專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于抑癌基因的抗肝癌制劑及制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利涉及一種基于腺病毒特異性表達(dá)的抑癌基因PTEN，可用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗癌制劑——甘露聚糖修飾的腺病毒-抑癌基因PTEN，即Manan-Ad5-PTEN，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
目前對(duì)于腫瘤的治療主要集中于手術(shù)、放療和化療等常規(guī)手段，但很多惡性腫瘤還是難以治愈，生物治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療的新模式，并受到越來(lái)越多的關(guān)注。由于癌癥的產(chǎn)生是病毒或化學(xué)致癌物的作用使原癌基因激活成為癌基因，以及抑癌基因失活，引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控而形成，因此基因治療的目的是通過(guò)外源基因的導(dǎo)入以修復(fù)或糾正病人體內(nèi)基因表達(dá)系統(tǒng)，從根入手，阻斷腫瘤的病理過(guò)程。
抑癌基因 PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosometen gene, PTEN)是1997年由Steck等3個(gè)研究小組分別發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的抑癌基因。現(xiàn)已證實(shí)該基因的突變、失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，成為繼pl6、p27和p53后又一具有重要意義的抑癌基因。目前已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在PTEN基因的突變，如錯(cuò)構(gòu)瘤綜合征(Cow den syndrome)、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌、消化道腫瘤等。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因的缺失、突變或表達(dá)產(chǎn)物的失活等，影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展?；虻膶?dǎo)入，根據(jù)載體的不同，可分為病毒轉(zhuǎn)基因和質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因兩種。其中，以質(zhì)粒為載體的基因治療存在基因轉(zhuǎn)染率較低的問(wèn)題；病毒載體則具有更高的轉(zhuǎn)染效率。腺病毒是目前基因治療研究和臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一。由于腺病毒具有載體宿主范圍寬廣，感染效率高，可插入外源基因片段大，無(wú)插入突變等特點(diǎn)，因而受到特別的重視。但腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移缺乏靶向特異性。在基因治療的載體研究中，其中一個(gè)重要的研究方向是用配體或單克隆抗體對(duì)載體系統(tǒng)進(jìn)行修飾，以提高靶組織、靶細(xì)胞對(duì)載體系統(tǒng)的攝取能力。研究發(fā)現(xiàn)，肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(如KupfTer細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在有甘露糖受體，它可以與含糖基的復(fù)合物結(jié)合。因此，通過(guò)一定的方式，利用甘露糖受體介導(dǎo)系統(tǒng)將腺病毒與甘露糖受體結(jié)合，可達(dá)到對(duì)肝臟的靶向性。由于腺病毒存在潛在的免疫原性和毒性，并且體內(nèi)應(yīng)用時(shí)易被廣泛存在的腺病毒抗體中和。為克服腺病毒的無(wú)靶向性、免疫原性以及在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)易被腺病毒抗體中和等缺點(diǎn)，有研究者對(duì)病毒的衣殼蛋白進(jìn)行聚乙二醇化，形成一種“隱形病毒”，逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，降低了 T細(xì)胞毒性和抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而延長(zhǎng)了基因表達(dá)。本發(fā)明將腺病毒的衣殼蛋白通過(guò)甘露聚糖糖基化，可將重組腺病毒在體內(nèi)靶向至DC細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，誘導(dǎo)了抗腫瘤抗原的免疫應(yīng)答；可延長(zhǎng)基因表達(dá)，降低其免疫原性和毒性。三、發(fā)明目的
本發(fā)明的目的在于充分利用腺病毒載體高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的優(yōu)點(diǎn)，避免其免疫原性和毒性的產(chǎn)生，制備一種利用抑癌基因原理有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的新型的抗肝癌制劑，為惡性腫瘤的治療提供一種有效的治療途徑。
四
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用腺病毒轉(zhuǎn)運(yùn)抑癌基因PTEN，并利用甘露聚糖修飾腺病毒載體，從而制備了一種新型的抗肝癌制劑。本發(fā)明涉及的抑癌制劑的具體制備方法如下
第一步特異性表達(dá)PTEN基因的重組腺病毒即Ad5-PTEN的大量擴(kuò)增。利用微量的商品化的Ad5-PTEN腺病毒種源感染293細(xì)胞，48h后95%的細(xì)胞胞質(zhì)收縮變圓呈葡萄串樣，即判斷為出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE);收集細(xì)胞懸液，4°C，5000 rpm離心10 min，上清備用；將細(xì)胞重懸于2.0 mL完全培養(yǎng)基中，于液氮中凍結(jié)細(xì)胞，37°C水浴溶解，劇烈振蕩，此步驟共進(jìn)行4次；然后4°C, 5000 rpm離心10 min,收集上清后合并前一步驟的病毒上清進(jìn)一步感染100 _培養(yǎng)皿中的細(xì)胞；細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)后，按照前述方法收集病毒，并進(jìn)而將其感 染150 mm培養(yǎng)皿中的293細(xì)胞，以獲得足夠量的病毒。第二步Ad5_PTEN的純化。采用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法純化重組腺病毒，氯化銫密度分別為I. 45 g/m!^P1.25 g/mL。操作步驟如下各個(gè)超速離心管依次加入I. 25區(qū)/1111氯化銫1.25 mL,然后各管管底小心加入I. 45 g/mL氯化銫I. 25 mL以頂起低密度的氯化銫溶液；最上層加入2. 4 mL待純化樣品，100000Xg，4°C離心3 h，收集第二層乳白色病毒條帶。接著進(jìn)行第二次密度梯度離心各個(gè)超速離心管同上依次加入I. 65 mL I. 25g/mL氯化銫和I. 65 mL I. 45 g/mL氯化銫,最上層加入I. 6 mL第一步離心后收集的病毒條帶，IOOOOOXg 4°C離心15-18 h。第一次密度梯度超速離心后，上層為一些細(xì)胞碎片和一些缺陷型病毒顆粒，第二條有白色乳光的帶層為病毒層；第二次離心后出現(xiàn)一條分界清晰的乳白色半透明的薄層病毒帶即為所需腺病毒。第三步抑癌制劑的制備。I)透析袋處理制備氧化型甘露聚糖前，對(duì)透析袋進(jìn)行預(yù)處理，以激活透析袋；處理步驟如下將透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20 cm)的小段；置于2% (W/V)碳酸氫鈉和ImM EDTA (pH 8. 0)混合溶液中煮沸10分鐘；蒸餾水徹底清洗；ImM EDTA (pH 8.0)中煮沸10分鐘；冷卻后，加上封蓋存放于4°C，透析袋始終浸沒(méi)在溶液內(nèi)，取用透析袋時(shí)必須戴手套；用前在透析袋內(nèi)裝滿緩沖液清洗干凈。2)氧化型甘露聚糖的制備反應(yīng)按照?qǐng)DI進(jìn)行，反應(yīng)步驟如下甘露聚糖以0. I M磷酸緩沖液(pH 6. 0)配成一定濃度的溶液，用0.01-1.0 M的高碘酸鈉于適當(dāng)溫度氧化60分鐘，加入10 mL乙二醇于適當(dāng)溫度再孵育30分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物加入透析袋以碳酸鹽緩沖液適當(dāng)溫度下平衡透析5小時(shí)。3)目標(biāo)化合物一抗癌制劑的制備氧化型甘露聚糖與Ad5-PTEN反應(yīng)，將純化后的腺病毒Ad5-PTEN與一定濃度的氧化型甘露聚糖溶液混合，室溫孵育過(guò)夜，產(chǎn)物保存于一 80°C冰箱。五具體實(shí)施例方式 本發(fā)明制備的抗癌制劑，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)步驟較少，我們依托本?？蒲衅脚_(tái)對(duì)這種抗癌制劑進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)，臨床研究正在積極籌備中。已經(jīng)進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要步驟為(I)小鼠肝癌細(xì)胞H22接種小鼠；6天后，將動(dòng)物隨機(jī)分為四組，每組10只小鼠，各組給藥情況如下(采用瘤內(nèi)注射，體積 100 mL) I Ad5-PTEN ； II =Docetaxel ；III PBS ；IV :Man-Ad5_PTEN。給藥后每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)體瘤長(zhǎng)徑和短徑，按照公式V=0. 52'長(zhǎng)徑’短徑’短徑，計(jì)算出各組每只動(dòng)物的腫瘤體積和每組每一個(gè)測(cè)量點(diǎn)的平均值，第19天，繪出各組給藥后腫瘤體積增長(zhǎng)曲線(圖2);處死各組小鼠，分離瘤塊，并稱(chēng)重，結(jié)果見(jiàn)圖3。
六、有益效果
本發(fā)明涉及的抗肝癌制劑從腫瘤的發(fā)病機(jī)理入手，利用抑癌基因PTEN從根源上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，利用甘露聚糖修飾腺病毒表面，避免了腺病毒的免疫原性和毒性的產(chǎn)生，提高了腺病毒在體內(nèi)的穩(wěn)定性。將此新型抑癌制劑應(yīng)用于荷瘤小鼠瘤內(nèi)給藥，產(chǎn)生了顯著的腫瘤抑制效應(yīng)。對(duì)附圖
的說(shuō)明
圖I是甘露聚糖修飾腺病毒表面的反應(yīng)過(guò)程 圖2是小鼠腫瘤生長(zhǎng)體積變化曲線圖 圖3是荷瘤小鼠瘤塊重量比較圖
權(quán)利要求
1.一種具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗肝癌制劑Manan-Ad5-PTEN的組成要素，其特征是，中心要素包括抑癌基因PTEN，PTEN的表達(dá)載體腺病毒，以及對(duì)腺病毒進(jìn)行表面修飾的化學(xué)物質(zhì)甘露聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法，其特征是甘露聚糖以0. I M磷酸緩沖液(pH 6. 0)配成一定濃度的溶液，用0. 01-1. 0 M的高碘酸鈉于適當(dāng)溫度氧化60分鐘，加入10 mL乙二醇于適當(dāng)溫度再孵育30分鐘；反應(yīng)產(chǎn)物加入透析袋以透析液適當(dāng)溫度下平衡透析5小時(shí)；制備好的氧化型甘露聚糖與純化后的Ad5-PTEN反應(yīng)，室溫孵育過(guò)夜，產(chǎn)物保存于-80°C冰箱。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法，其特征是所述的甘露聚糖溶液的濃度為20-50 mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法,其特征是所述的適當(dāng)溫度是4°C -30°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗癌制劑Manan-Ad5-PTEN的制備方法,其特征是所述的透析液為碳酸鹽緩沖液(pH 6. 0 - 9. 0)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于抑制小鼠腫瘤增長(zhǎng)的抗肝癌制劑及其制備工藝。本發(fā)明的目的在于以腺病毒表達(dá)的PTEN抑癌基因?yàn)橹委熕幬?，利用腺病毒載體高效轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)化學(xué)方法對(duì)腺病毒表面進(jìn)行修飾以避免其免疫原性和毒性的產(chǎn)生，制備一種從根源入手利用抑癌基因原理有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的新型的抗癌制劑，為惡性腫瘤的治療提供一種有效的治療途徑。本發(fā)明的抑肝癌制劑制備工藝簡(jiǎn)單，不需要特殊的生產(chǎn)條件。
文檔編號(hào)C12N15/64GK102743766SQ20121024327
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者劉中兵, 李勁薇, 柯發(fā)敏, 鐘志容 申請(qǐng)人:鐘志容