專(zhuān)利名稱(chēng)：特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)、食品與衛(wèi)生檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及特異識(shí)別沙門(mén)氏菌(血清型08，以下簡(jiǎn)稱(chēng)沙門(mén)氏菌08)的寡核苷酸適配子的用途。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)外在食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)時(shí)常用的檢測(cè)方法因其檢測(cè)手段、識(shí)別對(duì)象各有不同而各具優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法需要先分離再培養(yǎng)，然后用經(jīng)典的方法鑒定，耗時(shí)、不靈敏是這些方法普遍存在的問(wèn)題。免疫學(xué)方法簡(jiǎn)單、方便、迅速、特異性較好，但是仍有交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽(yáng)性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)雖具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)，但其在檢測(cè)數(shù)目較多的樣品時(shí)操作比較繁雜，因此在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出很多新型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，如多重 PCR技術(shù)，然而多重PCR雖簡(jiǎn)化了 PCR實(shí)驗(yàn)的操作，但是由于該技術(shù)需數(shù)對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，很容易產(chǎn)生非特異性條帶或假陽(yáng)性，影響檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment, SELEX)技術(shù)篩選獲得的寡核苷酸序列稱(chēng)為適配子(aptamer)。其原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，其隨機(jī)序列長(zhǎng)度在20-100個(gè)堿基左右，將隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子相互作用，保留結(jié)合的寡核苷酸配基，經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得靶分子的特異寡核苷酸配基。該技術(shù)具有庫(kù)容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在臨床檢測(cè)方面，特別是對(duì)ー些未知的致病性細(xì)菌或病毒的研究，雖然不知道其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能以及這些物質(zhì)的表位，但將其作為靶物質(zhì)，通過(guò)SELEX技術(shù)篩選到其相應(yīng)的適配子，以檢測(cè)靶物質(zhì)，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。利用SELEX技術(shù)篩選獲得的適配子識(shí)別分子的模式與蛋白抗體類(lèi)似，但與蛋白類(lèi)抗體相比，核酸類(lèi)配基具有更多的優(yōu)越性，如不受免疫條件和免疫源性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并有利于長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸?shù)?。更重要的是，適配子的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸、細(xì)胞因子、輔因子、氨基糖苷、抗生素、堿基類(lèi)似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白質(zhì)類(lèi)靶分子最多，包括酶、生長(zhǎng)因子、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒和細(xì)菌病原體，甚至完整的細(xì)胞也可以通過(guò)復(fù)合靶子SELEX技術(shù)或消減SELEX技術(shù)篩選出高親和カ的寡核苷酸配基。適配子比抗體具有更高的特異性和精確識(shí)別能力，甚至能識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)分子。這些特性使得適配子在生物醫(yī)藥和食品衛(wèi)生研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為不可缺少的有力工具。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有沙門(mén)氏菌檢測(cè)中存在的檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低、假陽(yáng)性多等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子的應(yīng)用。特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下5’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’，特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子是一條78個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈DNA。本發(fā)明通過(guò)SELEX技術(shù)的篩選過(guò)程，獲得高親和性特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子，用于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)沙門(mén)氏菌08。本發(fā)明以倉(cāng)源性沙門(mén)氏菌08為目的靶分子，同時(shí)以大腸桿菌086:K61和豬霍亂沙門(mén)氏菌為反篩菌，獲得了一條沙門(mén)氏菌08特異的適配子。本方法具有檢測(cè)時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在食品與衛(wèi)生安全檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。


圖I為單鏈寡核苷酸(ssDNA)富集庫(kù)與沙門(mén)氏菌08結(jié)合率的測(cè)定結(jié)果圖。圖2 A為寡核苷酸適配子10號(hào)與沙門(mén)氏菌08靈敏度測(cè)定結(jié)果圖。圖2 B為寡核苷酸適配子9號(hào)與沙門(mén)氏菌08靈敏度測(cè)定 結(jié)果圖。圖3A為熒光顯微鏡觀察熒光基團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸適配子10號(hào)與大腸桿菌結(jié)合比較圖。圖3B為熒光顯微鏡觀察熒光基團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸適配子10號(hào)與豬霍亂沙門(mén)氏菌結(jié)合比較圖。圖3C為突光顯微鏡觀察突光基團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸適配子10號(hào)與沙門(mén)氏菌08結(jié)合比較圖。圖3D為熒光顯微鏡觀察熒光基團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸適配子10號(hào)與雙蒸水結(jié)合洗脫后空白對(duì)照?qǐng)D。
具體實(shí)施例方式特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’ ；特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子是一條78個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈DNA。本發(fā)明通過(guò)SELEX技術(shù)的篩選過(guò)程，獲得高親和性特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子，用于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)沙門(mén)氏菌08。下面通過(guò)SELEX篩選獲得沙門(mén)氏菌08特異的寡核苷酸適配子，并對(duì)其中親和カ最高的一條寡核苷酸適配子對(duì)沙門(mén)氏菌08識(shí)別和鑒定作進(jìn)ー步說(shuō)明。I.隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物由上海生物工程有限公司合成 隨機(jī)單鏈 DNA 文庫(kù)5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-
35nt-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’ (注nt 代表 A、T、C、G 堿基中任意ー種)
引物 I : 5 ’ - GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’
引物 II : 5 ’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3，
引物III : 5’-地高辛- GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’
引物IV :5’ -生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3’。2.沙門(mén)氏菌08 {Salmonella嫩)的制備
沙門(mén)氏菌08 {Salmonella 08’購(gòu)自中國(guó)エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)15 18小時(shí)，刮取菌苔于O. 9%無(wú)菌生理鹽水試管，6000 rpm 4°C離心10 min，洗滌菌體3次，棄上清，重懸于O. 9%無(wú)菌生理鹽水，用比濁儀調(diào)濁度為O. 5，約相當(dāng)于I. 5X 108/ml沙門(mén)氏菌08菌懸液。3. SELEX篩選獲得沙門(mén)氏菌08特異的寡核苷酸適配子
I)SELEX篩選過(guò)程
a.首輪篩選，取合成的隨機(jī)單鏈DNA1/3 OD (I(^g)加入到400ul IX結(jié)合緩沖液，95度變性5min，然后迅速置于冰上IOmin ； b.加入ImL菌懸液I.5X IO8 ,于37° C搖床100 rpm結(jié)合I小時(shí)(以后可減少結(jié)合時(shí)間)，使單鏈DNA文庫(kù)與菌充分作用；
c.更換離心管，以去除與管壁結(jié)合的單鏈DNA,室溫下離心10000 rpm離心 IOmin分離未與菌結(jié)合的單鏈DNA文庫(kù)；
d.棄上清,加入600μ IX沖洗緩沖液,離心10 000 rpm離心IOmin,重復(fù)此過(guò)程4次，目的是洗去未與菌結(jié)合的核酸片段；
e.接上步離心后去上清，加入IOOPL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 000rpm離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中)，-20° C保存?zhèn)溆谩?) PCR富集與沙門(mén)氏菌08特異結(jié)合的寡核苷酸適配子
每輪篩選后獲得的與沙門(mén)氏菌08特異結(jié)合的寡核苷酸適配子文庫(kù)通過(guò)PCR擴(kuò)增得到富集；
a.以上述上清為模板，通過(guò)引物I和引物IV擴(kuò)增產(chǎn)生一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA；
b.PCR擴(kuò)增條件95° C預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30循環(huán)95° C變性30s，60° C退火30s，72。C 延伸 30s，最后 72。C 延伸 IOmin ;
c.PCR產(chǎn)物純化后，一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA通過(guò)生物素-鏈親合素之間的作用與鏈親合素交聯(lián)的磁珠結(jié)合，經(jīng)過(guò)IX連接(the standard Binding and Washing Buffer,B&ff)緩沖液洗滌3次，用IOOmM的新鮮NaOH 37° C變性30 min,使不帶生物素的單鏈DNA從鏈親合素交聯(lián)的磁珠上洗脫下來(lái)，測(cè)定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫(kù)。3)重復(fù)篩選重復(fù)上述SELEX篩選過(guò)程和PCR擴(kuò)增富集過(guò)程，共進(jìn)行9輪篩選，其中第5、8輪分別用大腸桿菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌進(jìn)行反篩。4)富集寡核苷酸適配子與菌結(jié)合率的測(cè)定
a.第1、3、5、7、9、11輪SELEX篩選的產(chǎn)物，以標(biāo)記地高辛的引物III和標(biāo)記生物素的引物IV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化的PCR產(chǎn)物與鏈親和素標(biāo)記的磁珠充分反應(yīng)并用NaOH解鏈，地高辛標(biāo)記的單鏈DNA游離在上清中；
b.按單鏈DNA:沙門(mén)氏菌08=300pmol:l. 5X108在IX結(jié)合緩沖液中結(jié)合，離心，棄上清，加入抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶反應(yīng)15 min,重復(fù)洗漆,洗去未與沙門(mén)氏菌08上單鏈DNA-地高辛結(jié)合的抗地高辛抗體結(jié)合的堿性磷酸酶，以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)顯色，終止反應(yīng)后用酶聯(lián)儀于405 nm測(cè)定吸光度A值，見(jiàn)圖I。5)富集寡核苷酸適配子文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果與分析
a.將最后的富集文庫(kù)擴(kuò)增為雙鏈，連接pEGM-Τ載體，轉(zhuǎn)化^:coli DH5 α，隨機(jī)挑取22個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定，其中19個(gè)為可用序列，見(jiàn)表I ;
b.采用ClustalW、RNA STRUCTURE和DNAMAN軟件分析19條序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性并進(jìn)行ニ級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；
c.結(jié)合親和力高低和配基高級(jí)結(jié)構(gòu)，選出親和カ最高、能級(jí)較低的兩條寡核苷酸適配子的序列(寡核苷酸適配子10號(hào)、寡核苷酸適配子9號(hào))，進(jìn)行下一歩的鑒定。4.熒光基團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸適配子(寡核苷酸適配子10號(hào))與沙門(mén)氏菌08的熒光顯微鏡鑒定
1)將寡核苷酸適配子10號(hào)序列送上海生物工程有限公司合成并在5’端標(biāo)記羥基熒光素(FAM)。5’-FAM-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’ ；
2)將FAM標(biāo)記的寡核苷酸適配子10號(hào)分別與沙門(mén)氏菌08，豬霍亂沙門(mén)氏菌和大腸桿菌在IX結(jié)合緩沖液中結(jié)合，37° C孵育I小吋，離心棄上清，洗滌數(shù)次，直到上清沒(méi)有熒光為止；
3)將菌沉淀用10μ IX洗滌緩沖液重懸，涂在載玻片上，過(guò)火固定； 4)將載玻片置于緩沖液中洗滌2-3次，2分鐘/次，最后用無(wú)菌蒸餾水沖洗2秒鐘；
5)晾干，加封片劑、蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)合情況見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過(guò)SELEX篩選和親和カ分析，獲得了一條親和カ最高、能級(jí)最低的沙門(mén)氏菌08特異的寡核苷酸適配子10號(hào)，且對(duì)寡核苷酸適配子10號(hào)序列進(jìn)行熒光基團(tuán)標(biāo)記應(yīng)用后，上顯微鏡能明顯觀察到與沙門(mén)氏菌08發(fā)生特異性的結(jié)合。由圖I可見(jiàn)，隨著篩選輪數(shù)的増加，單鏈DNA富集庫(kù)的結(jié)合力逐漸增加，第9輪篩選獲得了很好的親和力，但當(dāng)沙門(mén)氏菌上的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到ー個(gè)飽和狀態(tài)時(shí)，吸附到沙門(mén)氏菌上的單鏈DNA就不再增加。表I為SELEX篩選獲得的寡核苷酸適配子序列 寡核苷酸適配子I號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCCACACCCCACAACCACCCAGCCCCAGCCCGCTATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子2號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACAACACCCAGCCAACGACCACAACTCCAACTCATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子3號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAAACCACAACCCAACAACAAGAACCACAAAGAGCCCCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子4號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACACACAGAACCACAACCACTAAACACGAGGGCCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子5號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子6號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC寡核苷酸適配子7號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子8號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCGAACGACTCAAAGATCAAGCCAAGCCACGCCCGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子9號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACCCAACACCAAAGAGACCACCACCACACGAGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子10號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子11號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACGAGCCACCAACGCACCAAAACCCGTCCTCCACTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子12號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGCACGCGCACCAAAACACAAACTCCCCCCGCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子13號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGCCACCTAACCACCTCTGCCAATACCCCCCGCGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子14號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGAAGTCATGGCATGGATGCGCTCCCCGCCCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子15號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGAAGTCATGGCATGGATGCGCTCCCCGCCCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子16號(hào)
GATCCGGGCCTCATGTCGAACGGCGCAGTGACACGGTAGGGAGTCGTGCCGCGGCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸適配子17號(hào)
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGTGGGCGGGCGGCGTTGCTGTTCTTTTGCTGGTGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
寡核苷酸適配子18號(hào)
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGAGGCGGCCTGTTCGCTTGTTGTGGGTCCGCTTGGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
寡核苷酸適配子19號(hào)
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGCACTGGGTGGTGATGTTTTGTTTGTCTGGCGGTTCGACATGAGGCCC
GGATC寡核苷酸適配子20號(hào)
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGGGGGTGGAGGGGTATGCAGTTTCGGTGGCCGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
表I列出了 20條序列,一般來(lái)說(shuō)，自由能最低的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。我們選擇自由能較低的寡核苷酸適配子10號(hào)和寡核苷酸適配子9號(hào)來(lái)測(cè)定其親和力。由圖2可見(jiàn)，寡核苷酸適配子10號(hào)的解離常數(shù)(Kd)為32. 04，寡核苷酸適配子9號(hào)的解離常數(shù)(Kd)為175.9。根據(jù)解離常數(shù)(Kd)值越低，適體的親和カ就越高，最終我們挑選寡核苷酸適配子10號(hào)為最優(yōu)適配體，并做進(jìn)一歩驗(yàn)證。由圖3可以得到結(jié)論熒光基團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸適配子10號(hào)能特異識(shí)別沙門(mén)氏菌08，有較強(qiáng)的熒光，而與大腸桿菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌無(wú)明顯結(jié)合，只存在極少量的熒光。
總之，篩選得到的寡核苷酸適配子10號(hào)能特異識(shí)別沙門(mén)氏菌08，敏感性高、速度快，該發(fā)明可用于檢測(cè)試劑盒的制備。本發(fā)明用于特異性檢測(cè)沙門(mén)氏菌08的具體方法如實(shí)施例中步驟4。
權(quán)利要求
1.特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子的用途，所述寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’，其特征在于所述寡核苷酸適配子是一條78個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈DNA，其在沙門(mén)氏菌08檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異識(shí)別沙門(mén)氏菌的寡核苷酸適配子的用途。所述寡核苷酸適配子是一條78個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈DNA，其在沙門(mén)氏菌O8檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明以食源性沙門(mén)氏菌O8為目的靶分子，同時(shí)以大腸桿菌O86:K61和豬霍亂沙門(mén)氏菌為反篩菌，獲得了一條沙門(mén)氏菌O8特異的適配子。本方法具有檢測(cè)時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在食品與衛(wèi)生安全檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/115GK102808022SQ20121025865
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者余曉峰, 張萍, 宗凱, 孫娟娟, 李云飛, 陳雪嬌, 鄭海松 申請(qǐng)人:安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心