專利名稱：中國醬香型白酒生產(chǎn)中高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母cgmcc 4748的篩選與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母的篩選方法，及應(yīng)用該方法在中國醬香型白酒生產(chǎn)中篩選高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母及其在食品工藝、釀造酒工業(yè)中的應(yīng)用。屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙醇是釀造酒中最重要也是最主要的成分之一，中國白酒中乙醇含量高達40% 55% (v/v);黃酒中為14% 20% ;啤酒中為2% 5%。酵母是產(chǎn)生乙醇的主要微生物，也是釀造酒工業(yè)中不可缺少的微生物。因此，尋找高產(chǎn)乙醇的酵母能夠優(yōu)化釀造工藝，降低生產(chǎn)成本，在釀酒行業(yè)中具有重要的意義。雜醇油是酵母在釀酒發(fā)酵中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，包括正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、仲戊醇、己醇和庚醇等。它是白酒中醇甜和助香劑的主要物質(zhì),對形成酒的風味和促使酒體豐滿、濃厚起著重要的作用。適宜的雜醇油含量及各種雜醇油之間的比例協(xié)調(diào)可使酒的口感柔和協(xié)調(diào)、酒體豐滿圓潤和味道獨特，但白酒中如雜醇油含量過高，不僅會導致產(chǎn)品辣、苦、澀，影響酒的口感，而且對人體有毒害作用。雜醇油在人體內(nèi)氧化速度較乙醇慢，停留時間長，會引起頭痛，神經(jīng)系統(tǒng)充血等癥狀。雜醇油同時也是造成白酒出現(xiàn)白色渾濁的原因之一，因此其含量必須控制在一定范同內(nèi)，國標規(guī)定白酒中雜醇油的含量為彡O. 20g/100 mL(以白酒中含量最大的異丁醇、異戊醇計)。目前，在傳統(tǒng)的釀造酒中，雜醇油含量普遍偏高的問題已經(jīng)廣泛引起了業(yè)界的關(guān)注。因此，為降低其雜醇油含量，使其控制在合適的范圍內(nèi)，生產(chǎn)上已采取了種種措施，如采用低溫發(fā)酵、優(yōu)化用曲量等。但由于其工藝復(fù)雜，影響因素繁多，生產(chǎn)中還未得到很好的解決。最根本的措施是采用低產(chǎn)雜醇油的酵母菌種進行發(fā)酵，但是，雜醇油是酵母在乙醇發(fā)酵過程中的必然副產(chǎn)物,高產(chǎn)乙醇能力的菌株產(chǎn)雜醇油能力一般也較強，因此高產(chǎn)乙醇與低產(chǎn)雜醇油往往難于兩全。目前，也有通過誘變選育低產(chǎn)雜醇油的酒精酵母菌株的報道，但在釀造工業(yè)中存在回復(fù)突變等問題，生產(chǎn)上存在風險。因此只有選育低產(chǎn)雜醇油且高產(chǎn)乙醇的野生酵母才是最根本的解決手段。本發(fā)明所篩選獲得的酵母是從中國多家名醬香型白酒廠的各種大曲或釀造酒醅中篩選所得，具有高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的功能。該菌株為首次從中國白酒釀造過程中獲得的高產(chǎn)乙醇且低產(chǎn)雜醇油的酵母。該菌株是優(yōu)良的釀酒功能菌株。該菌株能夠有效應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造酒工業(yè)，優(yōu)化釀造酒生產(chǎn)工藝，降低釀造酒生產(chǎn)成本，提高酒類品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
( I)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明要解決的一個技術(shù)問題是提供高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株，本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供了高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株的篩選方法，以及將所得的酵母應(yīng)用于釀造酒工業(yè)中。(2)本發(fā)明的技術(shù)方案
高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母,其分類命名為少孢酵母GfazacAsiaflia exigua)
保藏編號CGMCC No. 4748，上述菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株的篩選
所述的高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母的篩選方法，在中國醬香型白酒生產(chǎn)中將大曲、酒醅、釀造原料或釀造環(huán)境物質(zhì)與無菌水混合后，經(jīng)過稀釋涂布TTC初篩平板，挑選紅色顯著的菌落，再轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)進行復(fù)篩，發(fā)酵液分別采用蒸餾比重法和HS-SPME-GC-MS測定乙醇及雜醇油含量，篩選獲得產(chǎn)乙醇濃度高以及產(chǎn)雜醇油濃度低的菌株。取O. 5 5g大曲、酒醅、釀造原料或釀造環(huán)境物質(zhì)溶于15 150mL無菌生理鹽水搖床振蕩30 150min，再稀釋，涂布TTC初篩平板。TTC初篩培養(yǎng)TTC上層培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，瓊脂15，121°C滅菌20min，冷卻至60°C左右時，加入TTC溶液(三苯基四氮唑鹽酸鹽，終濃度O. 5)后，立即傾倒底層平板。TTC下層培養(yǎng)基=YPD瓊脂。涂布TTC初篩平板后30°C培養(yǎng)24h，長出可見菌落后，倒入約12mLTTC上層培養(yǎng)基覆蓋原來菌落，之后在30°C下避光保溫2 3h，由菌落的呈色來判斷酵母產(chǎn)酒精能力。TTC初篩挑選紅色顯著的菌落，再轉(zhuǎn)接于搖瓶培養(yǎng)進行復(fù)篩，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件為接種量為O. I X IO6 5X IO6個/mL，培養(yǎng)基為采用YPD、高粱汁或麥芽汁液體培養(yǎng)基，高粱汁或麥芽汁制作方式為20 200g高粱或麥芽樣品經(jīng)粉碎后，加mL/g計I 4倍的水，蒸煮l_5h，呈糊狀，冷卻后加入10 50U/g的糖化酶，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，糖度為1(Γ 5°Βχ ;調(diào)節(jié)pH為2 5，25 35°C，150rpm,搖瓶培養(yǎng)24 120h。所述的高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母的應(yīng)用，在各種釀造酒、蒸餾酒、配制酒的釀酒工業(yè)和食品工業(yè)中的應(yīng)用。高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母在釀造酒工業(yè)中的應(yīng)用將該菌株制成液體或固體菌制劑，添加于釀造酒釀造過程中，能夠有效增加釀造中該菌株的生物量，并有效提聞乙醇的含量，減少雜醇油的生成，最終提聞釀造酒的品質(zhì)。乙醇濃度測定蒸餾比重法測定乙醇濃度。同時用減重法測定CO2釋放質(zhì)量。雜醇油濃度測定采用HS-SPME-GC-MS方法，15 mL頂空瓶中加入5 10 mL澄清發(fā)酵液，I 5 g NaCl，以4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標，進行頂空固相微萃取。頂空固相微萃取的條件為三相(Car/DVB/PDMS)萃取頭，60 °C預(yù)熱5 10 min，萃取吸附30 50 min,GC解吸5 10 min。(3)有益效果
本發(fā)明所篩選獲得的酵母是從中國醬香型白酒釀造過程中篩選所得，具有高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的功能。該批菌株為首次從中國白酒釀造過程中獲得的高產(chǎn)乙醇且低產(chǎn)雜醇油的釀酒酵母。該批菌株每株都是優(yōu)良的釀酒功能菌株。這些菌株能夠有效應(yīng)用于釀造酒行業(yè)，優(yōu)化釀造酒生產(chǎn)工藝，降低釀造酒生產(chǎn)成本，提高酒質(zhì)。生物材料樣品保藏中國醬香型白酒生產(chǎn)中高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母,其分類命名為異常畢赤酵母(/7ZcAia anomala ) BJY-1,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No. 4740，保藏日期2011年4月6日；
粟酒裂殖酵母pombe)BJY-5,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4744，保藏日期2011年4月6日；
拜爾接合酵母iZygosaccharomyces baiIii )BJY-6,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4745，保藏日期2011年4月6日；
絲孢酵母(Tri chosporon asahi I ) BJY-7, 已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4746，保藏日期2011年4月6日；
釀酒酵母iSaccharomyces cerevisiae) BJY-8,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4747，保藏日期2011年4月6日；
少孢酵母exigua ) BJY-9,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4748，保藏日期2011年4月6日；
發(fā)酵畢赤酵母(picAia fermentans') BJY-II,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4750，保藏日期2011年4月6日。


圖I.異常畢赤酵母Cft'cAiaCGMCC No. 4740細胞形態(tài)電鏡照片。圖2.少抱酵母exigua ) CGMCC No. 4748 細胞形態(tài)電鏡照片。圖3.釀酒酵母(cerevisiae ^) CGMCC No. 4747 高梁汁發(fā)酵培養(yǎng)釋放CO2時間曲線。圖4.發(fā)酵畢赤酵母fermentans^ CGMCC No. 4750高梁汁發(fā)酵培養(yǎng)釋放CO2時間曲線。
具體實施例方式實施例I :高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株的篩選
取O. 5g酒醅溶于15mL無菌生理鹽水搖床振蕩30分鐘，再稀釋，涂布TTC初篩平板，挑選紅色顯著的菌落，再轉(zhuǎn)接于搖瓶培養(yǎng)進行復(fù)篩，發(fā)酵液分別采用蒸餾比重法和HS-SPME-GC-MS測定乙醇及雜醇油含量，篩選獲得乙醇濃度高以及雜醇油濃度低的菌株。TTC初篩培養(yǎng)TTC上層培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，瓊脂15，121°C滅菌20min，冷卻至60°C左右時，加入TTC溶液(三苯基四氮唑鹽酸鹽，終濃度O. 5)后，立即傾倒底層平板。TTC下層Yro瓊脂。30°C培養(yǎng)24h，長出可見菌落后，倒入約12mL TTC上層培養(yǎng)基覆蓋原來菌落，之后在30°C下避光保溫2 3h，由菌落的呈色來判斷酵母產(chǎn)酒精能力。搖瓶培養(yǎng)條件為接種量為O. I X IO6 5X IO6個/mL，培養(yǎng)基條件為采用麥芽汁培養(yǎng)基，制作方式為20g麥芽樣品經(jīng)粉碎后，加I 4倍體積的水，蒸煮l_5h，呈糊狀，冷卻后加入10 50單位/g的糖化酶，于40 80°C保持2 10h，過濾、離心所得濾液，糖度為IO0Bx ;調(diào)節(jié) pH 為 4 5，25 35°C，150rpm,搖瓶培養(yǎng) 24 120h。實施例2 :高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母及其分子生物學鑒定
對獲得的不同高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母進行分子生物學鑒定，利用酵母特異分類鑒定引物分別擴增菌株的26srDNA片段，經(jīng)凝膠電泳檢測。隨后進行測序比對，確定所篩得酵母的種屬。將菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，酵母種屬及保藏編號見表I。表I高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母
權(quán)利要求
1.高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母,其分類命名為 少孢酵母ejrigwa) BJY_9,保藏編號CGMCC No. 4748,以上菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.權(quán)利要求I所述的高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母的應(yīng)用，其特征在于在各種釀造酒、蒸餾酒、配制酒的釀造工業(yè)和食品工業(yè)中的應(yīng)用。
全文摘要
中國醬香型白酒生產(chǎn)中高產(chǎn)乙醇低產(chǎn)雜醇油的酵母CGMCC4748的篩選與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。所述菌株為少孢酵母CGMCC4748。菌株是從中國多家名酒廠的各種大曲、酒醅、釀造原料、釀造環(huán)境中分離得到，其篩選方法是取曲樣、酒醅、釀造原料或釀造環(huán)境物質(zhì)，經(jīng)過稀釋涂布TTC初篩平板，挑選紅色顯著的菌落，再轉(zhuǎn)接于搖瓶培養(yǎng)進行復(fù)篩，發(fā)酵液分別采用蒸餾比重法和HS-SPME-GC-MS測定乙醇及雜醇油含量，篩選獲得乙醇濃度高以及雜醇油濃度低的菌株。該菌株可應(yīng)用于食品工業(yè)、釀造酒工業(yè)中。
文檔編號C12G3/04GK102766583SQ201210248838
公開日2012年11月7日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者吳群, 徐巖, 陳良強 申請人:江南大學