專利名稱：儀寧小麥抗小麥黃花葉病毒主效qtl的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了 ‘儀寧小麥’抗小麥黃花葉病毒主效QTL的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
普通小麥(Triticum aestivum L)有21對染色體,每對包含兩條一樣的染色體，這 21 條染色體分別為 1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、7D，普通小麥通常用AABBDD表示(圖I)。每條染色體又包含長臂和短臂，分別用L和S表示，比如2D染色體包括長臂2DL和短臂2DS。
小麥作為世界性的重要糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位，但由真菌一禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)(見參考文獻(xiàn)Inouye T(1969)Viral pathogenofthe wheat yellow mosaic disease. Nogaku Kenkyu53 :61-68)介導(dǎo)的小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic bymovirus, WYMV)引起的小麥黃花葉病(Wheat yellow mosaic,WYM)對小麥的生長發(fā)育及產(chǎn)量造成了嚴(yán)重危害，正日益成為危害我國和日本等亞洲國家小麥生產(chǎn)的最嚴(yán)重的病害之一(見參考文獻(xiàn)1、陶家鳳，秦家忠，肖際亨，沈言章，趙福臻，李天眷，謝貽遠(yuǎn)，何代富，饒有后，黃顯華(1980)四川土傳小麥黃色花葉病的研究.植物病理學(xué)報(bào)10 5-25 ;2、于善謙，陳仲宜，徐來升，張若平，王鳴岐，羅瑞梧(1986)發(fā)生在我國的小麥黃花葉病毒病.植物保護(hù)學(xué)報(bào)13 =217-219 ;3、李大偉，韓成貴，邢怡明，田兆豐，于嘉林，蔡祝南，劉儀(1997)中國小麥黃花葉病毒(WYMV)分布的RT-PCR鑒定.植物病理學(xué)報(bào)27 303-307)。將抗性主效QTL/基因引入小麥栽培品種，培育和推廣抗病毒品種是目前生產(chǎn)上防治小麥黃花葉病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。普通小麥品種‘儀寧小麥’(公知公用，見參考文獻(xiàn)侯慶樹(1993)抗梭條花葉病小麥新品種一儀寧小麥.江蘇科技短訊9 (4) :7-10)具有耐旱、耐寒、耐肥、抗倒等性狀優(yōu)良，抗病性較好，綜合性狀優(yōu)良。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所對‘儀寧小麥’抗黃花葉病進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明‘儀寧小麥’對小麥黃花葉病表現(xiàn)出高抗，‘鎮(zhèn)9523’表現(xiàn)高感。為了進(jìn)一步研究‘儀寧小麥’對小麥黃花葉病的抗性遺傳機(jī)制和定位抗性QTL，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所以高抗小麥黃花葉病的‘儀寧小麥’作母本、高感小麥抗黃花葉病的‘鎮(zhèn)9523’(審定品種)作父本、構(gòu)建了 F2:8重組自交系群體(Recombinant inbred line, RIL),并開展了利用該RIL群體進(jìn)行抗性QTL定位以及與主效QTL緊密連鎖分子標(biāo)記的篩選工作，以及進(jìn)一步利用“RIL11 - 14X鎮(zhèn)9523”次級F2分離群體進(jìn)行抗病主效QTL QYm. nau_2D. I精細(xì)定位的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供來自普通小麥品種‘儀寧小麥’的抗小麥黃花葉病主效QTLQYm. nau-2D. I緊密連鎖分子標(biāo)記2EST730。本發(fā)明的另一目的是提供該分子標(biāo)記的引物對。
本發(fā)明的又一目的是提供該分子標(biāo)記的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標(biāo)記2EST730，該分子標(biāo)記2EST730的上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物2EST730R序列如 SEQ ID NO. 2 所示。所述的分子標(biāo)記2EST730與QYm. nau-2D. I之間的遺傳距離為O. 3cM。所述的分子標(biāo)記2EST730的引物對，其上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO. 2所示。抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標(biāo)記方法，包括以待鑒定材料的DNA作為模板，用權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記2EST730的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再用銀染法檢測；能擴(kuò)增出約600bp特異條帶的植株 為含有抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau-2D. I的植株。所述的抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標(biāo)記方法,優(yōu)選包括如下步驟(I)以待鑒定材料的DNA作為模板，用權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記2EST730的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR 試劑組成為I μ L DNA 模板(20_100ng)，I. O μ LlO X PCR buffer,0. 8μ LMgCl2(25mmol/L),0. 8μ L dNTP(2. 5mmol/L)，上、下游引物(10ymol/L)各 O. 2μ L，0. 15μ LTaq DNA polymerase(5U/μ L),5. 85 μ L ddH20 ；PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存；PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測；(2)標(biāo)記引物鑒定QYm. nau-2D. I的結(jié)果為能擴(kuò)增出約600bp特異條帶的植株為含有QYm. nau_2D. I的植株。所述的分子標(biāo)記2EST730在分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記2EST730在選育抗小麥黃花葉病小麥品種中的應(yīng)用。有益效果I、本發(fā)明中公開的與‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物(2EST730F/2EST730R)是基于小麥EST序列設(shè)計(jì)而成，用來鑒定植株中是否含有QYm. nau-2D. 1，簡單易行、方便快捷、擴(kuò)增穩(wěn)定。2、標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R擴(kuò)增的產(chǎn)物與QYm. nau_2D. I之間的遺傳距離為O. 3cM,與現(xiàn)有技術(shù)中公開的分子標(biāo)記相比，本發(fā)明分子標(biāo)記與QYm. nau_2D. I遺傳距尚更近，意味著利用分子標(biāo)記輔助選擇QYm. nau-2D. I的準(zhǔn)確性更高。


圖I :普通小麥染色體示2 :小麥抗黃花葉病單株抗性鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)圖3 :標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R所對應(yīng)的小麥EST (BE423370)序列及引物序列位置圖4 :利用F2次級群體對QYm. nau_2D. I進(jìn)行精細(xì)定位圖5 :用“儀寧小麥X鎮(zhèn)9523”RIL群體雙親和部分抗、感家系的DNA作為模板，用本發(fā)明中的標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R在抗病親本‘儀寧小麥’(泳道I)和抗病家系(泳道3-7，10，11，13，15-17，19-22)中均擴(kuò)增出約600bp的特異條帶，而在感病的親本和家系中均未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。白色箭頭所示為特異條帶。注M. Marker ；1.儀寧小麥；18.鎮(zhèn)9523 ;3_17及19-22為部分抗、感家系；R.純
合抗?。籗.純合感病圖6 :用“RIL11 — 14X鎮(zhèn)9523”次級F2分離群體雙親和抗、感池及部分抗、感單 株的DNA作為模板，用本發(fā)明中的標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R在抗病親本’RILl 1-14’(泳道21 )、純合抗病單株(泳道1，2，16)、雜合抗病單株(泳道11，19，20)中均擴(kuò)增出約600bp的特異條帶，而標(biāo)記引物在感病的親本和單株中均未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。白色箭頭所示為特異條帶。注M.Marker ；21. RILll — 14 ；22.鎮(zhèn) 9523 ;1_20·部分抗、感單株；R.純合抗病；H.雜合抗??；S.純合感病。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I小麥抗黃花葉病的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)分為0-5級(圖2)(參考文獻(xiàn)劉偉華，何震天，耿波，侯明生，張敏，聶桓等(2004)小麥對黃花葉病的抗性鑒定及典型品種的遺傳分析.植物病理學(xué)報(bào)34 =542-547) 0級為植株無癥狀；1級為植株矮縮不明顯，輕度花葉，一般不產(chǎn)生明顯的條紋壞死斑，葉片不黃化或少數(shù)黃化；2級為植株矮縮不明顯，輕度花葉，產(chǎn)生明顯的條紋壞死斑，葉片黃化明顯；3級為植株輕度矮縮，花葉明顯，條紋壞死斑占葉面積1/2左右，部分葉片黃化，少數(shù)枯死，分蘗黃化矮縮；4級為植株明顯矮縮，嚴(yán)重花葉，條紋斑占葉面積3/4左右，心葉細(xì)弱扭曲或呈縮頂狀，部分葉片和分蘗枯死；5級為植株嚴(yán)重矮縮，大部分葉片和分蘗或整株枯死。‘儀寧小麥’對小麥黃花葉病表現(xiàn)高抗，抗性水平為O級；‘鎮(zhèn)9523’則表現(xiàn)高感，抗級水平為5級。在三個環(huán)境中(2007在南京六合試驗(yàn)點(diǎn)；2008_2009連續(xù)兩年在江蘇揚(yáng)州試驗(yàn)點(diǎn))對“儀寧小麥X鎮(zhèn)9523”的RIL群體(重組自交系群體)進(jìn)行了小麥黃花葉病抗性鑒定。選取涉及小麥21條染色體上的1336對引物(包括SSR、EST-SSR和STS)在抗病親本“儀寧小麥”與感病親本“鎮(zhèn)9523”之間進(jìn)行引物多態(tài)性篩選，然后對179個表現(xiàn)多態(tài)的引物繼續(xù)在自交系群體(106個株系)中進(jìn)行擴(kuò)增，并用作圖軟件JoinMap4. O進(jìn)行連鎖關(guān)系分析，構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用IciMapping3. I軟件定位小麥黃花葉病抗性相關(guān)QTL。結(jié)果表明位于‘儀寧小麥’ 2DL染色體上的主效QTL QYm. nau_2D. I在三個環(huán)境中均被檢測到，可解釋76. 25-93. 19%的表型變異。從RIL群體中選擇一個農(nóng)藝性狀與鎮(zhèn)9523相似的抗性家系‘RIL11 — 14’，利用該家系與鎮(zhèn)9523雜交構(gòu)建了一個次級F2分離群體及其衍生的F2:3家系。對該F2群體及F2:3家系的遺傳分析表明‘RIL11 - 14’中的小麥黃花葉病抗性受顯性單基因控制，F(xiàn)2群體中純合抗病基因型(QYm. nau-2D//QYm. nau_2D)的單株有348株，雜合抗病基因型(QYm. nau-2D//qym. nau_2D)有714株，純合感病基因型(qym. nau-2D//qym. nau_2D)有349株,卡方測驗(yàn)表明符合I 2 1的分離比。利用F2群體對QYm. nau-2D進(jìn)行精細(xì)定位，采用MAPMAKER3. O軟件計(jì)算遺傳距離，其中標(biāo)記2EST730與QYm. nau-2D. I緊密連鎖，遺傳距離為O. 3cM (圖4)。I、與QYm. nau_2D. I緊密連鎖分子標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)在上述分子標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建和抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I發(fā)掘的研究中，分子標(biāo)記2EST730與QYm. nau_2D. I緊密連鎖(圖4)，并且與QYm. nau_2D. I的遺傳距離為O. 3M。標(biāo)記2EST730的引物是根據(jù)小麥第二同源群上的EST序列(BE423370X公知公用，見參考文獻(xiàn)Qi LL,Echalier B,Chao S,Lazo GR,Butler GE,Anderson OD et al (2004)A chromosome bin map of16, OOOexpressed sequence tag loci and distribution ofgenes among the three genomes of polyploid wheat. Geneticsl68 :701-712),米用在線引物設(shè)計(jì)軟件 Primer3V0. 4. O 設(shè)計(jì)而成(http //frodo. wi. mit. edu/primer3/)。

標(biāo)記2EST730的引物2EST730F AAATCTCCCAAAAAGCTGAC (SEQ ID NO. I)；2EST730R GGGTCTAACATTGGAGAAGG (SEQ ID NO. 2)(圖 3)2、標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R在“儀寧小麥X鎮(zhèn)9523”RIL群體中的分子檢測利用標(biāo)記引物2EST730F (SEQ ID NO. I) /2EST730R (SEQ ID NO. 2)在 RIL 群體的106個家系及其雙親中進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。結(jié)果表明在高抗親本‘儀寧小麥’和78個家系中均擴(kuò)增出約600bp的特異條帶，而在高感親本‘鎮(zhèn)9523’和剩下的28個家系中均未擴(kuò)增出該特異條帶(圖5)。PCR 試劑組成為I μ L DNA 模板(20_100ng)，I. O μ LlO X PCR buffer, 0. 8 μ LMgCl2C 25mmol/L), 0. 8μ L dNTP(2. 5mmol/L)，上、下游引物(10ymol/L)各 O. 2μ L，0. 15μ LTaq DNA polymerase(5U/μ L),5. 85 μ L ddH20 ；PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存。PCR產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比為39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法進(jìn)行染色。3、標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R在F2分離群體中的分子檢測為了進(jìn)一步評價QYm. nau_2D. I的抗病效應(yīng)和精細(xì)定位該QTL，本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合分子標(biāo)記分析和表型鑒定結(jié)果，又從RIL群體中選擇一個高抗家系‘RIL11 - 14’，并構(gòu)建了“RIL11-14X鎮(zhèn)9523”次級F2分離群體(1368個單株)。遺傳分析表明，QYm. nau_2D. I在次級F2分離群體中呈顯性單基因遺傳。利用標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R在F2群體雙親及群體單株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(條件和方法同上)。結(jié)果表明在1368個F2單株中，346株純合抗病單株均擴(kuò)增出與高抗親本‘RIL11-14’ 一致的特異條帶(約600bp)，305株純合感病單株均擴(kuò)增出與高感親本‘鎮(zhèn)9523’ 一致的特異條帶(約595bp)，而711株雜合抗病單株能同時擴(kuò)增兩種特異條帶(圖6)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果和連鎖分析，結(jié)果表明標(biāo)記2EST730與QYm.nau-2D. I之間的遺傳距離為0. 3cM (圖4)。次級F2分離群體和RIL群體的結(jié)果互相驗(yàn)證，即QYm. nau-2D. I既是‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病的主效QTL，又是高抗家系‘RIL11-14’中抗小麥黃花葉病基因，并且標(biāo)記2EST730與QYm. nau_2D. I緊密連鎖。
權(quán)利要求
1.‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標(biāo)記2EST730，其特征在于該分子標(biāo)記2EST730的上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物2EST730R 序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTLQYm. nau_2D. I分子標(biāo)記2EST730，其特征在于所述的分子標(biāo)記2EST730與QYm. nau_2D. I之間的遺傳距離為0.3cM0
3.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記2EST730的引物對，其特征在于上游引物2EST730F序列如SEQID NO. I所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.抗小麥黃花葉病主效QTLQYm.nau-2D. I的分子標(biāo)記方法，其特征在于包括以待鑒定材料的DNA作為模板，用權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記2EST730的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再用銀染法檢測；能擴(kuò)增出約600bp特異條帶的植株為含有抗小麥黃花葉病主效QTL QYm.nau-2D. I的植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗小麥黃花葉病主效QTLQYm.nau-2D. I的分子標(biāo)記方法，其特征在于包括如下步驟 (1)以待鑒定材料的DNA作為模板，用權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記2EST730的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR 試劑組成為PCR 試劑組成為liiL DNA 模板，I. Oii LlO X PCR buffer，0. 8 y LMgCl2，0. LdNTP，上、下游引物各 0. L，0. 15ii L Taq DNA polymerase, 5. 85 u L ddH20 ； PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存； PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測； (2)標(biāo)記引物鑒定QYm.nau-2D. I的結(jié)果為 能擴(kuò)增出約600bp特異條帶的植株為含有QYm. nau-2D. I的植株。
6.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記2EST730在分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記2EST730在選育抗小麥黃花葉病小麥品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了與‘儀寧小麥’抗小麥黃花葉病毒主效QTL QYm.nau-2D.1的分子標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。首先公開了與QTL QYm.nau-2D.1緊密連鎖的分子標(biāo)記2EST730，同時公開了該標(biāo)記的引物2EST730F/2EST730R。在含有QTL QYm.nau-2D.1的材料中，標(biāo)記引物2EST730F/2EST730R擴(kuò)增出約600bp的產(chǎn)物與QYm.nau-2D.1緊密連鎖，遺傳距離為0.3cM。本發(fā)明公開的與QYm.nau-2D.1緊密連鎖分子標(biāo)記，可用于小麥抗黃花葉病分子標(biāo)記輔助選擇育種。
文檔編號C12Q1/68GK102807984SQ20121024684
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者王秀娥, 郭嬌, 吳真真, 朱曉彪, 王海燕, 曹愛忠, 肖進(jìn) 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)