專利名稱：油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甘藍(lán)型油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)及其緊密連鎖的分子標(biāo)記，同時(shí)還涉及該分子標(biāo)記在油菜高抗裂角育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油菜是世界第三大油料作物，也是我國(guó)繼水稻、小麥、玉米和大豆之后的第五大農(nóng)作物，全世界大約13%的植物油來(lái)自于油菜。除了作為食用油的主要原料之外，油菜也是重 要的工業(yè)原料和歐盟主要成員國(guó)可再生能源的主要生物資源。我國(guó)油菜的種植面積和總產(chǎn)量均占世界的30%左右，它不僅關(guān)系到我國(guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整、優(yōu)化和近億農(nóng)民的增收，也關(guān)系到滿足人民生活水平提高、膳食結(jié)構(gòu)改善及保障國(guó)家食物安全的需要，因此，加強(qiáng)油菜生產(chǎn)意義重大。機(jī)械化是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向，而油菜角果易開(kāi)裂正是目前制約油菜產(chǎn)業(yè)機(jī)械化收獲的瓶頸，嚴(yán)重地影響著油菜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率的提高。由于目前生產(chǎn)上利用的甘藍(lán)型油菜在成熟時(shí)特別容易裂角，一般都會(huì)造成產(chǎn)量損失10%左右，機(jī)械化收割損失將更加嚴(yán)重。如果遇到成熟期氣候比較惡劣，產(chǎn)量損失可高達(dá)50%以上，造成豐產(chǎn)不豐收。而且，易裂角除了帶來(lái)產(chǎn)量損失外還會(huì)造成一系列其他的不良影響，如落地籽粒在條件適宜時(shí)會(huì)萌發(fā)形成自生苗，影響下茬作物生長(zhǎng)，同時(shí)也增加了使用除草劑去除再生苗的成本。未來(lái)隨著轉(zhuǎn)基因油菜的推廣應(yīng)用，角果開(kāi)裂種子散落還會(huì)帶來(lái)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目前生產(chǎn)上為了避免裂角造成的產(chǎn)量損失和對(duì)下茬作物的不良影響，通常是提前收獲，但這樣做會(huì)造成油菜籽含油量下降，種子中葉綠素含量過(guò)高，影響食用油的品質(zhì)。因此，選育抗裂角的油菜品種對(duì)油菜生產(chǎn)顯得極為重要。但一般甘藍(lán)型油菜品種間抗裂角特性變異不大，在其他的近緣種中雖然存在抗裂角特性，但通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交很難除去不良農(nóng)藝性狀的影響。雖然目前在擬南芥中已有許多與角果發(fā)育和開(kāi)裂有關(guān)的基因被克隆，利用這些基因來(lái)抑制油菜角果開(kāi)裂和防止種子損失已經(jīng)成為可能，但有關(guān)基因轉(zhuǎn)化的結(jié)果是導(dǎo)致角果成筒狀結(jié)構(gòu)，致使角果完全不能開(kāi)裂，造成脫粒十分困難。因此，對(duì)甘藍(lán)型油菜抗裂角資源的發(fā)掘以及對(duì)抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)，有助于我們未來(lái)培育適用的抗裂角優(yōu)異甘藍(lán)型油菜品種。大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，如產(chǎn)量性狀、含油量、成熟期、品質(zhì)、抗旱性等。數(shù)量性狀易受環(huán)境條件的影響，因此選擇效果不好。傳統(tǒng)育種方法周期長(zhǎng)，主要是由數(shù)量性狀造成的。由于分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，人們已可將復(fù)雜的數(shù)量性狀進(jìn)行分解，像研究質(zhì)量性狀基因一樣對(duì)控制數(shù)量性狀的多個(gè)基因進(jìn)行研究。數(shù)量性狀基因座(quantitat ive trait locus,簡(jiǎn)稱QTL)是在高密度的遺傳圖譜基礎(chǔ)上,通過(guò)一定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得分子標(biāo)記，借助Mapmaker軟件分析確定控制某一性狀的基因在染色體上的位置。當(dāng)目標(biāo)性狀由少數(shù)幾個(gè)基因控制時(shí)用標(biāo)記選擇，對(duì)發(fā)掘遺傳潛力非常有效。本研究通過(guò)遺傳分析及QTL定位，旨在篩選出對(duì)油菜抗裂角具有正向效應(yīng)的QTL，用于油菜抗裂角的分子標(biāo)記輔助選擇、分子育種及抗裂角基因的克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是在于提供了一個(gè)油菜抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記BrSF0007-39，該分子標(biāo)記不僅有助于輔助篩選抗裂角材料，同時(shí)也有助于深入了解中雙11號(hào)高抗裂角性狀構(gòu)成的分子機(jī)理，為今后主效QTL的精細(xì)定位及克隆奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于一個(gè)油菜抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記的弓I物，對(duì)今后中雙11號(hào)及其及其衍生品系的抗裂角性狀育種提供了極大的便利。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供了一個(gè)油菜抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記在油菜產(chǎn)量育種中的應(yīng)用。分子標(biāo)記篩選主要優(yōu)點(diǎn)就是可以在苗期篩選，大大節(jié)約成本和篩選工作量。常規(guī)篩選方法需要等到油菜完全成熟以后才能選擇，不能在苗期淘汰掉絕大部分不抗裂角的材料，進(jìn)而可以快速篩選出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育種。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記，其篩選步驟是a)利用在抗裂角指數(shù)上有極顯著差異的油菜品種中雙11(抗裂角指數(shù)為0. 83)和73290 (抗裂角指數(shù)為0. 48)雜交，雜種Fl代自交產(chǎn)生F2和F2:3代分離群體；b)采用CTAB法提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA，過(guò)程中所用到的試劑包括提取液(I. 4M NaCiaOOmM Tris, pH8. 0,20mM EDTA, pH8. 0，2%CTAB)、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇；c)合成油菜SSR引物，并對(duì)親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，染色和顯影后對(duì)條帶的大小進(jìn)行判別，篩選多態(tài)性引物；d)利用多態(tài)性引物對(duì)F2代分離群體進(jìn)行基因型分析和遺傳圖譜的構(gòu)建，結(jié)合其抗裂角指數(shù)的性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，檢測(cè)到油菜第9染色體具有一個(gè)QTL位點(diǎn)Psr. A9 (見(jiàn)表2)，與其性狀緊密連鎖的SSR標(biāo)記為BrSF0007_39，該標(biāo)記位于QTL位點(diǎn)Psr. A9的置信區(qū)間內(nèi)，在中雙11號(hào)中可擴(kuò)增出大小為204bp和228bp的兩條帶，在73290中只能擴(kuò)出大小為228bp和260bp的兩條帶(圖4)，引物序列為BrSF0007_39_F 5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007_39-R : 5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’ ；Joinmap3. 0作圖軟件用于對(duì)所獲得的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，WinQTL cart2. 5軟件用于QTL分析。本研究用到的兩個(gè)親本材料抗裂角指數(shù)相差接近一倍，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所油菜生物技術(shù)育種課題組科技人員在王漢中研究員帶領(lǐng)下育成。中雙11號(hào)及73290來(lái)源詳見(jiàn)遺傳資源來(lái)源披露登記表。油菜兩親本、后代分離群體單株抗裂角指數(shù)的測(cè)定參照文獻(xiàn)(文雁成，甘藍(lán)型油菜抗裂角品種的篩選與分析，作物學(xué)報(bào)，2008，I)中的隨機(jī)碰撞法完成，植物葉片總DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳均為常用的分子生物學(xué)技術(shù)，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),和 Draper 等人,Blackwell,科學(xué)出版社，1988 中的條件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及的所有試劑[包括CTAB提取液(0.2M Tris — C1，0. 25M NaCl, 25mMEDT A，0. 5% (質(zhì)量比)SDS, pH7. 5，Taq酶，dNTP，丙烯酰胺，尿素，冰醋酸，AgNO3，氯仿，異戊醇，RNA酶和無(wú)水乙醇]均可從商業(yè)途徑獲得，并按照實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中的條件或所用試劑制造廠商所建議的條件使用。
利用上述技術(shù)措施，申請(qǐng)人最終獲得了一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記，具體如下該標(biāo)記位于QTL位點(diǎn)Psr. A9的置信區(qū)間內(nèi)，其引物序列為BrSF0007_39_F 5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007-39-R :5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3 。Psr. A9,該主效基因位點(diǎn)位于油菜第9染色體，和分子標(biāo)記BrSF0007-39緊密連鎖，利用QTLCart2. 5軟件分析測(cè)得其對(duì)油菜抗裂角性狀的貢獻(xiàn)率為32. 7%,加性效應(yīng)為0. 87，顯性效應(yīng)為0. 97，屬于完全顯性遺傳。一種抗裂角主效基因位點(diǎn)Psr. A9的分子標(biāo)記BrSF0007_39在油菜產(chǎn)量育種中的應(yīng)用利用Psr. A9位點(diǎn)的分子標(biāo)記BrSF0007_39對(duì)兩親本的F3代進(jìn)行基因型鑒定，并在收獲后進(jìn)行抗裂角性狀的考種。結(jié)果表明，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇得到的植株抗裂角指數(shù)超過(guò)F2:3家系均值(抗裂角指數(shù)0. 655)的占85. 7%，在保留下來(lái)的植株再篩選高油、高產(chǎn)的株系。常規(guī)篩選方法需要等到油菜完全成熟以后才能選擇，不能在苗期淘汰掉絕大部分 不抗裂角的材料，通過(guò)鑒定上述抗裂角主效基因位點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)油菜抗裂角性，可迅速提高油菜高抗裂角、高產(chǎn)品種篩選的效率，加快育種進(jìn)程。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明首次定位了油菜品種中雙11控制抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn)，它對(duì)油菜抗裂角性狀的貢獻(xiàn)率為32. 7%，使得油菜抗裂角主效基因位點(diǎn)的定位工作居于同領(lǐng)域世界前列，基于此位點(diǎn)篩選連鎖分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀判斷的準(zhǔn)確性大大提高。2、在常規(guī)育種方法中，抗裂角性狀鑒定要等到成熟期收獲后考種，受環(huán)境影響較大而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，選擇效率低且成本高。通過(guò)檢測(cè)抗裂角性狀主效QTL位點(diǎn)，可以在苗期進(jìn)行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率。3、本發(fā)明中抗裂角主效基因位點(diǎn)位置明確，主效基因位點(diǎn)的檢測(cè)方法方便快速，不受環(huán)境影響。通過(guò)檢測(cè)與抗裂角性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測(cè)抗裂角指數(shù)的高低，進(jìn)而可以快速篩選高抗裂角株系，輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。


圖I為一種中雙11X73290組合F2和F2:3群體在武漢種植時(shí)的抗裂角指數(shù)分布圖。結(jié)果表明抗裂角表型呈連續(xù)性分布，證明抗裂角屬于數(shù)量性狀。圖2為一種A9連鎖群標(biāo)記示意圖。右半部分指示該連鎖群上的標(biāo)記名稱，左半部分指示每個(gè)標(biāo)記對(duì)應(yīng)的遺傳圖距。圖3為一種位于第9連鎖群上的抗裂角主效基因位點(diǎn)LOD曲線示意圖。圖中橫坐標(biāo)代表連鎖群，縱坐標(biāo)代表LOD值。圖4為一種利用分子標(biāo)記BrSF0007_39對(duì)F3單株進(jìn)行基因型分析和篩選示意圖。圖中1-39為F3單株編號(hào)，最后兩個(gè)Pl和P2分別代表親本中雙11和73290。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.油菜抗裂角分離群體的構(gòu)建及性狀測(cè)定本實(shí)施例中使用的群體為油菜高抗裂角和不抗裂角親本(中雙11 :抗裂角指數(shù)0.83 ；73290 :抗裂角指數(shù)0. 48)雜交后代一 F2和F2:3群體。親本、F2和F2:3群體的抗裂角表型在成熟期收獲后經(jīng)考種鑒定。F2和F2:3分離群體抗裂角指數(shù)結(jié)果表明兩群體抗裂角指數(shù)均呈連續(xù)分布，但變異分布不呈典型正態(tài)分布，證明抗裂角性狀屬于數(shù)量性狀且存在主效基因位點(diǎn)(圖I)。
實(shí)施例2.親本、F2和F2:3分離群體葉片總DNA的提取利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下A.取0. I克油菜葉片鮮樣放入研磨，加700微升提取液研磨，隨即裝入I. 5毫升離心管中置于65° C恒溫水浴60分鐘，其間混合2-3次；B.加等體積的苯酚氯仿異戊醇(25 24 :1，V / V / V)，輕輕顛倒使其充分混勻；12000rpm離心10分鐘使其分層，輕輕吸取上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5毫升離心管；加等體積的氯仿異戊醇(24 :1，V / V)重新抽提一次；C.加入I毫升的-20° C預(yù)冷無(wú)水乙醇，置于-20° C冷凍不超過(guò)30分鐘讓DNA析出；12000rpm離心10分鐘，倒掉離心管中乙醇溶液；用75%乙醇清洗2_3次；倒掉浸泡液，打開(kāi)離心管蓋置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干；D.干燥后加入 TE (IOmM Tris, pH8. 0 ；lmM EDTA, pH8. 0)溶解 DNA ;紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆茫粚?shí)施例3.引物的開(kāi)發(fā)合成及多態(tài)性的篩選我們采用的SSR引物包括兩類一類是已發(fā)表文章和蕓苔屬數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)的引物序列(http://www. brassica. info/resource/markers/ssr-exchange. php),包括 CB, CNU,niab, MR, FITO, 01，BRMS, BRAS, Ni, Na, BN, NGA, MB, BnGMS, BrGMS, BoGMS, BnEMS,等許多系列；另一類是我們根據(jù)白菜和甘藍(lán)測(cè)序后拼接成的scaffold序列開(kāi)發(fā)的，分別命名為BrSF和BoSF系列，具體的開(kāi)發(fā)方法是先利用SSRHunter軟件在每個(gè)scaffold搜索SSR，然后用Primer3. 0軟件設(shè)計(jì)SSR引物。我們已經(jīng)通過(guò)生物公司合成了公共和新開(kāi)發(fā)的SSR引物共3085對(duì)，篩選結(jié)果表明，有15%引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在雙親間存在長(zhǎng)度多態(tài)性差異。多態(tài)性篩選程序如下(I)從親本中各隨機(jī)選擇10株DNA等量混合，作為篩選引物的模板。(2) PCR 反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記，其篩選步驟是 a)利用在抗裂角指數(shù)上有極顯著差異的油菜品種中雙11和73290雜交，雜種Fl代自交產(chǎn)生F2和F2:3代分離群體； b)采用CTAB法提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA； c)合成油菜SSR引物，并對(duì)親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，染色和顯影后對(duì)條帶的大小進(jìn)行判別，篩選多態(tài)性引物； d)利用多態(tài)性引物對(duì)F2代分離群體進(jìn)行基因型分析和遺傳圖譜的構(gòu)建，結(jié)合其抗裂角指數(shù)的性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，檢測(cè)到油菜第9染色體具有一個(gè)QTL位點(diǎn)Psr.A9,與其性狀緊密連鎖的SSR標(biāo)記為BrSF0007-39，該標(biāo)記位于QTL位點(diǎn)Psr. A9的置信區(qū)間內(nèi)，在中雙11號(hào)中擴(kuò)增出大小為204 bp和228 bp的兩條帶，引物序列為 BrSF0007-39-F :5，-ACCAAACCAAACCAAACCAA-3，，即 SEQ ID NO:I, BrSF0007-39-R 5，-CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3，，即 SEQ ID NO:2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記，其特征在于所述的QTL位點(diǎn)Psr. A9位于油菜第9染色體，對(duì)油菜抗裂角性狀的貢獻(xiàn)率為32. 7%,加性效應(yīng)為0. 87，顯性效應(yīng)為0. 97，屬于完全顯性遺傳。
3.權(quán)利要求I所述的一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的SSR分子標(biāo)記，其特征在于分子標(biāo)記的引物序列為 fcSF0007-39-F :5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007-39-R 5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’。
4.權(quán)利要求I或2所述分子標(biāo)記在油菜高抗裂角育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)分子標(biāo)記及應(yīng)用，步驟包括1)利用在抗裂角性狀上有顯著差異的甘藍(lán)型油菜品種中雙11和73290雜交，后代自交獲得抗裂角性狀分離的F2和F2:3分離群體；2)利用SSR引物對(duì)親本DNA進(jìn)行多態(tài)性的篩選，通過(guò)對(duì)F2代分離群體進(jìn)行SSR分子標(biāo)記基因型分析構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；3)通過(guò)對(duì)F2和F2:3分離群體進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)和考種獲得抗裂角性狀的表型數(shù)據(jù)；4)結(jié)合開(kāi)發(fā)的高密度分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，以及分離群體的基因型和表型數(shù)據(jù)，利用QTLCart2.5軟件進(jìn)行QTL檢測(cè)，檢測(cè)到甘藍(lán)型有愛(ài)A9連鎖群上控制油菜抗裂角的主效基因位點(diǎn)Psr.A9，與該主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記BrSF0007-39，利用該標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇可大大提高抗裂角育種的選擇效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102747080SQ20121024336
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者劉貴華, 華瑋, 師家勤, 楊慶, 王新發(fā), 王漢中, 胡志勇, 黃順謀 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所