專利名稱：水稻雌雄育性相關(guān)蛋白、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程，特別是涉及一種水稻雌雄育性相關(guān)的蛋白、其編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雄性不育在植物界中很普遍，據(jù)大量文獻(xiàn)檢索，已經(jīng)在43科，162屬，320個(gè)種和297個(gè)種間雜種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象，并且這個(gè)數(shù)目還在不斷增加。由于雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，幾十年來對雄性不育機(jī)理的探索一直是一個(gè)非常活躍的研究領(lǐng)域，特別是近年來對雄性不育的分子生物學(xué)研究更是成果豐碩，不斷有關(guān)于雄性不育分子機(jī)制的 文章總結(jié)這方面的研究成果并提出了若干相應(yīng)理論和假設(shè)，豐富了雜種優(yōu)勢利用的理論基礎(chǔ)，提高了人們對雄性不育機(jī)理的認(rèn)識(shí)。近年來應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)對多種雄性不育農(nóng)作物的花藥敗育過程做了研究，取得了一些新的結(jié)果。相比雄性不育，植物雌性不育的研究起步較晚，認(rèn)識(shí)程度也較淺。該類現(xiàn)象的相關(guān)報(bào)道始于上個(gè)世紀(jì)50年代。目前，人們已在水稻、玉米、小麥、蘭花、百合、甘藍(lán)型油菜等十幾種植物中發(fā)現(xiàn)了雌性不育現(xiàn)象。正常植物雌性器官發(fā)育主要指子房的發(fā)育(包括胚珠發(fā)育和胚囊形成)，如果雌性器官胚珠或卵細(xì)胞發(fā)育受阻或直至敗育，就表現(xiàn)出植物雌性不育現(xiàn)象。大部分研究工作還停留在形態(tài)解剖學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)水平，近年來比較多的開展了酶水平及膜水平調(diào)控機(jī)制的研究，也有部分工作結(jié)合雄性不育機(jī)制的研究對雌性不育進(jìn)行了探討，但大多數(shù)采用被子植物為研究材料。到目前為止，對配子體發(fā)生的研究還處于描述和細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)水平上，對控制它們的發(fā)生、發(fā)育的分子基礎(chǔ)了解還很少。目前已報(bào)道了一些水稻雄性不育基因和少量雌性不育基因的染色體定位，其中少數(shù)基因已經(jīng)被分離克隆。但是在水稻中同時(shí)控制水稻雌性和雄性不育的基因尚未有被分離克隆的報(bào)道，水稻雌雄育性協(xié)同控制的分子基礎(chǔ)還不清楚。因此，植物雌雄育性控制基因的克隆和功能研究，對于明確植物雌雄育性控制的分子機(jī)理和不育特性在雜交稻生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的意義。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，至今未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明基因MFSl相關(guān)的功能分析的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻雌雄育性相關(guān)蛋白MFS1、其編碼基因及在控制水稻雌雄器官育性或鑒定、提高水稻雌雄育性中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為應(yīng)用圖位克隆技術(shù)從水稻材料中花9號(hào)中一個(gè)不育突變體中獲得一種雌雄育性相關(guān)的基因，該基因的缺失導(dǎo)致水稻雄性雌性器官的發(fā)育障礙，命名為雌雄不育基因(MFSl)0在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種水稻雌雄育性相關(guān)蛋白，其一級結(jié)構(gòu)為如SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。同時(shí)，本發(fā)明提供一種分離的水稻雌雄育性相關(guān)基因，所述基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。本文中，所述的“不育”的植物是指一種植物，其在適當(dāng)?shù)纳L條件下生長至一定的階段(如成熟階段)時(shí)，比在相同條件下生長的同類植物的結(jié)實(shí)率顯著降低(如降低40% ；較佳地降低60% ;更佳地降低80% ;最佳地降低95%或更多)。本發(fā)明還包括多肽，可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選的是重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或是使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括MFSl蛋白的片段、衍生物和類似物。本文中，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的MFSl蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(I)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保 守型氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(2)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(3)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“MFS I蛋白”指具有SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO. 2序列的蛋白相同功能的、SEQ IDN0. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)或更少1-8個(gè)或1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如,在本領(lǐng)域內(nèi)，用性能相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)統(tǒng)稱也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。還包括MFSl蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與MFSl蛋白編碼DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用MFSl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有與SEQ ID NO. 2序列有至少50%，較佳地至少60%，70%，80%，更佳地至少85%，90%，95%相同性的多肽。本發(fā)明還提供了其他的多肽，如包含MFSl蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 MFSl蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有MFSl蛋白的至少約20個(gè)連續(xù)的氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約100個(gè)連續(xù)的氨基酸，最佳地至少約150個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供MFSl蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然的MFSl蛋白的差異可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生的隨機(jī)誘變，還可以通過定點(diǎn)誘變法或其他的已知的分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如￠-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中還包括MFSl蛋白保守性變異蛋白(多肽)，與SEQ IDN0. 2的氨基酸序列相比，有至多20個(gè)，較佳地至多10個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替代而形成的多肽，且保留與SEQ ID NO. 2序列的蛋白相同的功能。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明MFSl蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多聚核苷酸(基因)可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。 編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO. 2所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO. 2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO. 2所示的編碼區(qū)序列有差別的核苷酸序列。編碼SEQ ID NO. 2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，他可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，進(jìn)一步較佳地至少80%，更佳地至少90%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低的離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0. 1%SDS, 60°C ;或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50% (V/V)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. lFicoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在70%以上，較佳地至少80%以上，更佳地90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含有15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好地是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核算片段可用于核算的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼MFSl蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明的MFSl蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)的序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確的次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增值和的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可以利用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，先合成多個(gè)小片段，然后在進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外,還可同過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸載體，以及用本發(fā)明的載體或MFSl蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的DNA重組技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列來表達(dá)或生產(chǎn)重組的MFSl蛋白。一般說來有以下步驟用本發(fā)明得的編碼MFSl蛋白的多核苷酸或變異體，或用該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，MFSl蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以使用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含MFSl蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄、翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中適當(dāng)?shù)膯?dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA的合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用二氫葉酸還原酶、新霉素抗性及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性的例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬，農(nóng)桿菌；真核細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。本發(fā)明的提供的蛋白或其編碼基因的用途，用于控制水稻雌雄器官育性；鑒定雌雄育性的分子標(biāo)記；提高水稻育性的方法。本發(fā)明可通過調(diào)節(jié)所述植物中MFSl基因的表達(dá)或活性，調(diào)節(jié)植物的育性促進(jìn)還是抑制MFSl的表達(dá)活性主要取決于植物所需改良的性狀而定。當(dāng)需要增加植物的結(jié)實(shí)率時(shí)，可以通過提高所述植物中MFSl基因的表達(dá)或活性來實(shí)現(xiàn)；當(dāng)需要降低植物的結(jié)實(shí)率，甚至使植物表現(xiàn)徹底不育時(shí)，可以通過降低所述植物中MFSl基因的表達(dá)或活性來實(shí)現(xiàn)。增加MFSl基因的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可通過轉(zhuǎn)入攜帶MFSl編碼基因的表達(dá)載體使植株過量表達(dá)MFSl ;或可以通過強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)從而增強(qiáng)MFSl基因或其同源基因的表達(dá)；或者通過增強(qiáng)子(如水稻waxy基因第一內(nèi)含子、Actin基因第一內(nèi)含子)來增強(qiáng)該MFSl基因的表達(dá)。適用于本發(fā)明方法的強(qiáng)啟動(dòng)子包括但不限于35S啟動(dòng)子、水稻的Actinl、Actin2啟動(dòng)子、玉米的Ubi啟動(dòng)子等。抑制MFSl基因表達(dá)的方法也是本領(lǐng)域周知的，例如，可通過反義或RNA干擾(RNAi)或基因敲出來實(shí)現(xiàn)。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，獲得MFSl基因高表達(dá)的植株的方法如下(I)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有所述的MFSl蛋白的編碼序列； (2)將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(I)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述MFSl蛋白編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入所述MFSl蛋白編碼序列的植物細(xì)胞、組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株。其中，可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件來實(shí)施此方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，提供了一種MFSl蛋白，其全長的開放閱讀框(ORF)序列如SEQ ID NO. I所示，編碼一個(gè)含有626個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO. 2)。在野生型水稻和雌雄不育突變體的序列分析表明，在突變體MFSl基因位點(diǎn)完全缺失，從而引起水稻不育的表型。通過轉(zhuǎn)基因的方法，將正常的野生型基因MFSl導(dǎo)入到突變體中可恢復(fù)正常可育表型。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，構(gòu)建了 MFSi基因互補(bǔ)表達(dá)載體Phb-Pmfsi-MfsuMfsi基因過量表達(dá)載體PHB-MFSI和MFSl基因干擾載體P 0sAct2-Rl_G-R2，通過轉(zhuǎn)基因的方法，將正常的野生型基因MFSl導(dǎo)入到突變體中可恢復(fù)正?？捎硇蚟fMFSl的干擾載體導(dǎo)入正常野生型植株中，會(huì)降低水稻結(jié)實(shí)率。上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)水稻雌雄育性控制基因(MFSl)為水稻等植物的雌雄育性控制改良提供新的技術(shù)途徑。MFSl基因在去除轉(zhuǎn)基因成分影響方面具有廣泛的應(yīng)用前景。該基因可以作為水稻雌雄育性指標(biāo)的分子標(biāo)記，在水稻雜種優(yōu)勢利用中具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖I為MFSl基因突變后的表型圖；其中A、B分別為野生型和突變體穗部；C、D分別為野生型和突變體小花；E、F分別為突變體和野生型授粉后結(jié)實(shí)情況；G、H分別為野生型和突變體花粉碘染；圖2為MFSl基因突變后的雄配子體發(fā)育障礙圖；其中WT為野生型；MFS_Z9為突變體；A和E為減數(shù)分裂前期；B和F為減數(shù)分裂期；C和G為四分體時(shí)期；D和H為小孢子時(shí)期和M為小孢子后期J和N為液泡化時(shí)期；K和0為有絲分裂時(shí)期；L和P為成熟花粉時(shí)期；圖3為MFSl基因突變后的雌配子體發(fā)育障礙圖；其中WT為野生型；MFS_Z9為突變體；其中A、B、C、D、E分別表示同一胚囊不同切片深度可見極核、卵細(xì)胞、反足細(xì)胞、助細(xì)胞、極核和反足細(xì)胞同在；F、G、H、I和J顯示不同切片深度均未見卵器分化，僅見未分化細(xì)胞團(tuán)，偶有極核；圖4為MFSl精細(xì)定位區(qū)域缺失驗(yàn)證圖；其中A為MFSl基因精細(xì)定位圖；B為精細(xì)定位區(qū)間缺失驗(yàn)證電泳圖其中檢測標(biāo)記與A圖對應(yīng)，泳道1-2、3-4和5-6分別對應(yīng)缺失區(qū)域左邊旁臨標(biāo)記D021、X1和D033 ; 17-18、19-20和21-22分別對應(yīng)缺失區(qū)域右邊旁臨標(biāo)記 DI012、DI013 和 DI014 ;7-8、9_10、11-12、13-14 和 15-16 分別對應(yīng)缺失區(qū)域標(biāo)記 X801、X803、X502、092 和 XP1。泳道 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 為突變體基因組 DNA 擴(kuò)增情況，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22為野生型基因組DNA擴(kuò)增情況；C為缺失基因表達(dá)驗(yàn)證；0rfl-l、Orf 1-2和Orf 1_3為缺失的第一基因的3個(gè)不同位點(diǎn)引物；0rf2_l、Orf2_2和0rf2-3為缺失的第二基因的3個(gè)不同位點(diǎn)引物；0rf3-l、0rf3-2和Orf3_3為缺失的第三基因的3個(gè)不同位點(diǎn)引物；WT為野生型；MFS-Z9為突變體；Actin-l為內(nèi)參基因；圖5為MFSl基因主要控制水稻育性圖；其中，I為突變體互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株，2為突 變體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非特別說明，否則百分比和分?jǐn)?shù)
按重量計(jì)算。實(shí)施例IMFSl基因突變的表型在水稻材料中花9號(hào)中一個(gè)不育突變體(購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所資源中心)，經(jīng)正反雜交和細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)突變體表現(xiàn)為雌雄器官均不育(圖1)，進(jìn)一步利用石蠟切片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，其不育的根本原因在于突變體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂不正常(圖2)和胚囊結(jié)構(gòu)的異常(圖3)。實(shí)施例2MFS1基因突變的圖位克隆1、MFS1基因突變的圖位克隆利用G630等做母本與包含突變基因的雜合體雜交，構(gòu)建分離群體，將基因定位，并實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位區(qū)間標(biāo)記加密和序列比較分析表明，在突變體在該區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)約20KB的片段缺失，導(dǎo)致了 3個(gè)預(yù)測基因(0rfl、0rf2和orf3)表達(dá)產(chǎn)物缺失(圖4)，從而引起水稻不育的表型。通過基因預(yù)測和轉(zhuǎn)基因的方法，將其中一個(gè)正常的野生型基因MFSl導(dǎo)入到突變體中可恢復(fù)正?？捎硇?圖5)，其余2個(gè)基因的導(dǎo)入則育性不可恢復(fù)。野生型MFSl基因的序列如SEQ ID NO. I所示，編碼蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。MFSl基因的全長ORF長度為1881bp，編碼626個(gè)氨基酸。2、MFSl基因全長cDNA克隆以正常野生型水稻日本晴品種的RNA為模板，合成第一鏈cDNA，用該MFSl基因ORF序列的5’和3’端的寡核苷酸作為PCR引物(SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4)，用高保真Taq酶Primerstar進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約I. 8K的MFSl基因的全長cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。將該擴(kuò)增產(chǎn)物通過Pst I和Sac I限制性酶切重組進(jìn)載體pBluescript sk+的相應(yīng)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)，并對重組子進(jìn)行測序驗(yàn)證。該重組的過渡質(zhì)粒載體稱為pBS-MFSl。5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 3)5’ -CTGCAGAACCAATGCATTGGATGACGGTGGAGGAGA-3，3，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 4)5， -CGGAGCTCCTAGACCAGCTCCCAGTCCCCA-3’3、MFS1基因啟動(dòng)子克隆在本實(shí)施例中，以正常野生型水稻日本晴品種的DNA為模板，以所述MFSl基因起始密碼子前面約2. 5K片段的5’和3’端的寡核苷酸作為PCR引物(SEQ ID NO:5和SEQID N0:6)，用高保真Taq酶KOD Plus進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約2. 5K的MFSl基因的啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物，序列如SEQ ID NO. 11所示。將該擴(kuò)增產(chǎn)物通過Spe I和Pst I限制性酶切重組進(jìn)載體 pBluescript sk+ (購自Stratagene公司)的相應(yīng)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)，并對重組子進(jìn)行測序驗(yàn)證。該重組的過渡質(zhì)粒載體稱為PBS-Pmfsiij5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 5)5’ -GGACTAGTCTTAATTCTCATGTAATGCGTGTGCCAC-3’3，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 6)5， -CTGCAGAACCAATGCATTGGCTTCCTCCAATCAATCA-3’實(shí)施例3MFS1基因水稻轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)本實(shí)施例采用表達(dá)載體PHB (Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商購)作為水稻轉(zhuǎn)基因的載體。該載體編碼一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、卡那霉素抗性基因(KanD、潮霉素抗性基因(HygD、除草劑抗性基因(Baf)、2X35S啟動(dòng)子、NOS基因終止信號(hào)序列以及用于連接目的片段的多克隆位點(diǎn)(MCS)。在限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可插入MFSl基因或其片段構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒。1、MFS1基因互補(bǔ)表達(dá)載體構(gòu)建在本實(shí)施例中，首先用Pst I和Sac I限制性酶切pBS_MFSl和PHB，將pBS_MFSl消化后的約I. 8K的全長cDNA片段連入PHB的Pst I和Sac I位點(diǎn)中，對重組子進(jìn)行酶切和測序鑒定。用EcoR I 和 Bamh I 限制性酶切 pBS_PMFS1 和 PHB_35S_MFS1，回收 pBS_PMFS1 酶切消化后的約2. 5K的MFSl基因的啟動(dòng)子片段，與回收的PHB經(jīng)酶切消化后的約13K的載體骨架(去除掉2X35S啟動(dòng)子)連接，對重組子進(jìn)行酶切和測序鑒定，這樣成功構(gòu)建PHB-Pmfsi-MFSI,其中MFSl基因的表達(dá)由自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。2、MFSl基因過量表達(dá)載體構(gòu)建用Hind III和Sac I限制性酶切pBS-MFSl和PHB，將pBS-MFSl消化后的約I. 8K的全長cDNA片段連入PHB的Hind III和Sac I位點(diǎn)中，對重組子進(jìn)行酶切和測序鑒定。這樣成功構(gòu)建PHB-MFSl，其中MFSl基因的表達(dá)由2X35S強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。3、MFSl基因干擾載體構(gòu)建在本實(shí)施例中，以正常野生型水稻日本晴品種的RNA為模板，合成第一鏈cDNA，用該MFSl基因ORF序列的5’端約400bp的片段末端寡核苷酸作為PCR引物(SEQ ID NO:7和SEQ ID N0:8)，用高保真Taq酶KOD Plus進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約400bp的MFSl基因的正向干擾片段擴(kuò)增產(chǎn)物。同時(shí)用PCR引物(SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10)擴(kuò)增獲得反向干擾片段。將該正向擴(kuò)增產(chǎn)物通過SalI和HindIII限制性酶切重組進(jìn)載體pSK-G(pSK，可商購，其Sma I已經(jīng)插入GUS內(nèi)含子片段)的相應(yīng)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)，并對重組子進(jìn)行測序驗(yàn)證。該重組的過渡質(zhì)粒載體稱為pSK-Rl-G。將該反向擴(kuò)增產(chǎn)物通過EcoRI/BamHI限制性酶切重組進(jìn)載體pSK-Rl-G的相應(yīng)限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)，并對重組子進(jìn)行測序驗(yàn)證。該重組的過渡質(zhì)粒載體干擾結(jié)構(gòu)中間載體PSK-R1-G-R2。最后用SalI和SacI限制性酶切pSK-Rl_G_R2 和 p0sAct2-l_nos (He 等，2009, Plant Biotechnology Journal 227-239)，將pBS-Rl-G-R2消化后的約I. 5K的干擾結(jié)構(gòu)片段連入P0sAct2-l-nos的SalI和SacI位點(diǎn)中，對重組子進(jìn)行酶切和測序鑒定。這樣成功構(gòu)建干擾表達(dá)載體，其中該干擾結(jié)構(gòu)的表達(dá)由Actin2強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 7)5’ -ACGCGTCGACTGGTGCATGTGACTATCTT-3’3，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 8) 5， -CCCAAGCTTTCTCCCTGGTGA TGTTCT-3’5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 9)5’ -CGCGGATCCTGGTGCATGTGACTATCTT-3 3’端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 10)5’ -CCGGAATTCTCTCCCTGGTGATGTTCT-3，4、MFSl基因轉(zhuǎn)化水稻試驗(yàn)將上述PHB-Pmfsi-MFSU PHB-MFSl 和 P 0sAct2-Rl_G-R2 通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105(購自Biovector公司)。農(nóng)桿菌EHA105平板(4°C保存)挑取單菌落于YEP液體培養(yǎng)基(Km和Rif各50mg/L)中，28°C振蕩培養(yǎng)12 18h，然后取I 5mL菌液接到IOOmL YEP液體培養(yǎng)基(含乙酰丁香酮lOOiimol/L)中，振蕩培養(yǎng)4h后測OD值稀至相應(yīng)濃度(0D =0. 5)。將新鮮菌液于8000rpm、4°C、5min收集菌體，并重懸于三分之一提及的AAM培養(yǎng)基中。加入放有生長旺盛的胚性愈傷組織的滅菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，將愈傷組織轉(zhuǎn)接于共培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2 3d。共培養(yǎng)愈傷組織經(jīng)無菌水和含Cef 500mg/L的無菌水漂洗后，在工作臺(tái)上吹4h左右，轉(zhuǎn)接于預(yù)培養(yǎng)基中28°C暗培養(yǎng)5 7d。將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)接于含Hyg和Cef的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3 4周，再將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接于僅含Hyg的篩選培養(yǎng)基上，篩選I 2次。取抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，28°C光照分化。分化小苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基，28°C光照培養(yǎng)3 4周，開放培養(yǎng)煉苗7d左右，最后移栽到大田。其中，PHB-Pmfsi-MFSI轉(zhuǎn)化雌雄不育突變體-中花9號(hào)突變體(購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所資源中心)，PHB-MFSl和P 0sAct2-Rl-G-R2轉(zhuǎn)化正常野生型材料Kasalath和TP309, PHB-MFSl也部分轉(zhuǎn)化雌雄不育突變體。雌雄不育突變體愈傷組織獲得采用幼穗培養(yǎng)，其余正常材料均為成熟胚來源組織培養(yǎng)誘導(dǎo)。獲得的再生植株移栽成活后用除草劑或潮霉素篩選轉(zhuǎn)化植株；陽性植株提取葉片總DNA，經(jīng)PCR進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化植株。用轉(zhuǎn)基因Tl代調(diào)查育性表型，驗(yàn)證MFSl基因功能。實(shí)施例4MFSI基因功能分析如實(shí)施例3所述的方法獲得水稻MFSl互補(bǔ)表達(dá)的突變體轉(zhuǎn)基因植株，用轉(zhuǎn)基因Tl代植株觀察水稻育性。結(jié)果如圖5，轉(zhuǎn)MFSl互補(bǔ)表達(dá)基因的植株的育性得到了恢復(fù)，變成正?？捎砻鱉FSl基因的表達(dá)是水稻維持正常育性所必須的。如實(shí)施例3所述的方法獲得水稻MFSl過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，用轉(zhuǎn)基因Tl代植株觀察水稻育性。結(jié)果如表1，轉(zhuǎn)MFSl過量表達(dá)基因的FS植株的結(jié)實(shí)率較MFSl互補(bǔ)表達(dá)的FS植株有一定的提高。表明MFSl基因的高表達(dá)有利于提高水稻結(jié)實(shí)率。如實(shí)施例3所述的方法獲得水稻MFSl表達(dá)受干擾的轉(zhuǎn)基因植株，用轉(zhuǎn)基因Tl代植株觀察水稻育性。結(jié)果如表1，MFS1基因表達(dá)下調(diào)的植株的結(jié)實(shí)率降低。表明MFSl基因的下調(diào)表達(dá)會(huì)降低水稻結(jié)實(shí)率。表I干擾和過表達(dá)植株結(jié)實(shí)率 材料結(jié)實(shí)率(％)^
RNAi-I5473
RNAi-258 2
0VE-19178
0VE-189 4
CK8^2從上述分析可以看出，MFSl是水稻維持正常育性所必須的基因，缺失該基因會(huì)導(dǎo)致植株不育，上調(diào)該基因表達(dá)有利于植株結(jié)實(shí)率提高，下調(diào)該基因表達(dá)則降低植株的結(jié)實(shí)率。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種水稻雌雄育性相關(guān)蛋白，其特征在于，具有如SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列；或?yàn)镾EQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過ー個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，具有如SEQID NO. I所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述的載體或權(quán)利要求2或3所述基因的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求I所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述基因在控制水稻雌雄器官育性或鑒定、提高水稻雌雄育性中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，通過在水稻中過表達(dá)權(quán)利要求2所述的基因，提高水稻雌雄育性。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，通過在水稻中下調(diào)權(quán)利要求2所述的基因，降低水稻雌雄育性。
9.ー種調(diào)節(jié)水稻雌雄育性的方法，其特征在于，提高或降低水稻中權(quán)利要求I所述蛋白的活性；或提高或降低權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，包括以下步驟 (1)用權(quán)利要求2所述基因構(gòu)建表達(dá)載體； (2)將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，篩選表達(dá)所述基因的工程菌； (3)將工程菌導(dǎo)入目標(biāo)植物中，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻雌雄育性相關(guān)蛋白、其編碼基因及應(yīng)用。所述水稻雌雄育性相關(guān)蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或?yàn)樵摪被嵝蛄薪?jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的衍生序列。本發(fā)明還提供了編碼所述蛋白的基因。本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因能夠用于水稻雌雄器官育性控制或鑒定、調(diào)節(jié)水稻雌雄性育性水平。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102796185SQ20121023743
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者李雙成, 李平, 高鋒焱, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍, 朱軍, 劉懷年, 王玲霞 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)