專利名稱：人idh基因突變的檢測(cè)引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種生物檢測(cè)試劑，更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及ー種人IDH基因突變(包括IDHl基因和IDH2基因)的檢測(cè)引物和試劑盒。
背景技術(shù)：
異朽1檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)是三羧酸循環(huán)中一種關(guān)鍵性限速酶，在細(xì)胞氧化損傷反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。自2008年IDH基因被發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中突變以來(lái)，迅速成為研究熱點(diǎn)。IDH基因突變可作為診斷膠質(zhì)瘤的一個(gè)特異性指標(biāo)，是膠質(zhì)瘤分級(jí)判斷和鑒別的有效分子標(biāo)記，并可作為判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素。IDH突變還發(fā)生于少數(shù)白血病及骨髓增殖性疾病(MPD)等多種血液病中。人類IDH有IDHl、IDH2和IDH3三個(gè)亞家族，IDHl位于胞漿和過(guò)氧化物酶體內(nèi)，IDH2和IDH3酶位于線粒體內(nèi)，參與三羧酸循環(huán)并提供能量。目前，僅發(fā)現(xiàn)IDHl和IDH2基因存在突變。IDHl基因位于染色體2q33. 3，目前發(fā)現(xiàn)的IDHl基因突變都發(fā)生在第四外顯子的 R132 位，共發(fā)現(xiàn)了六種突變類型(包括 R132H，R132C，R132S，R132G，R132L，R132V)，IDH2基因位于染色體15q26. 1，目前發(fā)現(xiàn)的IDH2基因突變發(fā)生在第四外顯子的R140 (包括R140W, R140L 和 R140Q 三種)和 R172 (包括 R172K, R172M, R172G, R172S 和 R172W 五種)。
由于臨床對(duì)IDH突變檢測(cè)診斷作用的極大興趣，當(dāng)前德國(guó)已出現(xiàn)了商業(yè)化的對(duì)IDH1R132H高度特異的單克隆抗體，可實(shí)現(xiàn)在常規(guī)免疫組化中對(duì)突變基因編碼的蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)。由于可以簡(jiǎn)單納入常規(guī)組織病理學(xué)工作，該抗體在德國(guó)臨床診斷中得到了廣泛應(yīng)用。但是，針對(duì)其他類型的IDHl突變(R132C，R132S，R132L，R132G)以及IDH2突變的單克隆抗體尚未商業(yè)化生產(chǎn)。用單克隆抗體檢測(cè)突變?yōu)橥蛔儽硇蜋z測(cè)，通過(guò)檢測(cè)突變基因的表達(dá)蛋白來(lái)檢測(cè)基因突變，但由于受到腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的影響，常常不能真實(shí)反映基因突變情況。因此，現(xiàn)階段，考慮到膠質(zhì)瘤中IDH突變與預(yù)后密切相關(guān)，學(xué)者們推薦所有免疫組化為陰性的患者還需通過(guò)基因檢測(cè)的方法來(lái)判斷IDH基因是否存在突變。目前，對(duì)基因檢測(cè)突變的分析的技術(shù)方法主要包括測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性高效液相色譜(DHPLC)、熒光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。這些方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺陷，尚有待改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化。I.直接測(cè)序=Sanger測(cè)序法因?yàn)榭梢宰x到DNA每個(gè)堿基的變化，目前被認(rèn)為是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)方法。但是，因?yàn)殪`敏度低(檢測(cè)突變靈敏度約為20%)，檢測(cè)異質(zhì)性較高的臨床腫瘤組織樣本時(shí)假陰性率高。同吋，測(cè)序步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，多限于在科研單位進(jìn)行，大多數(shù)醫(yī)院都無(wú)法獨(dú)立完成檢測(cè)，不易于形成標(biāo)準(zhǔn)化操作、適合臨床單位應(yīng)用的體外診斷產(chǎn)品。2.熒光定量PCR法通過(guò)序列特異性探針實(shí)現(xiàn)基因突變檢測(cè)，該方法靈敏度高、特異性好，是目前基因檢測(cè)體外診斷試劑最常用的技術(shù)平臺(tái)。但是，該方法需熒光標(biāo)記的特異性探針，一種探針只能進(jìn)行ー種基因突變類型的檢測(cè)，因此檢測(cè)試劑成本高，檢出突變種類少，操作相對(duì)復(fù)雜。對(duì)突變類型較多的IDH基因，該方法并不十分合適。目前，尚未開(kāi)發(fā)成功基于該方法的檢測(cè)IDH基因突變的試劑盒。3.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(RFLP):該方法成本低，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低，突變基因的檢出限在5 10%。但是，勞動(dòng)強(qiáng)度稍大、需專業(yè)的技術(shù)人員、不適于高通量檢測(cè)和大規(guī)模臨床應(yīng)用。4. SSCP, DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法操作復(fù)雜、對(duì)設(shè)備要求高，僅在科研單位實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，不適合大范圍推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在干解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)效果更全面、特異性高、漏檢率低的人IDH基因突變的檢測(cè)引物。本發(fā)明的另一目的在干解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種操作簡(jiǎn)單快捷、檢測(cè)效果更全面、特異性高、漏檢率低的人IDH基因突變的檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了ー種人IDH基因突變檢測(cè)引物對(duì)，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，所述引物對(duì)為IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO 1),IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO 2)；或IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG (SEQ ID NO: 3)，IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC(SEQ ID NO :4)。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了ー種人IDH基因突變檢測(cè)的試劑盒，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，所述試劑盒包括引物對(duì)IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO :1)，IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO :2)；或IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG(SEQ ID NO :3),IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC(SEQ ID NO :4)。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括突變對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)選的，所述試劑盒包括反應(yīng)液，反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTP混合液、MgCl2、引物對(duì)、DNA聚合酶、熒光染料和去DNA酶蒸餾水。更優(yōu)選的，所述反應(yīng)液各組分的反應(yīng)濃度為PCR緩沖液2X、dNTP混合液各
O.4-0. 8mM、MgCl2L 0-5. OmM、引物對(duì)各 O. 5-0. 8 μ M, DNA 聚合酶 O. 2-0. 6U/y L、熒光染料2Χ，去DNA酶蒸餾水加至配制2X檢測(cè)反應(yīng)液總體積。本發(fā)明采用的核心技術(shù)一高分辨率熔解曲線(HRM)分析技術(shù)是近年來(lái)興起的一種用于鑒別基因序列差異的分析方法。檢測(cè)原理是運(yùn)用PCR方法特異性擴(kuò)增IDH基因片段，繼之用HRM法分析擴(kuò)增片段的差異，在HRM分析步驟中，由于反應(yīng)體系中使用了ー種小分子熒光飽和染料，使突變導(dǎo)致的DNA分子熔解溫度的微小差異都能突顯出來(lái)。這種DNA分析技術(shù)以野生型基因組DNA為參照，能分辨出待檢測(cè)樣本中是否含有突變型基因，具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。該技術(shù)不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無(wú)需序列特異性探針，特別適用于突變位點(diǎn)較集中且臨床上無(wú)需區(qū)分具體突變類型的突變檢測(cè)，檢測(cè)突變靈敏度高于傳統(tǒng)測(cè)序。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于(I)特異性引物的設(shè)計(jì)針對(duì)IDHl和IDH2基因突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)所擴(kuò)增序列包含突變位點(diǎn)、擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率高的PCR引物，且擴(kuò)增目的片段不包含影響HRM分析的其他突變位點(diǎn)或SNP位點(diǎn)，以保證擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物在進(jìn)行HRM分析時(shí)的分辨率和準(zhǔn)確度。(2)對(duì)PCR反應(yīng)及HRM分析的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，PCR擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物的比例要求控制的盡可能低，以保證HRM分析的準(zhǔn)確度，同時(shí)，野生型與突變型分子的熔解曲線差異達(dá)到最大化，從而最大限度地提高分析靈敏度。本發(fā)明的檢測(cè)引物和相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒不受突變類型局限，無(wú)需序列特異性探
針，可以檢測(cè)IDHl和IDH2基因外顯子4上發(fā)生的所有突變類型。在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對(duì)樣品突變的分析。操作簡(jiǎn)便快速，成本低，靈敏度、特異性好，結(jié)果準(zhǔn)確，為臨床IDH基因突變檢測(cè)提供ー種便利有效的新手段，輔助腫瘤診斷、治療及判斷預(yù)后。


圖1(a)為本發(fā)明實(shí)施例I中樣本中不含IDHl基因第4外顯子突變的HRM分析圖；圖I (b)為本發(fā)明實(shí)施例I中樣本中有含IDHl基因第4外顯子R132H突變的HRM分析圖；圖I (c)為本發(fā)明實(shí)施例I中樣本中有含IDHl基因第4外顯子R132C突變的HRM分析圖；圖I (d)為本發(fā)明實(shí)施例I中樣本中有含IDHl基因第4外顯子R132S突變的HRM分析圖；圖2(a)為本發(fā)明實(shí)施例2中樣本中不含IDH2基因第4外顯子突變的HRM分析圖；圖2(b)為本發(fā)明實(shí)施例2中樣本中有含IDH2基因第4外顯子R140W突變的HRM分析圖；圖2(c)為本發(fā)明實(shí)施例2中樣本中有含IDH2基因第4外顯子R140L突變的HRM分析圖；圖2(d)為本發(fā)明實(shí)施例2中樣本中有含IDH2基因第4外顯子R172K突變的HRM分析圖；圖3(a)為本發(fā)明實(shí)施例4中樣本IDHl基因第4外顯子的擴(kuò)增曲線圖；圖3 (b)為本發(fā)明實(shí)施例4中PCR產(chǎn)物熔解峰分析圖。
具體實(shí)施例方式檢測(cè)人IDH基因突變的檢測(cè)方法，包括以下步驟I.提取石蠟包埋腫瘤組織或外周血、骨髓基因組DNA，將DNA濃度調(diào)整到2_10ng/μ L02.樣本DNA IDHl和IDH2基因外顯子4的特異性擴(kuò)增
①反應(yīng)體系的配制
權(quán)利要求
1.一種人IDH基因突變檢測(cè)引物對(duì)，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，其特征在于，所述引物對(duì)為IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA,IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT ； 或 IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG,IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC。
2.—種人IDH基因突變檢測(cè)的試劑盒，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，其特征在于，所述試劑盒包括引物對(duì)IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA,IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT ； 或IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG,IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人IDH基因突變檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括突變對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人IDH基因突變檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括反應(yīng)液，反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTP混合液、MgCl2、引物對(duì)、DNA聚合酶、熒光染料和去DNA酶蒸餾水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人IDH基因突變檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液各組分的反應(yīng)濃度為=PCR緩沖液2X、dNTP混合液各0. 4-0. 8mM、MgCl2L 0-5. OmM、引物對(duì)各.0.5-0. 8 uM, DNA聚合酶0. 2-0. 6U/ u L、熒光染料2X，去DNA酶蒸餾水加至配制2X檢測(cè)反應(yīng)液總體積。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人IDH基因突變的檢測(cè)引物和檢測(cè)試劑盒，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)IDH1和IDH2基因外顯子4上的基因突變，檢測(cè)樣本為腫瘤組織、血液或骨髓細(xì)胞提取的人類基因組DNA，用于臨床腦膠質(zhì)瘤和血液病患者，輔助腫瘤診斷、治療及判斷預(yù)后。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的操作簡(jiǎn)單快捷，檢測(cè)效果好。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102732633SQ20121023473
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者吳嵐曉, 姚飛, 曾慶, 譚杰鋒 申請(qǐng)人:廣州好芝生物科技有限公司