIP2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種擬南芥ERIP2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在非生物和生物逆境的脅迫下，高等植物細(xì)胞有多種途徑感受和應(yīng)答外界環(huán)境中物化參數(shù)的變化，將胞外的信號(hào)變?yōu)榘麅?nèi)信號(hào)，經(jīng)過(guò)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)的功能基因，啟動(dòng)逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，提高植物的耐逆性。已經(jīng)證實(shí)，植物中特異的激素乙烯作為一種重要的植物激素，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的諸多方面。目前發(fā)現(xiàn)擬南芥II類乙烯受體ETR2和EIN4的獲得功能突變體etr2_l和ein4-l均有大蓮座的表型，而他們的突變體及雙突變體etr2-2和etr2-3ein4-4均有小蓮座的表型。因此應(yīng)用酵母雙雜技術(shù)從擬南芥中獲得了乙烯受體ETR2和EIN4的互作蛋白，ERIP1，ERIP2 和 ERIP3 (Ethylene Receptor-1nteracting Protein)，ERIPl 與 ERIP2 和ERIP3的相似性分別為73.5%和47.5%。本申請(qǐng)是有關(guān)ERIP2及其編碼基因的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種擬南芥ERIP2蛋白及其編碼基因。
[0004]本發(fā)明提供的蛋白，來(lái)源于擬南芥(Arabidopsis thaliana),名稱為ERIP2,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):
[0005]Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0006](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物蓮座或子葉大小相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0007]上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列I所示的DNA序列缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表2所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0008]上述蛋白的氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發(fā)生的變異引起的，有的是由人工誘變處理引起的。
[0009]序列表中序列2氨基酸殘基序列是由131個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
[0010]編碼所述蛋白(ERIP2)的基因(ERIP2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011]所述基因(ERIP2)可為如下I) -4)中任一一種的DNA分子:
[0012]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0013]2)序列表中序列I自5’端第I到第393位堿基所示的DNA分子；
[0014]3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物蓮座或子葉大小相關(guān)蛋白的DNA分子；
[0015]4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物蓮座或子葉大小相關(guān)蛋白的DNA分子。[0016]序列表中序列i的DNA序列由396個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框分別為自5’末端第I到第396位堿基。
[0017]所述特異性雜交條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2 X SSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7%SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在 7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5X SSC, 0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，
0.1 X SSC, 0.1%SDS 中漂洗；還可為:50。〇，在7%505、0.5M NaPOjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。
[0018]利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼乙烯受體互作蛋白的基因ERIP2導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得葉片/蓮座增大的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有本發(fā)明NEIPl基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如:煙草、白菜、菠菜、楊樹、苜宿等。
[0019]含有上述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0020]上述重組載體具體為將上述基因插入pROKII載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。
[0021]上述重組載體具體為將上述序列表中序列I自5’端第I到第393位堿基所示的DNA分子插入pROKII載體BglII和SalI酶切位點(diǎn)，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。
[0022]擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，其中所述引物對(duì)中的一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列3，所述引物對(duì)中的另一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列4。
[0023]上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物蓮座和/或子葉大小中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]上述應(yīng)用中，所述調(diào)節(jié)植物蓮座和/子葉大小為提高植物蓮座或子葉大小；所述蓮座大小具體通過(guò)蓮座直徑體現(xiàn)，所述子葉大小具體通過(guò)子葉長(zhǎng)度體現(xiàn)；
[0025]所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為十字花科植物，所述十字花科植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
[0026]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0027]本發(fā)明提供的方法，為將上述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物，
[0028]所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下I)或2)至少一種特征:[0029]I)所述轉(zhuǎn)基因植物的蓮座直徑大于所述目的植物；
[0030]2)所述轉(zhuǎn)基因植物的子葉長(zhǎng)度大于所述目的植物。
[0031 ] 上述方法中，上述蛋白的編碼基因通過(guò)上述重組載體導(dǎo)入目的植物中。
[0032]上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為十字花科植物，所述十字花科植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
[0033]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種蛋白來(lái)源于擬南芥(Arabidopsisthaliana)，名稱為ERIP2，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，可得到植物子葉長(zhǎng)度/蓮座均增大的轉(zhuǎn)基因植物，說(shuō)明該蛋白可以調(diào)控植物葉片和蓮座大小的表型，對(duì)培育子葉/蓮座增大的植物品種，特別是培育食用十字花科等蔬菜類植物品種有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為CytoTrap酵母雙雜原理不意圖
[0035]圖2為CytoTrap酵母雙雜系統(tǒng)驗(yàn)證ETR2/EIN4與ERIP2的相互作用
[0036]圖3為ERIP2的過(guò)量表達(dá)和RNAi載體構(gòu)建
[0037]圖4為ERIP2過(guò)表達(dá)和RNAi植株的分子鑒定和表型分析
[0038]圖5為ERIP2過(guò)表達(dá)植株與對(duì)照的蓮座比較
[0039]圖6為ERIP2過(guò)表達(dá)與野生型植株子葉長(zhǎng)度比較
【具體實(shí)施方式】
[0040]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0041]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042]載體pR0KII(雙兀表達(dá)載體)記載在 D.C.Baulcombe, G.R.Saunders, M.ff.Bevan, Μ.A.Mayo and B.D.Harrison, Expression of biologically active viral satellite RNAfrom the nuclear genome of transformed plants.Nature 321(1986)，pp.446 - 449 中，公眾可以從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0043]農(nóng)桿菌GV3101 菌株記載在 Clough-SJ, Bent-AF.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16:6, 735-743中，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0044]哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(col-0):種子購(gòu)自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下簡(jiǎn)稱野生型擬南芥。
[0045]所有植物材料均生長(zhǎng)于22-25° C每天的光照為16h/8h (光照/黑暗)。
[0046]實(shí)施例1、蛋白ERIP2的獲得
[0047]1、運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)獲得與乙烯受體ETR2互作的蛋白ERIP2
[0048]以去掉跨膜區(qū)的區(qū)段的ETRl為模板，運(yùn)用CytoTrap酵母雙元雜交系統(tǒng)，獲得與ETR2互作的蛋白ERIP2。
[0049]I) CytoTrap酵母雙元雜交系統(tǒng)
[0050]CytoTrap酵母雙元雜交系統(tǒng)是利用一個(gè)溫度敏感的釀酒酵母突變體cdc25H進(jìn)行相互作用蛋白的篩選。cdc25H造成的溫度敏感是由于一個(gè)與人類hSos同源基因cdc25 —個(gè)點(diǎn)突變?cè)斐傻?。cdc25編碼鳥苷酸交換因子，它可以結(jié)合并激活Ras信號(hào)通路，使酵母可以在37°C下生長(zhǎng)，而帶有cdc25點(diǎn)突變的宿主酵母則只能在22-25°C下生長(zhǎng)。由于人類的hSos可以互補(bǔ)cdc25H的功能，因此可以利用在膜上表達(dá)hSos使酵母在37°C正常生長(zhǎng)。將目標(biāo)蛋白的基因序列構(gòu)建到pMyr載體上，由于在該載體的5’端有編碼肉?蓮基化的序列可以將目標(biāo)蛋白錨定到細(xì)胞膜上，如果與hSos融合的誘餌蛋白能與定位于膜上的目標(biāo)蛋白相互作用，hSos就可以起作用，從而使酵母在37°C下生長(zhǎng)(圖1)。
[0051]2)擬南芥cDNA表達(dá)文庫(kù)對(duì)構(gòu)建
[0052]ETR2是擬南芥I類乙烯受體。先前的研究表明，乙烯信號(hào)通路參與植物脅迫反應(yīng)，且乙烯受體在花組織中表達(dá)較高，所以提取正常、鹽、干旱處理的生長(zhǎng)兩周的擬南芥Col-O幼苗RNA和花及莢組織的RNA,反轉(zhuǎn)錄并連入pMyr載體，構(gòu)建擬南芥cDNA混合文庫(kù)。經(jīng)過(guò)檢測(cè)得到的文庫(kù)滴度約為1.5X105cfu，插入片斷大小平均為1.2kb左右。
[0053]誘餌蛋白的構(gòu)建選擇了去掉跨膜區(qū)段的ETR2，與hSOS形成融合蛋白。
[0054]將擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子用70%的酒精滅菌5分鐘,再用1%次氯酸鈉(Antiformin)滅菌10分鐘,然后用無(wú)菌水洗3次,播種于1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)2周后分別用IOOmM NaCl及10%聚乙二醇(MW6000)處理6h，收集材料，剪成I 一 2cm2的碎片，放在1/2MS液體培養(yǎng)基中緩慢搖動(dòng)3小時(shí)；另外取煙草成體植株不同發(fā)育時(shí)期的花器官。以上材料收集后液氮速凍。
[0055]總RNA的提取用異硫氰酸胍一酹一氯仿的方法進(jìn)行。用PolyAT tract mRNAisolation system IV (Promega)對(duì)mRNA進(jìn)行分離純化,再用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。然后按照 Cyto Trap cDNA library construction (stratagene)試劑盒說(shuō)明書構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)。合成好的雙鏈cDNA是用EcoR I和Xho I雙切后連入pMyr載體中的。接著把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞(XL-Gold Kanr)中,涂板得到大量的菌斑。統(tǒng)計(jì)菌斑的數(shù)量就可以確定cDNA文庫(kù)的滴度。把這些菌斑刮到液體培養(yǎng)基中，獲得cDNA的原始文庫(kù)。原始文庫(kù)可在半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到擴(kuò)增。提取混合菌斑或菌液的質(zhì)粒就可進(jìn)行酵母雙雜交的篩選了。
[0056]3)酵母轉(zhuǎn)化與文庫(kù)篩選
[0057]首先要鑒定酵母菌株cdc25H。將酵母cdc25H在YPAD固體培養(yǎng)基上劃線，24°C培養(yǎng)4天后，挑取10個(gè)單斑置于YPAD液體培養(yǎng)基中，24°C過(guò)夜，分別取IOOul菌液平鋪于YPAD平板上，37°C，4天，不能長(zhǎng)出菌斑的菌液為正常的溫度敏感型酵母。菌液用終濃度為
15.5%的甘油保存于-80°C冰箱，以作為以后實(shí)驗(yàn)用的菌種。
[0058]把保存好的酵母cdc25H在YPAD平板上劃線，挑取4_5個(gè)單克隆混合加入50mlYPAD液體培養(yǎng)基中，24°C搖床培養(yǎng)大約16小時(shí)至OD6tltl值大于I。如果19小時(shí)的培養(yǎng)液0D_值仍小于1，則棄之再重新挑單斑培養(yǎng)，以防酵母突變。上述培養(yǎng)液移至300ml YPAD培養(yǎng)液中，24°C振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)，此時(shí)OD6tltl值大于0.7 (同時(shí)為了驗(yàn)證菌液是否突變，可以吸取75 μ I平鋪于YPAD平板上，37°C度培養(yǎng)6天，只要長(zhǎng)出菌斑數(shù)少于30，即可認(rèn)為這300ml酵母是可靠)。1000g離心5min棄上清,收集沉淀,用50ml無(wú)菌超純水重懸，1000g再離心 lOmin，棄上清后用 50ml LiSORB溶液(IOOmM LiAc, IOmM Tris-HCl (PH8.0), ImM EDTA,IM Sorbitol)重懸。室溫下放置30分鐘后，1000g離心5min收集沉淀，再用300 μ ILiSORB重懸，加入 600 μ 18mg/ml 的鮭魚精 DNA、5.4mlPEG/LiAc 溶液(IOmM Tris-HCl (PH8.0), ImMEDTA (PH8.0)，IOOmM LiAc (PH7.5)，40%PEG3350)和 530 μ I DMSO，混勻后的酵母即為感受態(tài)細(xì)胞。
[0059]進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化時(shí)，取新鮮的感受態(tài)細(xì)胞，加入28yg的pSos-ETR2和28yg pMyrcDNA文庫(kù)質(zhì)粒以及14μ 1β-巰基乙醇(14M)混勻，用滅過(guò)菌的EP管分裝，每管100 μ I。室溫溫育30分鐘，中間偶爾輕輕的搖勻。然后42°C熱激20分鐘，冰浴3分鐘，低速離心收集酵母，用0.5mllM的Sorbitol重懸，平鋪于SD/Glu (-UL)平板上。24°C培養(yǎng)2天后，用無(wú)菌的濾紙將酵母菌落復(fù)制到SD/Gal (-UL)平板上，37°C培養(yǎng)6天，長(zhǎng)出可能的陽(yáng)性克隆，挑至SD/Glu (-UL)平板中。24°C生長(zhǎng)2天后，再用30 μ I無(wú)菌水稀釋菌斑，在SD/Glu (-UL)和SD/Gal (-UL)平板上各滴入3μ I菌液，37°C培養(yǎng)2-4天。在SD/Gal (-UL)上生長(zhǎng)而在SD/Glu (-UL)上不生長(zhǎng)的克隆即為陽(yáng)性克隆。
[0060]陽(yáng)性克隆用SD/Glu (-UL)液體培養(yǎng)基24°C振蕩培養(yǎng)2_3天后，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5 α )后，涂板于含氯霉素的培養(yǎng)基上，挑取若干個(gè)單克隆，提質(zhì)粒，用通用引物pMyrF和pMyrR進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)插入片段大小是否相同，以初步確定酵母單克隆內(nèi)的pMyr載體是否相同。然后把這些pMyr質(zhì)粒分別與pSos_ETR2用上述方法共轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞內(nèi)，24°C生長(zhǎng)3-4天后，再分別轉(zhuǎn)入SD/Glu (-UL)和SD/Gal (-UL)平板上，37°C (同時(shí)也做24°C生長(zhǎng)對(duì)照)培養(yǎng)2-4天。在SD/Gal (-UL)上生長(zhǎng)而在SD/Glu (-UL)上不生長(zhǎng)的相應(yīng)pMyr質(zhì)粒，即為陽(yáng)性質(zhì)粒。最后,通過(guò)測(cè)序得知其序列。
[0061]酵母雙雜交驗(yàn)證時(shí)，按上述方法制備并分裝酵母感受態(tài)細(xì)胞，每管約100μ 1，加入連有相應(yīng)基因的PMyr和pSOS載體各300ng。42°C熱激20分鐘，冰浴3分鐘，低速離心收集酵母，再用0.5ml IM的Sorbitol重懸，平鋪于SD/Glu (-UL)平板上。24°C培養(yǎng)4-6天后，挑斑，用30 μ I無(wú)菌水稀釋，在SD/Glu (-UL)和SD/Gal (-UL)平板上各滴入3 μ I菌液，每個(gè)共轉(zhuǎn)化至少做三個(gè)重復(fù)。分別用24°C和37°C培養(yǎng)4天以上。37°C培養(yǎng)條件下，在SD/Gal (-UL)上生長(zhǎng)而在SD/Glu (_UL)上不生長(zhǎng)的克隆即為陽(yáng)性克隆。而24°C培養(yǎng)作為對(duì)照。同時(shí)做pSOSMAFB+pMYRLamiC為陰性對(duì)照，pSOSMAFB+pMYRSB為陽(yáng)性對(duì)照。
[0062]把去除跨膜結(jié)構(gòu)的ETR2 (AA156-773)連入pSOS載體，以此為誘餌進(jìn)行酵母雙雜交篩選，共進(jìn)行十個(gè)庫(kù)容篩選。將篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，確認(rèn)之后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。
[0063]測(cè)序結(jié)果的分析表明，獲得的陽(yáng)性克隆編碼了 4種蛋白，其中有一個(gè)蛋白重復(fù)出現(xiàn)超過(guò) 10 次，將其命名為 ERIPl (Ethylene Receptor-1nteracting Protein)。ERIPl 屬于一類受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的小分子量蛋白家族。對(duì)這一基因家族的蛋白序列進(jìn)行聚類分析，獲得與ERIPl同源性較高的兩個(gè)蛋白ERIP2和ERIP3。進(jìn)化樹分析表明，ERIP1、2和3聚集于一個(gè)小分支中通過(guò)酵母雙雜交驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ERIP2與ETR2相互作用。
[0064]由于乙烯受體之間有較大的相似性，因此驗(yàn)證了 ERIPs與擬南芥五個(gè)乙烯受體的互作關(guān)系。結(jié)果表明，ERIP2除了和ETR2有較強(qiáng)的互作外，還與EIN4 (AA160-766)有弱的相互作用(圖2)。
[0065]經(jīng)過(guò)測(cè)序蛋白ERIP2的編碼基因ERIP2的核苷酸序列為序列表中的序列1，蛋白ERIP2的氨基酸序列為序列表中的序列2?？扇斯ず铣尚蛄蠭。
[0066]2、ETR2蛋白與ERIP2蛋白相互作用的驗(yàn)證
[0067]酵母雙元雜交所得到的陽(yáng)性克隆，一般需要進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證才能確信其相互作用。
[0068]體外分析ETR2與ERIP2的相互作用。首先分別構(gòu)建了 ETR2和EIN4的酵母Bait載體。所用引物為:
[0069]pS0S-ETR2 =GCgtcgacTCATGAGCTTGGTCGTGAAGTT(Sail 位點(diǎn))
[0070]CGacgcgtTTAGAGAAGTTGGTCAGCTTGC (Mlu 位點(diǎn))
[0071]pS0S-EIN4 =GCgtcgac GAAGAGGCAGAAGGAAATGAG(SalHlS)
[0072]CGacgcgt AACCGAGACAACAACAACAAC (Mlu 位點(diǎn))
[0073]pMyr-ERIP2:CCGGAATTCATGGCTATATTCGGTAAACT (EcoRI 位點(diǎn))
[0074]CCGCTCGAGTCAATAAGTATAGAACTCAG (Xho I 位點(diǎn))
[0075]PCR擴(kuò)增后，直接連至pSOS載體中，測(cè)序驗(yàn)證。
[0076]圖2 顯示了 pS0S-ETR2 和 pS0S_EIN4 可分別與 ERIP2 相互作用。pS0S_ETR2 與ERIP2有較強(qiáng)的作用，而pSOS-EIM和ERIP2互作很弱。
[0077]實(shí)施例2、ERIP2蛋白的應(yīng)用
[0078]為了鑒定ERIP2的功能，構(gòu)建了該基因的過(guò)量表達(dá)，過(guò)量表達(dá)用的載體為pROKII。
[0079]一、重組載體pROK I1-ERIP2的獲得
[0080]提取野生型擬南芥幼苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ；以cDNA為模板，用ERIP2-F1和ERIP2-R1作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的約400bpPCR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I自5’末端第1-393位核苷酸所示的核苷酸，即為ERIP2基因的cDNA。
[0081]ERIP2-F1:GGA AGATCT ATGGCTATATTCGGTAAACT (序列 3，BglII)
[0082]ERIP2-R1:CGG GGTACC ATAAGTATAGAACTCAGCCA (序列 4，Sail)
[0083]用限制性內(nèi)切酶BglII和SalI雙酶切上述PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣酶切植物表達(dá)載體pROK II得到的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序，該質(zhì)粒為將序列表中的序列I自5’末端第1-393位核苷酸插入pROK II的BglII和Sal I酶切位點(diǎn)之間得到的載體，將該載體命名為pROK I1-ERIP2，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示。
[0084]二、轉(zhuǎn)基因株系的獲得及鑒定
[0085]1、轉(zhuǎn)基因株系的獲得
[0086]將重組載體pROK I1-ERIP2用電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果表明質(zhì)粒為pROK I1-ERIP2，含有上述質(zhì)粒的重組菌命分別名為 GV3101/pR0K I1-ERIP2。
[0087]挑取轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的單菌落在5mlLB中，于28° C培養(yǎng)8小時(shí)，再轉(zhuǎn)接到200mlLB中繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，收菌后重懸于LB培養(yǎng)基中得到轉(zhuǎn)化液。將野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana) Col-O的花浸泡于轉(zhuǎn)化液中10秒，取出后放入MS培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)8小時(shí)，獲得Ttl代轉(zhuǎn)化種子，將其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培養(yǎng)基上，獲得28?；代轉(zhuǎn)ERIP2擬南芥。
[0088]2、轉(zhuǎn)基因株系Real Time PCR鑒定
[0089]提取Ttl代轉(zhuǎn)ERIP2擬南芥的株系ERIP2-0E20和ERIP2-0E22葉片的RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以野生型擬南芥(Col-O)為對(duì)照。引物為ERIP2-F1和ERIP2-R1。[0090]作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的擬南芥Actin的引物為:
[0091]Atactin-F ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC
[0092]Atactin-R TGCTCATACGGTCAGCGATA
[0093]結(jié)果如圖4A所示，篩選出ERIP2過(guò)表株系ERIP2-0E20和ERIP2-0E22中ERIP2的表達(dá)均明顯較對(duì)照Col-O高。
[0094]說(shuō)明上述株系均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植物。
[0095]采用同樣的方法將空載體pROK II轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，分別得到TtlRRpROK II擬南芥，提取TtlRRpROK II擬南芥的RNA，用上述Real Time PCR鑒定，結(jié)果均沒有目的片段，說(shuō)明均為陽(yáng)性。
[0096]三、轉(zhuǎn)基因植株的表型分析
[0097]分別收獲上述Ttl代轉(zhuǎn)ERIP2擬南芥的株系ERIP2-0E20和ERIP2-0E22的種子，播于含卡那霉素(50mg/L)的MS篩選培養(yǎng)基上。待篩選得到的T1代植株長(zhǎng)至6葉時(shí)移到蛭石上生長(zhǎng)。
[0098]將T1代單株收獲后，各單株種子分別播種，用卡那霉素繼續(xù)篩選以觀察T2代的分離情況，如此重復(fù)數(shù)代直至獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合株系:T3代轉(zhuǎn)ERIP2擬南芥的株系ERIP2-0E20 和 ERIP2-0E22。
[0099]將上述T3代轉(zhuǎn)ERIP2擬南芥的株系ERIP2-0E20和ERIP2-0E22、野生型擬南芥(col-0/WT)分別種于蛭石中，22-25° C每天的光照為16h/8h (光照/黑暗)。每個(gè)株系30
株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0100]在播種后第25天拍照，結(jié)果如圖4B所示，可以看出，2個(gè)陽(yáng)性過(guò)表達(dá)株系ERIP2-0E20和ERIP2-0E22的生長(zhǎng)明顯好于對(duì)照col_0，蓮座和根均較長(zhǎng)。
[0101]在播種后第27天觀察和統(tǒng)計(jì)上述T3代轉(zhuǎn)ERIP2擬南芥的株系ERIP2-0E20和ERIP2-0E22、野生型擬南芥(WT)蓮座直徑，結(jié)果如圖5和表1所示，其中，圖5A為表型觀察，圖5B為蓮座直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果，可以看出，T3代轉(zhuǎn)ERIP2擬南芥的株系ERIP2-0E20和ERIP2-0E22的蓮座直徑明顯大于野生型擬南芥(col_0)。
[0102]表1為ERIP2過(guò)表達(dá)和對(duì)照植株蓮座直徑統(tǒng)計(jì)
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物蓮座或子葉大小相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦翴)-4)中任一一種的DNA分子: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)序列表中序列I自5’端第I到第393位堿基所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物蓮座或子葉大小相關(guān)蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物蓮座或子葉大小相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌； 所述重組載體具體為將權(quán)利要求2或3所述基因插入pROK II載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
6.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物蓮座和/或子葉大小中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述調(diào)節(jié)植物蓮座和/子葉大小為提高植物蓮座或子葉大??；所述蓮座大小具體通過(guò)蓮座直徑體現(xiàn)，所述子葉大小具體通過(guò)子葉長(zhǎng)度體現(xiàn)； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為十字花科植物，所述十字花科植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物， 所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下I)或2)中至少一種特征: 1)所述轉(zhuǎn)基因植物的蓮座直徑大于所述目的植物； 2)所述轉(zhuǎn)基因植物的子葉長(zhǎng)度大于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于: 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因通過(guò)權(quán)利要求4所述重組載體導(dǎo)入目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述目的植物為雙子葉植 物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為十字花科植物，所述十字花科植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103524606SQ201210234418
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月6日
【發(fā)明者】張勁松, 陳受宜, 陶建軍, 張萬(wàn)科, 馬彪, 何鍶潔, 林晴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所