專利名稱：一種Thermus脂肪酶的固定化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酶的固定化方法，特別涉及一種Thermus脂肪酶的固定化方法。背景技術：
脂肪酶(lipase，EC3.1.1. 3)是一類特殊的?；饷福軌蛟谟?水界面上催化酯水解、酯合成、酯交換、內酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構體拆分等化學反應。 迄今為止已分離提純了來源于動植物和微生物的各種脂肪酶，目前被廣泛研究的一種酶催化劑，被廣泛地應用于洗滌劑、油脂與食品加工、有機合成、表面清洗、醫(yī)藥、化妝品、香料、 皮革與造紙工業(yè)、生物柴油的制備、油脂改性等方面的研究。
Thermus脂肪酶是從深海熱液口等高溫環(huán)境中的嗜熱微生物(>55°C )中分離得到的一類嗜熱性脂肪酶，具有常規(guī)中溫酶(20°C飛5°C )及低溫酶(<20°C )無法比擬的優(yōu)點， 由于嗜熱酶的高溫反應活性，以及對有機溶劑、去污劑和變性劑的較強抗性，使它在食品、 醫(yī)藥、制革、石油開采及生物柴油等方面都有廣泛的應用潛力。但由于酶的價格昂貴、難以回收且在反應過程中易失活等原因，很大程度上限制了它在工業(yè)化生產(chǎn)中的應用。所謂酶的固定化，就是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內，仍能進行其特有的催化反應、并可回收及重復利用的一類技術。酶通過固定化后可以提高活力和穩(wěn)定性，而且易于回收重復使用，因此酶固定化技術被廣泛地應用，以降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。
發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種Thermus脂肪酶的固定化方法，為熱穩(wěn)定嗜熱酶類 (Mn-SOD)的固定化和應用提供一 種新的策略。
本發(fā)明采用的技術方案是
一種Thermus脂肪酶的固定化方法，所述方法為將氨基化納米磁性載體Fe3O4/ SiO2與pH8. O的緩沖溶液混合，加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h， 再加入以所述Tris-HCl緩沖溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3. 5h，磁分離，棄去上清液a，將沉淀a用緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法獲得將序列號為 AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大腸埃希氏桿菌(優(yōu)選E. Coli BL21(DE3))為宿主細胞進行重組，獲得含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC NO :1. 12252 ;將含有 Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC NO :1. 12252的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)4h，獲得培養(yǎng)液a，取培養(yǎng)液a以體積分數(shù)1%的接種量接種于新鮮 LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)3h，獲得培養(yǎng)液b，在培養(yǎng)液b中加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為O. 5mM, 37°C下培養(yǎng)4h，離心，將沉淀b加入pH7. 9的BufferA 緩沖液中，在IOKHz頻率下進行超聲裂解，離心，取上清液b進行Ni柱親和層析，洗脫液經(jīng)孔徑7KDa的透析膜透析(MWC07kDa，ThermoSCIENTIFIC)后，取截留液冷凍干燥，獲得所述Thermus脂肪酶。
進一步，所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02按如下方法制備(1)將氯化鐵和氯化亞鐵以物質的量之比3:2混合后，加水配制成混合液，在氮氣氛圍中，將混合液在30°C 下攪拌5min后，分別依次逐滴滴加質量濃度25%的氨水溶液a和聚乙二醇，滴加完畢后， 在60°C條件下繼續(xù)通入氮氣反應30min后，將反應液在53KHz下超聲分散5min，室溫下自然冷卻至25°C后進行磁分離，取沉淀c用超純水洗滌至中性后干燥，獲得Fe3O4納米顆粒； 所述水的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為4600ml/mol ;所述氨水溶液a的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為400ml/mol，所述聚乙二醇的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為200ml/mol ;所述聚乙二醇的分子量為4000 ; (2)將Fe3O4納米顆粒與無水乙醇、水和質量濃度25%的氨水溶液b混合，在53KHz 下進行超聲分散lh，然后在室溫下攪拌，同時緩慢滴加正硅酸乙酯，滴加完畢后室溫反應 12h，反應完畢后，將反應液進行磁分離，沉淀d用蒸餾水洗滌至中性，再將洗滌后的沉淀 d在lmol/L的鹽酸中室溫浸泡12h，磁分離，去除鹽酸后將沉淀e水洗至中性，干燥，獲得 Fe304/Si02復合顆粒；所述無水乙醇、水的體積用量以Fe3O4納米顆粒質量計分別為80ml/g、 20ml/g，所述的氨水溶液b體積用量以Fe3O4納米顆粒質量及為2. 5ml/g ;所述正硅酸乙酯的體積用量以Fe3O4納米顆粒質量計為1. 5ml/g ; (3)將Fe304/Si02復合顆粒加入無水乙醇中，在53KHz下超聲分散Ih后，加入質量濃度25%的氨水溶液c繼續(xù)在53KHz下超聲分散 lOmin，然后通入氮氣保護，在攪拌的條件下滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，同時在50°C反應 8h，反應結束后將反應液在室溫下自然冷卻至25°C，磁分離，沉淀用蒸餾水洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌后干燥，獲得所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02 ;所述Fe304/Si02復合顆粒與無水乙醇、氨水溶液c和3-氨丙基三乙氧基硅烷的質量體積比分別為1:60、1 :6、1 :4。
進一步,所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02與pH8. O的緩沖溶液混合配制成載體終濃度10mg/mL的混合液。進一步，所述戊二醛水溶液的體積用量以氨基化納米磁性載體Fe304/Si02質量計為 19.05ml/g。
進一步，所述Thermus脂肪酶與氨基化納米磁性載體Fe304/Si02的質量比為 O. 0925 lo
更進一步，所述的Thermus脂肪酶的固定化方法推薦按如下步驟進行將氨基化納米磁性載體Fe304/Si02與pH8. O的Tris-HCl緩沖溶液混合制成載體終濃度10mg/mL的混合液，再加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h，然后加入Thermus脂肪酶的Tris-HCl緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3. 5h，磁分離，棄去反應液，將沉淀用pH8. O的 Tris-HCl緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得所述固定化的Thermus脂肪酶；所述戊二醛水溶液的體積用量以氨基化納米磁性載體？6304/5;102質量計為19. 05ml/g ;所述Thermus脂肪酶與氨基化納米磁性載體Fe304/Si02的質量比為O. 0925 :1。
本發(fā)明所述將序列號為AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)以大腸桿菌E. ColiBL21 (DE3)為宿主細胞進行重組，獲得含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌，并于2012年6月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號CGMCC NO,1. 12252，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。
本發(fā)明所述的沉淀沉淀e均為沉淀，為便于區(qū)分不同步驟獲得的沉淀不同而命名，所述培養(yǎng)液a和培養(yǎng)液b均為培養(yǎng)液，為便于區(qū)分不同步驟獲得培養(yǎng)液不同而命名，所述氨水溶液a 氨水溶液c均為氨水溶液，為便于區(qū)分不同步驟加入的量不同而命名，字母本身沒有含義。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在(I)本發(fā)明所述固定化Thermus脂肪酶對熱有較高的耐受范圍(40-100°C )；(2)對極端pH值有較寬的適應性(4. 0-9. O) ; (3) 對金屬離子(Ba2+，Ca2+，Cu2+，F(xiàn)e3+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Na+，K+)，酶抑制劑(EDTA，2-ME，SDS, PMSF 或DTT)及去污劑(Tween20，Chaps和Triton X-100)有較強的耐受性；(4)具有極好的超順磁性，易磁分離回收，較好的操作穩(wěn)定性。

圖1Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的凝膠電泳圖圖中 15、20、25、 30、100表示蛋白質分子量標準,單位為千道爾頓(kDa), M為蛋白marker ;泳道I為純化的 His-Thermus脂肪酶融合蛋白；泳道2為未經(jīng)IPTG誘導的非重組菌株；泳道3為經(jīng)IPTG誘導的非重組菌株；泳道4為未經(jīng)IPTG誘導的重組菌株；泳道5為經(jīng)IPTG誘導后的重組菌株；泳道6為經(jīng)IPTG誘導后的重組菌株超聲破碎、離心后上清，A為含有6個組氨酸(His) 標簽的Thermus脂肪酶。
圖2嗜熱Thermus脂肪酶固定化流程 示意圖:A表示Fe3O4納米顆粒,B表示Fe3O4/ SiO2復合納米顆粒，C表示氨基化納米磁性載體Fe304/Si02, D表示Thermus脂肪酶固定到氨基化納米磁性載體Fe304/Si02表面。圖3Thermus脂肪酶固定化效果的SDS-PAGE圖，泳道M :蛋白分子量標準；泳道1:游離Thermus脂肪酶；泳道2 :固定化Thermus脂肪酶磁分離上清液；泳道3 :固定化Thermus脂肪酶微球，A為Thermus脂肪酶。
圖4固定化Thermus脂肪酶透射電鏡圖。
圖5載體和固定化Thermus脂肪酶微球的磁滯回線，實心圓點線(~#~)表示固定化Thermus脂肪酶微球,空心圓點線(~o~)表示載體。
圖6固定化Thermus脂肪酶微球的磁響應圖，實心圓點線(_*_)表示磁場組,空心圓點線(—O—)表不重力場組。
圖7固定化Thermus脂肪酶微球的磁響應照片，A表示永久磁鐵,B表示磁場組，C 表示重力場組。
圖8溫度對游離和固定化Thermus脂肪酶酶活的影響,實心圓點線(~#~)表示固定化Thermus脂肪酶,空心圓點線(~o~)表示游離Thermus脂肪酶。
圖9pH對游離和固定化Thermus脂肪酶酶活的影響，實心圓點線(_*_)表示固定化Thermus脂肪酶,空心圓點線(~0~)表示游離Thermus脂肪酶。
圖10金屬離子對游離和固定化Thermus脂肪酶酶活的的影響，實心柱體(■)表示固定化Thermus脂肪酶,空心柱體(CZ])表示游離Thermus脂肪酶。
圖11抑制劑和去污劑對游離和固定化Thermus脂肪酶酶活的影響，陰影柱體 (_ )表示固定化Thermus脂肪酶,空心柱體(EZZl)表示游離Thermus脂肪酶。
圖12固定化Thermus脂肪酶的操作穩(wěn)定性。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照規(guī)定條件如Sambrook所著的《分子克隆實驗手冊》(New York Cold Spring Harbor Laboatory Press, 2001)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明所述的室溫是指2(T25°C。
His-tag融合蛋白純化方法(Ni柱)
I) 250ml誘導菌液,離心(5000g, IOmin)取沉淀，重懸在15ml bufferA ;重懸的菌液轉移至50ml離心管,冰浴狀態(tài)下超聲波處理(50%, IOmin, 2次,打5s間歇5s)至半透明；
2)超聲處理的菌液在18000g，4°C離心20min，取上清；
3)把Ni+介質用Mil1-Q水洗兩次，再用Buffer A平衡，然后加入上清，4° C輕搖 Ih,上柱(留樣20 μ I用于SDS-PAGE分析)，收集的流出液再重復上柱兩次；
4)用20ml Buffer B洗漆介質，共4 5次；
5)用20ml Buffer C洗漆介質，共4 5次；
6)加入O. 5ml Buffer D,當液體流盡后關閉流液口，然后加入O. 5mlBuffer D浸泡5min，打開流液口收集洗脫液，再重復洗脫4次，共收集5管洗脫樣品；
7)洗脫液置于 IOcm 長的透析袋(MWC07kDa, ThermoSCIENTIFIC)中，在 IL miI1-Q 水中，200rpm磁力攪拌下透析Ih后換mil1-Q水，重復6次。
8)透析后轉移到50mL離心管中，于-80°C預冷Ih后，用真空冷凍干燥機 (7670530, LABC0NC0)在 _40°C抽干。
LB液體培養(yǎng)基終質量濃度組成為蛋白胨1%，酵母膏O. 5%，NaClO. 5%，溶劑為水。
實施例1. Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的制備
Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)源于深海熱液口分離的嗜熱菌 (Thermus thermophilus WL)。Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)基因長度為 486bp,含一個編碼161個氨基酸的閱讀框(Genbank序列注冊號AAS81965.1)。
當用大腸桿菌E.Coli BL21(DE3)為宿主細胞時，得到含Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏菌[Escherichia coli BL21 (DE3)],該菌株已于2012年6月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No :1. 12252。
所述Thermus脂肪酶的制備方法為
(I)游離Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的制備挑取上述含有 Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏菌單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基(含Kan50 μ g/ml )，37°C 搖培過夜，獲得培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液以體積分數(shù)1%的接種量接種至250ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，再在37°C搖床培養(yǎng)3h后(0D_約0. 6)，獲得培養(yǎng)液，取0.1ml培養(yǎng)液在凝膠電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)上進行凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，結果見圖1中的泳道 4所示；剩余培養(yǎng)液中加入異丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度0. 5mM,37°C 誘導培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)液離心，去上清，取15 μ g沉淀進行凝膠電泳(SDS-PAGE) 分析，結果見圖1中的泳道5所示，將沉淀用20ml的Buffer A(pH7. 9)重懸，IOKHz下超聲 (VCX500，SONICS)裂解菌體20min，離心去沉淀，上清中的重組蛋白Thermus脂肪酶用Ni柱進行親和純化，獲得游離Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL),并進行凝膠電泳分析，結果見圖1中的泳道I所示。
(2)非重組菌株的培養(yǎng)
挑取非重組菌株，即大腸桿菌E.Coli BL21(DE3)于5ml LB液體培養(yǎng)基(含 Kan50l·! g/ml)，37°C搖培過夜，獲得培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液以體積分數(shù)1%的接種量接種至5ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，再在37 °C搖床培養(yǎng)3h后(0D600約O. 6)，取O.1ml培養(yǎng)液在凝膠電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)上進行凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，結果見圖1中的泳道2所示，剩余培養(yǎng)液中加入異丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度 O. 5mM, 37°C誘導培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)液離心，去上清，取15 μ g沉淀進行凝膠電泳 (SDS-PAGE)分析，結果見圖1中的泳道3所示。
實施例2.載體制備及Thermus脂肪酶固定化
(I)高性能磁性納米球(即Fe3O4納米顆粒)的制備
Fe3O4納米顆粒采用改進的化學共沉淀法制備，反應式為
Fe2++2Fe3++80H- — Fe304+4H20
具體過程分別稱取4. 054g FeCl3 ·6Η20 和1. 988g FeCl2 ·4Η20(考慮 Fe2+ 在制備及后續(xù)過程中的氧化作用，選定Fe3YFe2+物質的量比為3/2)置于50mL燒杯中，加入25mL 雙蒸水溶解后再加入90mL雙蒸水混合配成115mL混合溶液，將混合溶液加入500mL三頸瓶中，通入氮氣，在水浴30°C下機械攪拌(轉速IOOOrpm) 5min后,用注射器(直徑O. 7mm)先后逐滴加入質量濃度25%NH3 -H2OlOmL和PEG (分子量4000) 5mL,將水浴溫度升至60°C，繼續(xù)攪拌并通N2, 30min后將反應液倒入150mL燒杯中，53KHz下超聲(SK30GT，上?？茖С晝x器有限公司)分散5min，室溫下自然冷卻至25°C (約Ih)后，磁分離(即用永久磁鐵吸附)，棄去上清液，將沉淀分別用Mil1-Q水反復洗滌至pH值為7. 0，得磁流體，-40°C真空烘干24h， 獲得Fe3O4納米顆粒，備用。
(2)Fe304/Si02復合顆粒的制備
稱取2g上述Fe3O4納米顆粒于250ml的三口瓶中，加入160ml無水乙醇，40ml水和5ml質量濃度25%的氨水溶液，53KHz下超聲波分散I小時后，室溫下機械攪拌(轉速為 IOOOrpm),同時以1. 5ml/min的速度緩慢滴加3. Oml正硅酸乙酯(TEOS)，滴加完畢后室溫反應12小時，將反應液用永久磁體進行磁分離，取沉淀用蒸餾水反復洗至中性，同時洗滌液不會變渾濁，然后將洗滌后的沉淀中加入lmol/L的鹽酸水溶液15ml，室溫浸泡12小時，磁分離后，將沉淀再用蒸餾水洗至中性，于室溫下真空干燥24小時，即得Fe304/Si02復合顆粒 3g。
(3)高性能磁性高分子納米球(即氨基化納米磁性載體Fe304/Si02)制備
3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)對Fe3O4納米顆粒的化學改性是通過硅烷的乙氧基水解后形成的硅羥基與Fe304/Si02復合顆粒表面的硅羥基縮合而完成。具體實驗步驟如下稱取Ig上述制備的Fe304/Si02復合顆粒于裝有60ml無水乙醇的三口瓶中，53KHz 下超聲波(SK30GT，上?？茖С晝x器有限公司)分散I小時后，加入6ml質量濃度25% 的NH3 · H2O,再用超聲波在53KHz分散lOmin，然后通氮氣保護，在勻速機械攪拌(轉速為 IOOOrpm)下滴加4ml3_氨丙基三乙氧基硅烷，同時水浴升溫至50°C并保持8小時，反應結束后將反應液在室溫下自然冷卻至25°C，用永久磁體進行磁分離，取沉淀用蒸餾水反復洗至中性，再用乙醇洗滌:Γ5次至液面無白色漂浮物，以除去產(chǎn)物中未反應的硅烷，最后將產(chǎn)物于室溫下真空干燥24小時，即得氨基化納米磁性載體Fe3CVSiO2L 2g。
(4)Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)固定化
由于Fe304/Si02復合顆粒經(jīng)過APTES的化學改性，其表面富含氨基，故本實驗以戊二醛等為雙功能試劑，將Thermus脂肪酶負載到Fe304/Si02_APTES載體上(見圖2)。
將O. 20g 的氨基化納米磁性載體 Fe304/Si02 置于 20ml 的 Tris-HCl (IOOmM, pH8. O) 中，加入3. 81ml的質量濃度25%戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h后，直接再加入含有 18. 5mg實施例1方法獲得的Thermus脂肪酶的Tris-HCl (IOOmM, pH8. 0) 2. 0ml，室溫下磁力攪拌3. 5h后，磁分離，取沉淀用上述Tris-HCl緩沖液洗滌3飛次，將洗滌后的沉淀在_40°C 冷凍干燥24h,獲得固定化Thermus脂肪酶，固定化流程見圖2所示。
實施例3.固定化Thermus脂肪酶酶活測定
脂肪酶酶活的測定以對硝基苯酹月桂酸酯(C12, p-nitrophenyl laurate)作為底物進行測定，參見(Sigurgislad0ttir S, Konraosdottir M, Jonsson A, Kristjansson J, Matthiasson E. Lipase activity of thermophilic bacteria from Icelandic hot springs. Biotechnol Lett. 1993, 15:361-366.)，具體操作如下
I)配制C12溶液將一定量C12溶于無水乙醇中配制成25mM的C12乙醇溶液，避光保存(最好現(xiàn)配現(xiàn)用)。
2)配制稀釋酶液試樣將實施例2方法獲得的固定化Thermus脂肪酶用50mM Tris-HCl緩沖液(pH8. O )稀釋為80mg/L的酶液。將氯化鈣用50mM Tris-HCl緩沖液 (pH8. O)配制成終濃度40mM的氯化鈣緩沖液，將所述酶液與氯化鈣緩沖液及步驟I)配制的 C12乙醇溶液以體積比1:1. 8:0. 2混合制成待測試樣液，以50mM Tris-HCl緩沖液(pH8. O) 代替酶液與氯化鈣緩沖液及步驟I)配制的C12乙醇溶液混合制成對照液。
3)吸取150 μ L步驟2)配制的待測試樣液(即90 μ L緩沖液，50 μ L酶液，10 μ L C12乙醇溶液的混合液)加到一個1. 5ml的離心管(Eppendorf,德國)中，混勻后65°C 水浴20min,然后置于冰上I分鐘，IOOOrpm離心I分鐘，取上清液在T6新世紀紫外-可見分光光度計405nm波長下測定其吸光值A4tl5，該值指示PNP酯分解后釋放出來的游離 p-nitrophenyl (PNP)的量，以不加酶液的對照液作為參照，一單位酶活定義為每分鐘釋放I μ M對硝基苯酚所需要的脂肪酶的量，獲得實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶的酶活為10354U/g。以同樣的方法對實施例1制備的游離Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的酶活為 26000U/g。
實施例4.固定化Thermus脂肪酶理化特性表征
(I)固定化Thermus脂肪酶的固定效果檢測
將實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶顆粒用40 μ LTris-HCl緩沖液 (65mM,pH8. O)重懸，加4X蛋白上樣緩沖液13. 3 μ L，沸水煮15min，12000rpm離心5min，取 10 μ L上清液進行SDS-PAGE，結果見圖3中的泳道2所示，同時以實施例1方法制備的游離 Thermus脂肪酶及實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶顆粒在同樣條件 下直接進行 SDS-PAGE，結果分別見圖3中的泳道I和泳道3所示。
圖3結果表明，通過磁分離，相對于游離Thermus脂肪酶(泳道3所示)而言， Thermus脂肪酶固定化微球(泳道I所示)可得到明顯條帶(18kDa,如圖3中箭頭A所示)。而磁分離上清液(泳道2所示)中則檢測不到相應條帶?？梢?，Thermus脂肪酶確實已固定于經(jīng)3-APTES修飾的Fe3O4OSiO2納米顆粒表面。
(2)固定化Thermus脂肪酶透射電鏡分析(TEM)
取少量實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶分散于Mil1-Q水中，通過磁分離水洗三次后，在53KHz下超聲分散5min后，取10 μ L分散液滴到銅網(wǎng)(230目碳支持膜， 北京中鏡科儀技術有限公司)上，平放風干后在透射電鏡(JEM-1200EX，NEC, Tokyo, Japan) 上進行分析，結果見圖4所示，取其中100個顆粒，平均粒徑18. 4±2. 4nm。
(3)震動樣品磁強計(VSM)分析
取一端帶棉塞、另一端熱封的塑料管(內直徑為2mm，材質是塑料)，將實施例2方法制備的冷凍干燥后的固定化Thermus脂肪酶微球至于其內并壓實后另一端用棉花塞住， 最終樣品管長應為6. 5 7mm，裝樣前后差重得樣品重量為l(Tl5mg。將樣品管置于振動樣品磁強計(VSM) (LakeShore7410VSM, Lakeshore Cryotronics, USA)中，以實施例 2 方法制備的氨基化納米磁性載體Fe304/Si02在同樣條件下進行檢測作為對照，測定載體和固定化 Thermus脂肪酶的磁滯回線，結果見圖5所示。
由圖5可以看出載體和固定化Thermus脂肪酶的磁滯回線均無頑磁和剩磁,表明所得氨基化納米磁性載體Fe304/Si02和固定化Thermus脂肪酶都具備超順磁性。同時，其飽和磁化強度分別為67. 6和52. 3emu/g?？梢姡潭ɑ箫柡痛呕瘡姸嚷杂邢陆?，這可能是固定化Thermus脂肪酶將載體包裹,影響了載體的磁性。
(4)固定化Thermus脂肪酶的磁響應性
固定化Thermus脂肪酶的磁響應性是采用紫外-可見分光光度計(T6-新世紀,北京普析通用儀器有限責任公司)在光的波長為600nm處，以測定質量濃度4% (w/w)的固定化Thermus脂肪酶微球的水懸浮液分別在磁場和重力作用下的透光率與時間的關系來評價。
將實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶微球用水配制成質量濃度4%的水懸浮液作為樣品液，將樣品液分成兩組(磁場組和重力場組)，將磁場組的樣品液置于體積 3. 5mL,光徑Icm的比色皿中,在磁場(磁場強度約為200高斯)下測試600nm波長處透光率, 以時間為橫坐標，以透光率為縱坐標，表示固定化Thermus脂肪酶微球在磁場條件下的磁響應性，結果見圖6所示和圖7中的A，B所示。
將重力場組的樣品液置于體積3. 5mL，光徑Icm的比色皿中，在遠離磁場僅自然重力場條件下測試600nm波長處透光率，以時間為橫坐標，以透光率為縱坐標，表示固定化 Thermus脂肪酶微球在磁場條件下的磁響應性,見圖6所示和圖7中的C所示。
圖6表明，固定化Thermus脂肪酶在只有重力沒有磁場存在時,靜置60分鐘后， 其透光率變化約45%(如圖6)，說明固定化Thermus脂肪酶在水中分散良好，具有很高的穩(wěn)定性，且粒徑較小，不易沉淀。而將固定化Thermus脂肪酶置于磁場下，僅10分鐘左右，透光率就達到90%，基本上將固定化Thermus脂肪酶從溶液中分離(如圖6所示)，說明固定化Thermus脂肪酶在外加磁場下具有優(yōu)越的磁響應性,能夠被快速磁化并分離。固定化 Thermus脂肪酶的這種性能有利于用于生物分子的固定化及催化反應。
實施例5固定化Thermus脂肪酶的性質鑒定
(I)溫度對固定化Thermus脂肪酶酶活的影響
將實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶分成7組(組I為40°C，組2為50°C，組3為60°C，組4為70°C，組5為80°C，組6為90°C，組7為100°C)，分別將各組固定化Thermus脂肪酶在各自溫度的水中、pH為8. 0的條件下溫育30min,取出后置于冰上5分鐘，然后根據(jù)實施例3進行酶活測定，同時以實施例1方法制備的游離Thermus脂肪酶在同樣條件下測定的酶活作為對照，結果見圖8所示。圖8表明，65°C為游離Thermus脂肪酶的最佳反應溫度,而70°C為固定化Thermus脂肪酶的最佳反應溫度，且固定化后，酶對溫度耐受性更好。(2) pH值對固定化Thermus脂肪酶酶活的影響將實施例2方法制備的固定化 Thermus脂肪酶分成7組(組f組7的pH值分別為3、4、5、6、7、8、9 )，分別將各組固定化Thermus脂肪酶在各自的pH的緩沖液中，70 V溫育30min，根據(jù)實施例3進行酶活測定，同時以實施例1方法制備的游離Thermus脂肪酶在同樣條件下的酶活作為對照，結果見圖9所示。圖9結果顯示，固定化Thermus脂肪酶在pH4. 0-9. 0都維持80%以上活性；而游離Thermus脂肪酶在pH5. 0-9. 0僅能維持在70%以上活性。pH3. 0時，固定化Thermus脂肪酶比游離Thermus脂肪酶活性提高約50%?？梢姽潭ɑ?Thermus脂肪酶pH耐受性能更好。(3)金屬離子對固定化Thermus脂肪酶酶活的的影響將實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶分成10組(組I為不加金屬離子，組2 組10的金屬離子分別為Ba2+，Ca2+，Cu2+，F(xiàn)e3+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Na+，K+)，分別將各組固定化Thermus脂肪酶根據(jù)實施例3進行酶活測定，其中實施例3步驟3)中，吸取150 y L步驟2)配制的待測試樣液(即90 ii L緩沖液，50 u L酶液，10 u LC12乙醇溶液的混合液)加到一個1. 5ml的離心管(Eppendorf，德國)中，然后分別吸取各組相應的金屬離子鹽的水溶液(2M)1. 52 u L，使其終濃度為20mM，混勻后65°C水浴20min，然后置于冰上I分鐘，IOOOrpm離心I分鐘，取上清液在T6新世紀紫外-可見分光光度計405nm波長下測定其吸光值A4tl5,根據(jù)實施例3計算酶活，同時以實施例1方法制備的游離Thermus脂肪酶在同樣條件下的酶活作為對照，結果見圖10所示。圖10結果表明，除Fe3+夕卜，20mM的各金屬對固定化Thermus脂肪酶酶活促進比游離酶稍大，分別增強281. 4-513. 4%和230. 8-428. 4%。其中20mM的Cu2+對酶活促進明顯。Fe3+由于在測定波長405納米附近吸收，嚴重干擾測定。(4)抑制劑及去垢劑對固定化Thermus脂肪酶酶活的的影響將實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶分成9組(組I為不加抑制劑或去垢齊U，組疒組9的抑制劑或去垢劑分別為EDTA (乙二胺四乙酸二鈉鹽)、2-ME(P -巰基乙醇)、SDS (十二烷基磺酸鈉)、PMSF (苯甲基磺酰氟)、DTT ( 二硫蘇糖醇)、TWeen20 (吐溫-20)、Triton X-100 (曲拉通X-100)和CHAPS (3-[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸))，分別將各組固定化Thermus脂肪酶根據(jù)實施例3進行酶活測定，其中實施例3步驟3)中，吸取150 ii L步驟2)配制的待測試樣液(即90 ii L緩沖液，50 ii L酶液，IOii L C12乙醇溶液的混合液)加到一個1. 5ml的離心管(Eppendorf,德國)中,然后分別吸取各組相應的試劑,使抑制劑(EDTA、2-ME、SDS、PMSF 和 DIT)的終濃度為 ImM，去污劑(Tween20、CHAPS 和 TritonX-100)的質量終濃度為0. 1% (Tween20和Triton X-100體積終濃度為0. 1%，CHAPS質量終濃度0. 1%)，混勻后65°C水浴20min，然后置于冰上I分鐘，IOOOrpm離心I分鐘，取上清液在T6新世紀紫外-可見分光光度計405nm波長下測定其吸光值A4tl5,根據(jù)實施例3計算酶活，同時以實施例1方法制備的游離Thermus脂肪酶在同樣條件下的酶活作為對照，結果見圖11所示。圖11結果顯示，EDTA、2-ME、PMSF和DTT對游離Thermus脂肪酶酶活均有抑制效果，對固定化Thermus脂肪酶酶活均無抑制效果。SDS,Tween20和Triton X-100對游離和固定化Thermus脂肪酶酶均有明顯的促進效果。而CHAPS對游離和固定化Thermus脂肪酶酶均有強烈的抑制效果。(5)固定化Thermus脂肪酶操作穩(wěn)定性將實施例2方法制備的固定化Thermus脂肪酶根據(jù)實施例3進行酶活測定，測定結束后，通過用永久磁鐵吸附分離固定化Thermus脂肪酶,經(jīng)lmLpH8. 0的Tris-HCl緩沖液清洗后投入再次使用。重復進行10次，結果見圖12所示。
從圖12可見，重復使用10次，酶活仍可保持在80%以上。
權利要求
1.ー種Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述方法為將氨基化納米磁性載體Fe3CVSiO2與pH8. O的緩沖溶液混合，加入質量濃度25%的戊ニ醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h,再加入以所述Tris-HCl緩沖溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilusWL)的緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3. 5h，磁分離，棄去上清液a，將沉淀a用緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法獲得將序列號為AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大腸埃希氏桿菌為宿主細胞進行重組，獲得含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC NO :1. 12252 ;將含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC NO :1. 12252的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)4h，獲得培養(yǎng)液a，取培養(yǎng)液a以體積分數(shù)1%的接種量接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)3h，獲得培養(yǎng)液b，在培養(yǎng)液b中加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為O. 5mM，37°C下培養(yǎng)4h，離心，將沉淀b加入pH7. 9的Buffer A緩沖液中，在IOKHz頻率下進行超聲裂解，離心，取上清液b進行Ni柱親和層析，洗脫液經(jīng)透析后，取截留液冷凍干燥，獲得所述Thermus脂肪酶。
2.如權利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02按如下方法制備(1)將氯化鐵和氯化亞鐵以物質的量之比3:2混合后，加水配制成混合液，在氮氣氛圍中，將混合液在30°C下攪拌5min后，依次逐滴滴加質量濃度25%的氨水溶液a和聚こニ醇，滴加完畢后，在60°C條件下繼續(xù)通入氮氣反應30min后，將反應液在53KHz下超聲分散5min，室溫下自然冷卻至25°C后進行磁分離，取沉淀c用超純水洗滌至中性后干燥，獲得Fe3O4納米顆粒；所述水的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為4600ml/mol ;所述氨水溶液a的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為400ml/moI，所述聚こニ醇的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為200ml/mol ;所述聚こニ醇的分子量為4000 ; (2)將Fe3O4納米顆粒與無水こ醇、水和質量濃度25%的氨水溶液b混合，在53KHz下進行超聲分散lh，然后在室溫下攪拌，同時緩慢滴加正硅酸こ酷，滴加完畢后室溫反應12h，反應完畢后，將反應液進行磁分離，沉淀d用蒸餾水洗滌至中性，再將洗滌后的沉淀d在lmol/L的鹽酸中室溫浸泡12h，磁分離，去除鹽酸后將沉淀e水洗至中性，干燥，獲得Fe304/Si02復合顆粒；所述無水こ醇、水的體積用量以Fe3O4納米顆粒質量計分別為80ml/g、20ml/g,所述的氨水溶液b體積用量以Fe3O4納米顆粒質量計為2. 5ml/g ;所述正硅酸こ酯的體積用量以Fe3O4納米顆粒質量計為1. 5ml/g ; (3)將Fe304/Si02復合顆粒加入無水こ醇中，在53KHz下超聲分散Ih后，加入質量濃度25%的氨水溶液c繼續(xù)在53KHz下超聲分散lOmin，然后通入氮氣保護，在攪拌的條件下滴加3-氨丙基三こ氧基硅烷，同時在50°C反應8h，反應結束后將反應液在室溫下自然冷卻至25°C，磁分離，沉淀用蒸餾水洗滌至中性，再用無水こ醇洗滌后干燥，獲得所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02 ;所述Fe304/Si02復合顆粒與無水こ醇、氨水溶液c和3_氨丙基三こ氧基硅烷的質量體積比分別為1:60、1 :6、1 :4。
3.如權利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法,其特征在于所述氨基化納米磁性載體Fe3CVSiO2與pH8. O的緩沖溶液混合配制成載體終濃度10mg/mL的混合液。
4.如權利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述戊ニ醛水溶液的體積用量以氨基化納米磁性載體Fe304/Si02質量計為19. 05ml/g。
5.如權利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法,其特征在于所述Thermus脂肪酶與氨基化納米磁性載體Fe304/Si02的質量比為O. 0925 :1。
6.如權利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述固定化方法按如下步驟進行將氨基化納米磁性載體Fe304/Si02與pH8. O的Tris-HCl緩沖溶液混合制成載體終濃度10mg/mL的混合液，再加入質量濃度25%的戊ニ醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h，然后加入Thermus脂肪酶的Tris-HCl緩沖溶液,室溫下磁力攪拌3. 5h,磁分離，棄去反應液，將沉淀用PH8. O的Tris-HCl緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得所述固定化的Thermus脂肪酶；所述戊ニ醛水溶液的體積用量以氨基化納米磁性載體Fe304/Si02質量計為19. 05ml/g ；所述Thermus脂肪酶與氨基化納米磁性載體Fe304/Si02的質量比為O. 0925 :1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Thermus脂肪酶的固定化方法將氨基化納米磁性載體Fe3O4/SiO2與pH8.0的緩沖溶液混合，加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h，再加入以所述Tris-HCl緩沖溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3.5h，磁分離，棄去上清液a，將沉淀a用緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得固定化的Thermus脂肪酶；本發(fā)明所述固定化Thermus脂肪酶耐熱范圍40-100℃，pH值適應范圍4.0-9.0，對金屬離子，酶抑制劑及去污劑有較強的耐受性；具有極好的超順磁性，易磁分離回收，較好的操作穩(wěn)定性。
文檔編號C12N11/14GK102994491SQ20121024146
公開日2013年3月27日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權日2012年7月12日
發(fā)明者章曉波, 宋崇富 申請人:浙江大學