專利名稱：Bcl-2/IgH基因重排在作為B細胞淋巴瘤骨髓浸潤標志中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及Bcl-2/IgH基因重排在作為B細胞淋巴瘤骨髓浸潤標志中的應用，特別涉及用于檢測Bcl-2/IgH基因重排的物質或/和儀器在制備篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者產(chǎn)品中的應用。
背景技術：
B細胞淋巴瘤(B-NHL)在腫瘤病理組織學診斷中屬于疑難病種之一，種類繁多，分類復雜，彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最頻發(fā)的類型，占新診斷NHL 的 30-40%。由于骨髓內造血細胞的組織學特點，常規(guī)的病理組織形態(tài)學和免疫組織化學染色技術可以檢測出骨髓受侵，合并白血病階段，對骨髓微小浸潤尚不能滿足診斷需要，微小浸潤病灶是淋巴瘤復發(fā)的主要根源，骨髓是否浸潤直接影響DLBCL的分期，進而影響治療及預后。目前，評價淋巴瘤骨髓浸潤與否的常用方法是骨髓涂片細胞形態(tài)學染色，該方法存在一定的局限性一是淋巴瘤細胞形態(tài)變化多樣不好辨認，尤其化療后更是難判別，易導致假陽性和假陰性；二是常規(guī)判定幼稚淋巴細胞> 5%為骨髓受侵，而正常人骨髓幼稚淋巴細胞< 1%。這就給我們提出了如下迫切需要解決的問題對于骨髓形態(tài)學檢查幼稚淋巴細胞在1-5%之間，如何判定哪些是正常狀態(tài)，哪些是骨髓形態(tài)學陰性的潛在的微小浸潤？骨髓形態(tài)學檢查固然重要，如何增加其他輔助手段減少人為因素盡量達到標準化？個體化治療需要實驗室提出個體化的診斷，骨髓檢查如何為下一步的臨床靶向治療提供有價值的靶點？這些問題現(xiàn)階段均無滿意的答案。人類B淋巴細胞在發(fā)育至前B細胞階段時重組酶有選擇地將分隔在胚系基因染色體上的可變區(qū)(V)、多樣區(qū)(D)、連接區(qū)(J)及恒定區(qū)(C)基因連接，即所謂重鏈(IgH)重排。由于V、D、J基因是多拷貝的，其間又有隨機堿基插入(N區(qū)插入)V-D. D-J之間，因此所形成的V-N-D-N-J序列數(shù)以百萬計，但對于每個B淋巴細胞來說該序列卻是獨特的。B-NHL是由巳完成IgH重排的B細胞惡變來的。bcl-2/IgH重排中bcl-2斷點發(fā)生于距bcl_2第3個外顯子3’端280bp的非翻譯區(qū)，稱為主要斷裂區(qū)(major breakpoint region, MBR),發(fā)生于距主要斷裂區(qū)30kb的下游，稱為次要斷裂區(qū)(minor cluster region，MCR)，其余的斷裂點分布在MBR和MCR之間或bcl-2基因5’端序列。IgH的斷點在J片段的5’側，大多位于J5和J6，少數(shù)斷裂點位于IgH的JH區(qū)3'端,極少數(shù)位于IgH的轉換區(qū)。D-J之間可有堿基缺失，bcl-2同額外的堿基一起插入該區(qū)，形成bcl-2/IgH融合基因。發(fā)生在MBR的重排，產(chǎn)生bcl-2/IgH融合mRNA轉錄；發(fā)生在MCR的重排，導致bcl-2mRNA水平上調。隨后可能是在MBR和MCR之間插入了一小段包含E u增強子的IgH基因超越了正常的bcl — 2基因調控過程，導致bcl-2基因在B細胞的高表達，從而抑制B細胞凋亡，使B細胞持續(xù)增殖，引發(fā)腫瘤。
間期核FISH技術的研究材料廣泛，無論是細胞病理學的涂片、印片、穿刺，還是組織病理學的新鮮標本和石蠟切片都適用。這種方法比傳統(tǒng)的染色體顯帶技術更加精確、靈敏度更高，比PCR方法的操作更為簡便，敏感性和特異性均較高，結果更加客觀可靠。再者，目前已知某些基因異常與蛋白表達異常并非同步顯現(xiàn)。遺傳學改變在淋巴組織病變的良、惡性鑒別、類型鑒別、復合型淋巴瘤的診斷及骨髓受侵情況的診斷均有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測Bcl-2/IgH基因重排的物質或/和儀器的新用途。本發(fā)明所提供的檢測Bcl-2/IgH基因重排的物質或/和儀器的新用途具體為用于 檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的物質或/和儀器在制備篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者的產(chǎn)品中的應用。所述骨髓浸潤為骨髓涂片細胞形態(tài)學檢測陽性，即骨髓中出現(xiàn)淋巴瘤細胞或幼稚淋巴細胞占有核細胞總數(shù)百分比> 5%。在本發(fā)明中，所述Bcl-2基因為人Bcl-2基因，所述IgH基因為人IgH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具體為由t (14 ；18)染色體易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更為具體的，為由t (14；18) (q32;q21)染色體易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因啟動子下游。在本發(fā)明的一個實施例中，所述用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排物質具體為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的探針，更為具體的，為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的熒光原位雜交探針，如美國Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH雙色雙融合探針(產(chǎn)品目錄號32-191018)。Bcl-2/IgH雙色雙融合探針，IgH基因被綠色熒光素標記，范圍大約I. 5Mb，覆蓋了 14q32上IgH的整個同源序列，并從3'端向IgH基因外擴展了 300kb的長度。Bcl-2基因被橙紅色熒光素標記，范圍大約750kb，覆蓋了整個Bcl-2基因并向遠近兩端延伸了 250kb的長度。當然，根據(jù)實際需要也可以為其它類型的探針，或是其他可用于檢測所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物質。在本發(fā)明的一個實施例中，所述B細胞淋巴瘤具體為彌漫大B細胞淋巴瘤。本發(fā)明的再一個目的是提供一種篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者的廣品。本發(fā)明所提供的篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者的產(chǎn)品具體為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的物質或/和儀器。所述骨髓浸潤為骨髓涂片細胞形態(tài)學檢測陽性，即骨髓中出現(xiàn)淋巴瘤細胞或幼稚淋巴細胞占細胞總數(shù)百分比> 5%。在本發(fā)明中，所述Bcl-2基因為人Bcl-2基因，所述IgH基因為人IgH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具體為由t (14 ；18)染色體易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更為具體的，為由t (14；18) (q32;q21)染色體易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因啟動子下游。在本發(fā)明中，所述篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者的產(chǎn)品可為用于篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤患者或潛在骨髓浸潤患者的試劑或試劑盒。在本發(fā)明的一個實施例中，所述用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排物質具體為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的探針，更為具體的，為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的熒光原位雜交探針，如美國Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH雙色雙融合探針(產(chǎn)品目錄號32-191018)。Bcl-2/IgH雙色雙融合探針，IgH基因被綠色熒光素標記，范圍大約I. 5Mb，覆蓋了 14q32上IgH的整個同源序列，并從3'端向IgH基因外擴展了 300kb的長度。Bcl-2基因被橙紅色熒光素標記，范圍大約750kb，覆蓋了整個Bcl-2基因并向遠近兩端延伸了 250kb的長度。當然，根據(jù)實際需要也可以為其它類型的探針，或是其他可用于檢測所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物質。
在本發(fā)明的一個實施例中，所述B細胞淋巴瘤具體為彌漫大B細胞淋巴瘤。在實際應用中，為了提高檢測結果的準確率，也可以將本發(fā)明的方法配合其他檢測手段一同使用，如常規(guī)的骨髓涂片細胞形態(tài)學染色檢測法。在本發(fā)明中，所述產(chǎn)品的篩查對象是臨床上確診患有彌漫大B細胞淋巴瘤患者，或是健康人。更為具體的，所述彌漫大B細胞淋巴瘤患者為原發(fā)部位(如淋巴結)發(fā)生所述Bcl-2基因和IgH基因重排的患者；所述健康人滿足外周血中淋巴細胞占白細胞比例在0. 20-0. 40之間，且無異型淋巴細胞及幼稚淋巴細胞的條件。所述產(chǎn)品的篩查樣本具體為采自所述對象的骨髓。本發(fā)明利用熒光原位雜交(FISH)等技術對彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原發(fā)部位(如淋巴結)石蠟組織切片和骨髓涂片進行檢測，最終發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因和IgH基因的重排可作為DLBCL骨髓浸潤與否的分子標志以及治療效果評價的標志，具體體現(xiàn)為與傳統(tǒng)的單一骨髓涂片形態(tài)學染色法相比，形態(tài)學結合FISH法比單一形態(tài)學染色法提高了陽性率(33. 0%vsl0. 3%);本發(fā)明骨髓涂片F(xiàn)ISH檢測Bcl-2/IgH基因重排且骨髓涂片細胞形態(tài)學存在1-5%幼稚淋巴細胞的病例83. 3% (10/12)比單一形態(tài)學染色不同程度提早診斷骨髓浸潤，比臨床復發(fā)提早預警至少3個月以上。這為淋巴瘤骨髓浸潤的臨床分期、治療及預后復查提供了有力的補充。


圖I為Bcl-2/IgH雙色雙融合探針結構和原理。圖2為DLBCL患者淋巴結和骨髓的Bcl-2/IgH基因分析和Bcl_2蛋白表達。a，冰凍淋巴結石蠟切片證實是DLBCL(HE X 100 )。b，細胞形態(tài)學檢查骨髓涂片計數(shù)幼稚淋巴細胞是6. 0%，按常規(guī)診斷標準，判為骨髓浸潤(X 1000)。C，免疫組化染色評價DLBCL的Bcl_2蛋白陽性表達(X 400)。d，免疫細胞化學染色Bcl-2蛋白細胞漿呈棕黃色陽性表達(X 400)。
e,淋巴結石蠟切片(2 y m)的Bcl-2/IgH熒光原位雜交結果，基因融合信號黃色箭頭標記(X630)。f，骨髓受侵間期核片的Bcl-2/IgH熒光原位雜交結果，可見14號及18號染色體呈多體改變黃色箭頭標記(X 630)。圖3為DLBCL骨髓微小浸潤的瑞氏-吉姆薩染色和雙色熒光原位雜交在同一張骨髓涂片的結果對比(Bcl-2/IgH)。A，陽性對照(X630)。B，陰性對照(X630)。C，DLBCL骨髓形態(tài)學瑞氏-吉姆薩染色涂片，可疑細胞用黃色箭頭標記(X 630 )。D，DLBCL骨髓細胞的熒光原位雜交結果，形態(tài)可疑細胞發(fā)生基因融合用黃色箭頭標記(X 630)。圖4為DLBCL淋巴結石蠟切片和骨髓經(jīng)雙色熒光原位雜交檢測發(fā)生信號擴增(黃色箭頭標記)。A，淋巴結石蠟切片(X630)。B，骨髓間期核片(X630)。
圖5為不同厚度石蠟組織切片的熒光原位雜交結果(2um和4um) (X630)。A，
2u m0 B，4 u m0圖6為DLBCL骨髓浸潤病例的病程進展中的骨髓形態(tài)學與雙色熒光原位雜交結果(Bcl-2/IgH)的比較。A，淋巴結石蠟切片證實為DLBCL (HEX100)。B，淋巴結組織切片(2um厚)FISH檢測Bcl-2/IgH顯示陽性(X630，箭頭所示)。C，3個月后復診行骨髓穿刺，骨髓形態(tài)學檢查幼稚淋巴細胞I. 5%，依據(jù)形態(tài)學診斷標準判為骨髓未受侵(X 1000)。D，3個月后復診的骨髓間期核片經(jīng)FISH檢測Bcl-2/IgH顯示陰性。E，6個月后復診，骨髓形態(tài)學檢查幼淋細胞3. 5%，依據(jù)形態(tài)學診斷標準判為骨髓未受侵(X 1000)。F，6個月后復診的骨髓間期核片經(jīng)FISH檢測Bcl-2/IgH顯示陽性(X 630，箭頭所示)。G，14個月后復診，骨髓形態(tài)學診斷為NHL合并急性淋巴細胞白血病(X 1000)。H，14個月后復診的骨髓間期核片經(jīng)FISH檢測Bcl-2/IgH顯示陽性(X 630，箭頭所示)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。I、主要試劑和儀器Bcl-2/IgH探針美國Vysis公司，產(chǎn)品目錄號為32-191018。Bcl-2/IgH探針是雙色雙融合探針，IgH基因被綠色熒光素標記，范圍大約I. 5Mb，覆蓋了 14q32上IgH的整個同源序列，并從3'端向IgH基因外擴展了 300kb的長度。Bcl-2基因被橙紅色熒光素標記，范圍大約750kb，覆蓋了整個Bcl-2基因并向遠近兩端延伸了 250kb的長度。正常的一個間期核中可見各自獨立的兩個橙紅色信號和兩個綠色信號(202G)，發(fā)生染色體易位(Bcl-2/IgH基因重排)的細胞核內有兩個黃色信號(101G2F)，見圖1，有時可以觀察到更多的融合信號或其他異常現(xiàn)象。Bcl-2抗體丹麥Dako公司，產(chǎn)品目錄號為IR614。PV-9000試劑盒(二步法免疫組化檢測試劑)北京中杉金橋生物技術有限公司，產(chǎn)品目錄號為PV-9000，內含3%H202去離子水、Polymer Helper (試劑I)、polyperxidase-anti-mouse/rabbit IgG (試劑 2)。一抗稀釋液、濃縮型DAB Kit,EDTA緩沖液、PBS緩沖液北京中杉金橋生物技術有限公司。2、溶液配方(I) 20XSSC :175. 3g NaCl，88. 2g 檸檬酸鈉，用 10ml/L NaOH 調制 pH7. 0，加蒸餾水定容至1L。(2)1 Xpepsin (胃蛋白酶)10% (w/v)pepsinO. 5 U 1,0. OlN HCLlmlo(3) 10XPBS 40g NaCl，IgKCl，14. 35g Na2HPO4,用 HCl 調制 pH7. 4，加蒸餾水定容至 500ml。(4) 40%硫酸葡聚糖40g硫酸葡聚糖，100ml8XSSC溶液。(5) 1% 多聚甲醛lg 多聚甲醛，IOOmll XPBS0(6)70% 甲酰胺 /2XSSC (pH = 7. 0，100ml)70ml 100%(v/v)甲酰胺，10ml20XSSC溶液，20ml去離子水。、
(7)50% 甲酰胺 /2XSSC(pH = 7. 0，100ml)50ml 100%(v/v)甲酰胺，10ml20XSSC溶液，40ml去離子水。(8) 0. 075M KCl :1. 12gKCl，200ml 去離子水。(9)20iU雜交液3iil7%(v/v)吐溫-20水，12 甲醛，5 硫酸葡聚糖(現(xiàn)用現(xiàn)配)。(10)2XSSC/0. 3%NP-40 100ml20 X SSC(pH5. 3)溶于 850ml 純化水，加 3mlNP_40，至NP-40完全溶解。NaOH調至pH7. 0，加純化水至1L。3、主要儀器
權利要求
1.用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的物質或/和儀器在制備篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者的產(chǎn)品中的應用。
2.根據(jù)權利要求I所述的應用，其特征在于所述物質為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的探針。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述B細胞淋巴瘤為彌漫大B細胞淋巴瘤。
4.篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者的產(chǎn)品，為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的物質或/和儀器。
5.根據(jù)權利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于所述物質為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的探針。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的產(chǎn)品，其特征在于所述B細胞淋巴瘤為彌漫大B細胞淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了Bcl-2/IgH基因重排在作為B細胞淋巴瘤骨髓浸潤標志中的應用。本發(fā)明所提供的應用具體為用于檢測Bcl-2基因和IgH基因重排的物質或/和儀器在制備篩查B細胞淋巴瘤疑似骨髓浸潤或潛在骨髓浸潤患者的產(chǎn)品中的應用；所述B細胞淋巴瘤為彌漫大B細胞淋巴瘤。實驗證明，與傳統(tǒng)的單一骨髓涂片形態(tài)學染色法相比，形態(tài)學結合FISH法比單一形態(tài)學染色法提高了陽性率(DLBCL:33.0%vs10.3%)；本發(fā)明骨髓涂片F(xiàn)ISH檢測Bcl-2/IgH發(fā)生基因重排且骨髓涂片細胞形態(tài)學存在1-5%幼稚淋巴細胞的病例83.3%(10/12)比單一形態(tài)學染色不同程度提早診斷骨髓浸潤，比臨床復發(fā)提早預警至少3個月以上。這為淋巴瘤骨髓浸潤的臨床分期、治療及預后復查提供了有力的補充。
文檔編號C12Q1/68GK102747156SQ20121024343
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月13日 優(yōu)先權日2012年7月13日
發(fā)明者劉鵬, 張長弓, 徐欣, 曲媛, 王明榮, 羅揚, 車軼群, 郝佳潔, 齊軍 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院