一種隱睪特異性生精細(xì)胞模型的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，涉及隱睪特異性生精細(xì)胞模型的制備方法。本發(fā)明公開了一種隱睪特異性生精細(xì)胞模型的制備方法，包括下列步驟：收集隱睪患者新鮮尿液，離心沉淀種子細(xì)胞；細(xì)胞加入種子細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)；iPS細(xì)胞的建立和鑒定；iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為生精細(xì)胞。本發(fā)明方法具有以下突出優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)：一，所選種子細(xì)胞為來源于尿液的細(xì)胞，其取材方式完全無創(chuàng)，易于被患兒接受，對于研究兒科疾病尤為重要；二，從尿源性細(xì)胞得到的iPS細(xì)胞通過各種鑒定，證實(shí)其具有和ES細(xì)胞類似的特性，可體外誘導(dǎo)分化為生精細(xì)胞，為研究隱睪發(fā)病的分子機(jī)制和藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)平臺。
【專利說明】一種隱睪特異性生精細(xì)胞模型的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，涉及隱睪特異性生精細(xì)胞模型的制備方法。
【背景技術(shù)】[0002]睪丸是男性主要性器官，其功能是產(chǎn)生精子，精子與卵子結(jié)合，形成新的個體。隱睪是指男嬰出生后單側(cè)或雙側(cè)睪丸末降至陰囊而停留在其正常下降通路之任何一處，是最常見的男性生殖器先天性畸形之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，其分子生物學(xué)機(jī)制至今尚未明確。隱睪患者常見的并發(fā)癥之一是成年后生育功能異常。雙側(cè)睪丸未降者如果未進(jìn)行早期干預(yù)，大多數(shù)成年后都會引起男性不育；但即便對隱睪患兒進(jìn)行了早期干預(yù)如雙側(cè)睪丸固定術(shù)后，仍有約19%的病例成年后發(fā)生不育，提示在此病理過程中除了陰囊提供的適宜的微環(huán)境因素之外，單獨(dú)的早期睪丸固定術(shù)不足以完全恢復(fù)隱睪患兒睪丸的生精功能，其病理過程還涉及其他的在生精過程中發(fā)揮作用的分子和遺傳學(xué)因素，而針對這些分子和遺傳學(xué)因素進(jìn)行研究并尋找合適的治療靶點(diǎn)是探索治療隱睪性不育的重要途徑。
[0003]研究對象的局限性往往限制了研究的進(jìn)展。由于倫理的限制和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的制約，以上這些發(fā)育早期和生殖相關(guān)的基因研究很難在人體上進(jìn)行。細(xì)胞生物學(xué)的飛速發(fā)展有望克服這個領(lǐng)域的研究對象的局限性，為之提供理想的細(xì)胞模型。2007年，具有胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells, ES細(xì)胞)樣特性的可誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(induced pluripotentstem cells, iPS細(xì)胞)的出現(xiàn)，利用相應(yīng)的疾病特異性的細(xì)胞模型研究該疾病發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制及其干預(yù)措施，具有研究周期短、細(xì)胞易于培養(yǎng)和擴(kuò)增、細(xì)胞水平上易于進(jìn)行基因干擾或過表達(dá)以研究該基因的功能等優(yōu)勢，正成為研究者手中的有力工具。ES細(xì)胞具有2個特性:自我更新和多向分化潛能，在相應(yīng)條件下具有分化成機(jī)體三個胚層各種細(xì)胞的潛能，自建系以來除了為再生醫(yī)學(xué)提供種子細(xì)胞，利用其體外的分化過程模擬人類胚胎早期發(fā)育并對其進(jìn)行研究也一直受到關(guān)注。在ES研究的基礎(chǔ)上，通過向體細(xì)胞中導(dǎo)入0CT4、S0X2、KLF4、CMYC4個轉(zhuǎn)錄因子，體細(xì)胞可被重編程為iPS細(xì)胞，其特征類似于ES細(xì)胞。人的iPS細(xì)胞的成功誘導(dǎo)后，建立攜帶有人類疾病的遺傳背景的疾病特異性的iPS細(xì)胞系作為研究該疾病的細(xì)胞模型，引起了生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，是研究相應(yīng)疾病的分子機(jī)制和治療方法的重要工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為提供一種隱睪特異性細(xì)胞模型的制備方法。
[0005]為此，本發(fā)明提供了一種隱睪特異性生精細(xì)胞模型的制備方法，包括下列步驟:
[0006]a)收集隱睪患者新鮮尿液，離心沉淀種子細(xì)胞；
[0007]b)細(xì)胞加入種子細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)；
[0008]c) iPS細(xì)胞的建立和鑒定；
[0009]d) iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為生精細(xì)胞。
[0010]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述種子細(xì)胞培養(yǎng)液為[0011]A.Keratinocyte-SFM + supplement (BPE20ng/ml, EGFlOng/ml)+l%L-glutamine+l%P/S
[0012]B.330ml DMEM (H-G) +11Oml F-12nutr i ent mixure + 50ml FBS + 5mlL-glutamine+5ml P/S+Hydrocortisone(0.4ug/ml)+EGF(lOug/ml)
[0013]上述A和B兩種培養(yǎng)液，以體積比2:1混合即為最終培養(yǎng)液。
[0014]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述iPS細(xì)胞的建立為通過將0CT4、S0X2、KLF4、CMYC4個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入種子細(xì)胞，接種在輻照后的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，每天更換人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，將出現(xiàn)的集落樣生長的細(xì)胞用機(jī)械法挑出克隆，所述人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/F12+20%KSR+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺 +4ng/ml bFGF。
[0015]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為生精細(xì)胞步驟為基礎(chǔ)誘導(dǎo)液為DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加IMm L-Glutamine，第一階段誘導(dǎo)因子為BMP4，其作用濃度為100ng/ml，作用時間為I周；第二階段誘導(dǎo)因子為FGF9，其作用濃度為50ng/ml，作用時間為2周；第三階段誘導(dǎo)因子為RA，其作用濃度為lUm，作用時間為I周。
[0016]本發(fā)明方法具有以下突出優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn):一，所選種子細(xì)胞為來源于尿液的細(xì)胞，其取材方式完全無創(chuàng)，易于被患兒接受，對于研究兒科疾病尤為重要；二，從尿源性細(xì)胞得到的iPS細(xì)胞通過各種鑒定，證實(shí)其具有和ES細(xì)胞類似的特性，可體外誘導(dǎo)分化為生精細(xì)胞，為研究隱睪發(fā)病的分子機(jī)制和藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)平臺。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1隱睪特異性iPS細(xì)胞表達(dá)ES細(xì)胞特異性的蛋白。
[0018]圖2隱睪特異性iPS細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)ES細(xì)胞特異性基因。
[0019]圖3隱睪特異性iPS細(xì)胞和種子細(xì)胞具有相同的STR位點(diǎn)和正常核型。
[0020]圖4隱睪特異性iPS細(xì)胞畸胎瘤實(shí)驗(yàn)。
[0021]圖5細(xì)胞VASA染色。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為進(jìn)一步詳細(xì)描述在本發(fā)明的實(shí)踐中所使用的常規(guī)技術(shù)，實(shí)踐者可參看有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)、組織結(jié)構(gòu)學(xué)以及胚胎學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)的教科書及評論。包括Teratocarcinomasand embryonic stem cell: A practical approach[E.J.Robertson 編，IRL 出版有限公司，1987] ；Guide to techniques in Mouse Development[P.M.Wasserman 等編，學(xué)術(shù)出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro[Μ.V.Wiles, Meth.Enzymol.225:900, 1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy[P.D.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10:31，1998]。
[0023]細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、和抗體技術(shù)可以在“蛋白科學(xué)中的當(dāng)前方案” [J.E.Colligan等編輯，Wiley & Sons]、“細(xì)胞生物學(xué)中的當(dāng)前方案” [J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons]和“兔疫學(xué)功時當(dāng)亦方案” [J.Ε.Colligan等編輯，Wiley & Sons]中找到。與本發(fā)明相關(guān)的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如BioRad、Stratagene> InvitrogeruClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。[0024]細(xì)胞培養(yǎng)方法通常在“動物細(xì)胞培養(yǎng):基本技術(shù)手冊”最新版本(R.1.Freshney編輯，Wiley & Sons)細(xì)胞培養(yǎng)一般技術(shù)”(Μ.Α.Harrison和1.F.Rae,劍橋大學(xué)出版);和“胚胎干細(xì)胞:方法和操作規(guī)定” (K.Turksen編輯，Humana出版)中有描述。組織培養(yǎng)基和試劑可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma ChemicalC0.、以及 ICN Biomedicals。
[0025]對本發(fā)明使用的培養(yǎng)基的類型沒有限制，只要可用于相應(yīng)類型細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可。在這類培養(yǎng)基中CO2的濃度優(yōu)選是5%，但本發(fā)明不限于此。 [0026]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0027]實(shí)施例1
[0028]實(shí)驗(yàn)方案:
[0029]1.從尿液中獲取種子細(xì)胞
[0030]I)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過、患兒家長簽署知情同意書后，取隱睪患兒尿液100-200ml進(jìn)行原代培養(yǎng)。飲水后收集200-300ml清潔中斷尿液，超凈臺內(nèi)平均分裝至若干50ml離心管內(nèi)，室溫，1000rpm離心5min，棄上清，用24ml培養(yǎng)液重懸所有離心管內(nèi)細(xì)胞，平均種植于24孔板內(nèi)，Iml細(xì)胞懸液/孔，靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)，于第3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，Iml/孔，于第5天更換新鮮培養(yǎng)液，約7-10天后會有細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞呈現(xiàn)短梭形，起初呈簇狀生長，待細(xì)胞融合至70-80%左右，持續(xù)傳代，細(xì)胞形態(tài)均一，常規(guī)凍存
[0031]2)培養(yǎng)液成分
[0032]A.Keratinocyte-SFM + supplement (BPE20ng/ml, EGFlOng/ml)+l%L-glutamine+l%P/S
[0033]B.330ml DMEM (H-G) +110ml F-12nutr i ent mi xur e + 50ml FBS + 5mlL-glutamine+5ml P/S+Hydrocortisone(0.4ug/ml)+EGF(lOug/ml)
[0034]上述I和2兩種2:1混合即為最終培養(yǎng)液，此種培養(yǎng)液配方得到的種子細(xì)胞的生長狀態(tài)最佳。
[0035]2.基因突變檢測
[0036]I)抽提基因組DNA，按照商品化試劑盒的說明書進(jìn)行，大致經(jīng)過為:貼壁細(xì)胞用胰酶消化，離心收集，細(xì)胞重懸于冰冷的PBS漂洗一次，離心收集，加入5mlDNA提取緩沖液，(IOmmoI/LTris-cI，0.lmol/LEDTA, 0.5%SDS)，混勻后加入 25ul 蛋白酶 K，使終濃度達(dá)到100ug/ml，混勻，50°C水浴3h,用等體積的酹抽提一次,2500rpm離心收集水相,用等體積的(酚，氯仿，異戊醇)混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相，再用等體積的氯仿，異戊酉享抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL,混勻，冰浴，IOmin.。2500rpm離心IOmin.轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫IOmin后2500rpm,離心lOmin。棄上清，加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積_20°C預(yù)冷無水乙醇。_20°C 20min。12000r/min,室溫離心5min。棄上清。將DNA溶于適量TE中。
[0037]2)針對隱睪常見的突變基因INSL3，ZNF214, ZNF215設(shè)計其各個外顯子的引物，由上海生工合成引物；
[0038]3)基因PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送測序。測序結(jié)果和NCBI網(wǎng)站的基因序列進(jìn)行比對。
[0039]3.隱睪患兒特異性iPS細(xì)胞系的建立和鑒定
[0040]I)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝:培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):將質(zhì)粒 pMX_h0ct4、pMX_hSox2、pMX-hc-Myc、pMX_hKlf4 (購自 Addgene 公司)以 FUGENE6 (購自羅氏公司)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時后收集含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清，0.45 μ m濾器過濾。 [0041]2)病毒感染尿源性細(xì)胞:將以上步驟中得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染人尿源性細(xì)胞，感染48小時后換入新的人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液，4小時后將細(xì)胞用0.05%的胰酶消化成單細(xì)胞，重新接種于絲裂霉素C處理后的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，在人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察及換液。
[0042]3) iPS細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增:選取多個邊界清楚、細(xì)胞排列緊密、較高核質(zhì)比的類似人胚胎干細(xì)胞的克隆在倒置相差顯微鏡下用機(jī)械法挑至新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，分別按照常規(guī)的人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，早期進(jìn)行機(jī)械法傳代、擴(kuò)增，十代后方可進(jìn)行酶消化法傳代。
[0043]4)堿性磷酸酶染色--從Chemicon公司購買堿性磷酸酶的檢測試劑盒，按照使用說明對誘導(dǎo)得到的iPS細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)的堿性磷酸酶染色鑒定及拍照。
[0044]5) RT-PCR檢測內(nèi)源和外源基因的表達(dá):分別設(shè)計并合成人胚胎干細(xì)胞內(nèi)源性的特異性表達(dá)的基因的檢測引物、針對外源轉(zhuǎn)入基因的檢測引物，按照常規(guī)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)程序?qū)PS細(xì)胞的表達(dá)基因進(jìn)行檢測。結(jié)果:隱睪特異性iPS細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)ES細(xì)胞特異性基因如0CT4、S0X2、NANOG、FGF4等；對該細(xì)胞系0CT4基因啟動子區(qū)域的CpG島甲基化水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該區(qū)域是高度去甲基化的，和人ES細(xì)胞類似，不同于其種子細(xì)胞(圖2)。
[0045]6)免疫染色鑒定:通過商業(yè)途徑購買人胚胎干細(xì)胞特異性的檢測抗體如Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等對iPS細(xì)胞進(jìn)行免疫染色鑒定，激光顯微鏡拍照分析。結(jié)果:細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果證實(shí)本培養(yǎng)體系中建立的隱睪特異性iPS細(xì)胞表達(dá)人ES細(xì)胞標(biāo)志性基因:0CT4、S0X2、NAN0G、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-81、TRA-l-60 (圖1)
[0046]7)核型分析:iPS細(xì)胞處于對數(shù)生長期時向培養(yǎng)液中加入秋水仙素(終濃度為0.1 μ g/ml)37°C孵育3小時，消化成單細(xì)胞懸液后以0.075M KC137°C低滲30分鐘，加入固定液(甲醇:冰醋酸3:1)預(yù)固定15分鐘后再重復(fù)固定3遍，然后冰片滴片、室溫晾干后再置室溫老化2-3天，60°C老化3小時，之后用0.125%胰酶消化處理，Giemsa染色，油鏡觀察，照像分析。結(jié)果:建立的隱睪特異性iPS細(xì)胞和種子細(xì)胞具有相同的STR位點(diǎn)和正常核型，說明隱睪特異性iPS細(xì)胞和種子細(xì)胞具有相同的遺傳學(xué)背景，細(xì)胞重編程和體外培養(yǎng)過程也未影響隱睪特異性iPS細(xì)胞的核型。(圖3)
[0047]8)iPS細(xì)胞的體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn):iPS細(xì)胞擴(kuò)增后以0.05%胰酶消化細(xì)胞3分鐘，將細(xì)胞從培養(yǎng)板底部吹打下來，重懸于含5%FBS的生理鹽水或者PBS中，以Iml注射器注射進(jìn)
4-8周齡NOD-SCID小鼠的后腿肌肉中，約2-5X 106個細(xì)胞/100 μ I/注射。視長成的畸胎瘤的大小，通常在注射后10-12周左右，取出畸胎瘤，常規(guī)石蠟包埋切片或者冰凍切片后染色觀察三個胚層的細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果:畸胎瘤實(shí)驗(yàn)(體內(nèi)分化)形成實(shí)驗(yàn)(體外分化)結(jié)果表明這群細(xì)胞能夠分化成三胚層來源的細(xì)胞。(圖4Α)
[0048]9) iPS細(xì)胞的體外分化實(shí)驗(yàn):將iPS細(xì)胞擴(kuò)增后懸浮生長，形成擬胚體，12天后再貼壁生長。所用培養(yǎng)液為含15%FBS的DMEM。長出的細(xì)胞呈現(xiàn)不同的形態(tài)特征，RT-PCR檢測其表達(dá)三個胚層的分子標(biāo)記物如外胚層的nestin和NF，中胚層的BMP4和MYOGLOBIN，內(nèi)胚層的GATA4和AFP，說明其具有體外分化全能(圖4B)。
[0049]4.向生精細(xì)胞誘導(dǎo)分化，我們改進(jìn)了誘導(dǎo)液的配方:基礎(chǔ)誘導(dǎo)液為DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加IMm L-Glutamine0第一階段誘導(dǎo)因子為BMP4，其作用濃度為IOOng/ml，作用時間為I周；第二階段誘導(dǎo)因子為FGF9，其作用濃度為50ng/ml，作用時間為2周；第三階段誘導(dǎo)因子為RA，其作用濃度為lUm，左右時間為I周。
[0050]按照常規(guī)細(xì)胞組化所列舉試劑和步驟，進(jìn)行VASA染色，發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化后細(xì)胞VASA染色陽性(圖5)，這表明iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化成了生精細(xì)胞。
[0051]本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻(xiàn)皆全文列入本文作為參考。
【權(quán)利要求】
1.一種隱睪特異性生精細(xì)胞模型的制備方法，包括下列步驟: a)收集隱睪患者新鮮尿液，離心沉淀種子細(xì)胞； b)細(xì)胞加入種子細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)； c)iPS細(xì)胞的建立和鑒定； d)iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為生精細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述種子細(xì)胞培養(yǎng)液為
A.Keratinocyte-SFM+supplement(BPE20ng/ml, EGF10ng/ml)+l%L-glutamine+l%P/S
B.330ml DMEM+1IOml F_12nutrient mixure+50ml FBS+5mlL-glutamine+5ml P/S+0.4ug/ml Hydrocortisone+lOug/ml EGF上述A和B兩種培養(yǎng)液，以體積比2:1混合即為最終培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述iPS細(xì)胞的建立為通過將0CT4、S0X2、KLF4、CMYC4個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入種子細(xì)胞，接種在輻照后的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，每天更換人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，將出現(xiàn)的集落樣生長的細(xì)胞用機(jī)械法挑出克隆，所述人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液為 DMEM/F12+20%KSR+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺 +4ng/ml bFGF。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為生精細(xì)胞步驟為基礎(chǔ)誘導(dǎo)液為DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加IMmL-Glutamine，第一階段誘導(dǎo)因子為BMP4，其作用濃度為100ng/ml，作用時間為I周；第二階段誘導(dǎo)因子為FGF9，其作用濃度為50ng/ml,作用時間為2周；第三 階段誘導(dǎo)因子為RA，其作用濃度為IUm,作用時間為I周。
【文檔編號】C12N5/076GK103540567SQ201210241585
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月12日
【發(fā)明者】陳方, 周君梅 申請人:上海市兒童醫(yī)院