專利名稱：一種同時(shí)檢測吡蟲啉和甲基對硫磷的雙特異單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用于同時(shí)檢測吡蟲啉和甲基對硫磷雙特異性單克隆抗體及制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中吡蟲啉、甲基對硫磷殘留的靈敏、快速檢測，特別適用于大批量樣品檢測。
背景技術(shù)：
卩比蟲啉(imidacloprid,1-(6-氯_3_卩比唳甲基)_N_硝基_2_咪唑啉亞胺)和甲基對硫磷( 8以1:11；
將明膠用超純水配置成1%的封閉液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入200ul，37°C孵育
1.5小時(shí)，將酶標(biāo)板中封閉液倒盡，并用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；分別配置一系列濃度的甲基對硫磷和吡蟲啉農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液，用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋20倍后，與細(xì)胞培養(yǎng)上清液等體積充分混合；將兩種農(nóng)藥-細(xì)胞上清混合液以每孔50ul加入酶標(biāo)板中；以為融合細(xì)胞上清與含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液等體積混合液作為陰性對照；37°C孵育1小時(shí)，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50ul，37°C下孵育45分鐘，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用檸檬酸鈉底物緩沖液現(xiàn)配四甲基聯(lián)苯胺顯色液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50ul，37°C黑暗條件下反應(yīng)10分鐘；96孔酶標(biāo)板中每孔加入2mol/L硫酸25ul，終止顯色；終止顯色后酶標(biāo)板立即在450nm下測定各孔單波長吸光值。設(shè)定甲基對硫磷包被原包被下，不含農(nóng)藥的細(xì)胞上清的讀數(shù)為Btll，含有甲基對硫磷農(nóng)藥的細(xì)胞上清讀數(shù)為B11,含有吡蟲啉農(nóng)藥的細(xì)胞上清液讀數(shù)為B12 ;吡蟲啉包被原包被下，不含農(nóng)藥的細(xì)胞上清的讀數(shù)為Btl2，含有甲基對硫磷農(nóng)藥的細(xì)胞上清讀數(shù)為B21，含有吡蟲啉農(nóng)藥的細(xì)胞上清液讀數(shù)為B22。當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)以下現(xiàn)象時(shí)=B11< B017B12 = B017B21 < B027B22 = Btl2，便可以認(rèn)定其分泌的抗體為雙特異性單克隆抗體，并利用有限稀釋法對細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，其分泌的上清即為所制的雙特異性單克隆抗體。產(chǎn)生上述雙特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株分類命名為:雜交瘤細(xì)胞株FQ-D6 ;2012年7月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢，武漢大學(xué))，保藏編號為:CCTCC NO:C201274有益效果實(shí)用性好:傳統(tǒng)的農(nóng)藥分析主要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，其前處理過程煩瑣，分析速度慢、成本高，同時(shí)使用的大量有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染，且對實(shí)驗(yàn)室的儀器化程度和人員專業(yè)素質(zhì)要求較高，不能滿足農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中對快速、簡便、準(zhǔn)確、大量檢測的要求。而我們提供的以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)方法具有操作簡便、快速、分析成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，一般不需要貴重儀器，可大量簡化樣品前處理過程，對使用人員的專業(yè)技術(shù)要求不高，容易普及和推廣，特別適用于大批量樣本檢測和現(xiàn)場檢測。檢測范圍廣:利用雜交-雜交瘤技術(shù)制備的雙特異性單克隆抗體，具有同時(shí)檢測兩類農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的特性，相比常規(guī)單克隆抗體而言，檢測范圍更寬，應(yīng)用前景更好?？贵w穩(wěn)定性好:此法所獲得的雜交瘤細(xì)胞在液氮條件下至少可以保存3年，所純化的抗體在-20°C條件下可存放2年


(1)吡蟲啉、甲基對硫磷的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1自來水樣品中吡蟲啉、甲基對硫磷殘留量檢測
ELISA反應(yīng)體系主要條件吡蟲啉包被原濃度為4.88ug/ml，腹水稀釋倍數(shù)為2000倍；甲基對硫磷包被原濃度為2.3ug/ml，腹水稀釋倍數(shù)為4000倍。I %明膠作封閉液，抗原抗體反應(yīng)液(含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液)中甲醇含量為5%、pH值為8.5、離子強(qiáng)度為0.8mol/L，微量分析板中每孔50ul。待測樣品準(zhǔn)備自來水樣品:將吡蟲啉和甲基對硫磷農(nóng)藥配成不同濃度的甲醇溶液，吡蟲啉濃度分別為6，12ug/ml,甲基對硫磷濃度分別為0.64，1.28ug/ml。將以上農(nóng)藥甲醇溶液用自來水稀釋20倍后，農(nóng)藥濃度分別為:吡蟲啉300，600ng/ml，甲基對硫磷32，64ng/ml。采用ELISA檢測方法對以上樣品進(jìn)行檢測，操作如下:(I)包被吡蟲啉包被原濃度為4.88ug/ml,甲基對硫磷包被原濃度為2.3ug/ml，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入50ul，4°C孵育過夜，倒盡，(2)封閉1%明膠作封閉物，96孔酶標(biāo)板中每孔加入200ul，37°C孵育1.5小時(shí)，倒盡，以含
0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次，并拍干；(3)加樣將上述準(zhǔn)備的吡蟲啉、甲基對硫磷溶液與保藏編號為CCTCC NO:C201274三體雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體溶液等體積混合后加入酶標(biāo)板中，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50ul，37°C孵育I小時(shí)，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；(4)加酶標(biāo)二抗用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50ul，37°C下孵育45分鐘，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；(5)數(shù)據(jù)處理將所獲得的結(jié)合率￠/ )代入圖1中吡蟲啉、甲基對硫磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，獲得吡蟲啉和甲基對硫磷的濃度，將所獲得的濃度數(shù)據(jù)乘以倍數(shù)2。并與添加濃度相比，獲得吡蟲啉在自來水中的添加回收率為97% -104%,甲基對硫磷的添加回收率為87% -99%。實(shí)施例2池塘水樣品中吡蟲啉、甲基對硫磷殘留量檢測ELISA反應(yīng)體系主要條件同實(shí)施例1待測樣品準(zhǔn)備池塘水樣品:將收集到的池塘水離心，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。吡蟲啉和甲基對硫磷農(nóng)藥配成不同濃度的甲醇溶液，吡蟲啉濃度分別為6，12ug/ml,甲基對硫磷濃度分別為0.64，1.28ug/ml。將以上農(nóng)藥甲醇溶液用池塘水稀釋20倍后，農(nóng)藥濃度分別為:吡蟲啉300，600ng/ml,甲基對硫磷 32,64ng/ml。采用ELISA檢測方法對以上樣品進(jìn)行檢測，操作如下:步驟(1)、(2)同實(shí)施例1⑶加樣將上述準(zhǔn)備的吡蟲啉、甲基對硫磷溶液與抗體溶液等體積混合后加入酶標(biāo)板中，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50ul，37°C孵育I小時(shí),將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡,并用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；(4)加酶標(biāo)二抗用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50ul，37°C下孵育45分鐘，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；(5)數(shù)據(jù)處理將所獲得的結(jié)合率￠/ )代入圖1中吡蟲啉、甲基對硫磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，獲得吡蟲啉和甲基對硫磷的濃度，并將所獲得的濃度數(shù)值乘以倍數(shù)2。并與添加濃度相比，獲得吡蟲啉在池塘水中的添加回收率為102%-104%， 甲基對硫磷的添加回收率為102%-104%。
權(quán)利要求
1.所述雙特異性單克隆抗體，是保藏編號為CCTCCNO:C201274的三體雜交瘤細(xì)胞株FQ-D6。
2.權(quán)利要求1所述三體雜交瘤細(xì)胞株FQ-D6所分泌的單克隆抗體，是同時(shí)檢測甲基對硫磷和卩比蟲啉的雙特異性單克隆抗體，為IgG2b-1gGl型,抗體輕鏈為kappa鏈。
3.權(quán)利要求1所述三體雜交瘤細(xì)胞株FQ-D6是通過將分泌抗甲基對硫磷單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和經(jīng)吡蟲啉抗原免疫的BALB/C小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合而獲得；具體制備方法包括 (1)HGPRT酶缺陷型抗甲基對硫磷雜交瘤細(xì)胞株的篩選 將分泌抗甲基對硫磷抗體的雜交瘤細(xì)胞株置于5ug/ml 8-AG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中逐漸提高培養(yǎng)基中8-AG濃度，最終使細(xì)胞株能適應(yīng)在50ug/ml的8-AG的培養(yǎng)基中生長；之后利用HAT選擇性DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，通過細(xì)胞是否存活來鑒別細(xì)胞中的酶是否缺失，缺失條件下進(jìn)行克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，并將細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?br> (2)細(xì)胞融合 利用間接非競爭ELISA檢測受吡蟲啉免疫原免疫過的BALB/C小鼠血清，取效價(jià)高者解剖獲取脾臟，將脾細(xì)胞與生長狀態(tài)良好的分泌抗甲基對硫磷抗體的HGPRT酶缺陷型雜交瘤細(xì)胞株通過雜交-雜交瘤技術(shù)制備三體雜交瘤細(xì)胞。并于37°C，體積比5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待7天后通過非競爭ELISA檢測融合孔上清篩選雜交瘤細(xì)胞。
(3)三體雜交瘤細(xì)胞篩選 對融合孔細(xì)胞上清采用間接非競爭ELISA法進(jìn)行初步篩選:甲基對硫磷和吡蟲啉兩種包被原下，有融合細(xì)胞的上清液讀數(shù)均等于或大于陰性對照讀數(shù)的2.1倍時(shí)，這樣的融合孔即為陽性孔； 為了進(jìn)一步確定篩選到陽性孔所分泌抗體是同時(shí)識(shí)別甲基對硫磷和吡蟲啉的雙特異性單克隆抗體，再通過間接競爭ELISA法篩選:設(shè)定甲基對硫磷包被原包被下，不含農(nóng)藥的細(xì)胞上清的讀數(shù)為Btll，含有甲基對硫磷農(nóng)藥的細(xì)胞上清讀數(shù)為B11,含有吡蟲啉農(nóng)藥的細(xì)胞上清液讀數(shù)為B12 ;吡蟲啉包被原包被下，不含農(nóng)藥的細(xì)胞上清的讀數(shù)為Btl2，含有甲基對硫磷農(nóng)藥的細(xì)胞上清讀數(shù)為B21，含有吡蟲啉農(nóng)藥的細(xì)胞上清液讀數(shù)為B22。當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)以下現(xiàn)象時(shí):Bn < B017B12 = B017B21 < B027B22 = Btl2，便可以認(rèn)定其分泌的抗體為雙特異性單克隆抗體，并利用有限稀釋法對細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，其分泌的上清即為所制的雙特異性單克隆抗體。
4.產(chǎn)生權(quán)利要求1或2所述的三體雜交瘤細(xì)胞株FQ-D6于2012年7月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:C201274。
全文摘要
本發(fā)明涉及同時(shí)識(shí)別吡蟲啉和甲基對硫磷農(nóng)藥的雙特異性單克隆抗體及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。用雜交-雜交瘤技術(shù)將分泌抗甲基對硫磷單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和經(jīng)吡蟲啉抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得了能穩(wěn)定分泌同時(shí)抗甲基對硫磷和吡蟲啉農(nóng)藥的雙特異性單克隆抗體FQ-D6。此抗體經(jīng)過有效性驗(yàn)證證明可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中甲基對硫磷和吡蟲啉殘留的快速靈敏檢測。本發(fā)明涉及的同時(shí)抗甲基對硫磷及吡蟲啉農(nóng)藥雙特異性單克隆抗體制備技術(shù)簡便可行，抗體的整個(gè)制備過程無需特別的儀器設(shè)備，容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/91GK103102415SQ20121023832
公開日2013年5月15日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 王利民, 華修德, 李剛 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)