專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)輔酶Q₁₀新菌株彭氏變形桿菌CA8及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)輔酶Qltl新菌株一彭氏變形桿菌CA8及其在微生物發(fā)酵制備輔酶Qltl中的應(yīng)用，屬于微生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
輔酶Qki (CoenzymeQic^C0Qici)廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)，是生物細(xì)胞呼吸鏈中重要的遞氫體，也是一種良好的生化藥物。它具有抗氧化性、消除自由基、提高機(jī)體免疫力等功能，已廣泛應(yīng)用于各類(lèi)心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。制備輔酶Qltl的方法主要有動(dòng)物細(xì)胞提取法、煙葉茄尼醇半合成法、完全合成法、微生物發(fā)酵法或植物細(xì)胞培養(yǎng)法。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法具有產(chǎn)物活性高、原料成本低、易控制及可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。獲得優(yōu)良的發(fā)酵菌株是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Qltl的 關(guān)鍵之一。目前已報(bào)道的輔酶Qltl發(fā)酵菌株主要屬于假單孢菌屬、酵母菌屬、光合細(xì)菌屬以及副球菌屬等。發(fā)酵菌體提取輔酶Qltl方法多為醇?jí)A皂化后提取方法，步驟煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且提取溶劑損耗較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一株產(chǎn)輔酶Qltl產(chǎn)量較佳的新菌株，以及利用該菌種發(fā)酵液制備輔酶Qltl的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一株輔酶Qltl產(chǎn)生菌-彭氏變形桿菌(Proteus penneri ) CA8,保藏于中國(guó)典型
培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCC No :M2012208，保藏日期2012年6月10日。所述彭氏變形桿菌CA8特征如下菌株在LB瓊脂平板上培養(yǎng)I天后呈半透明潤(rùn)澤，較小，圓形，表面光滑，易挑起；菌體呈桿狀，大小為(O. 4 1.0) μ mX (O. 8 1.8)μπι，具周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢；兼性厭氧，苯丙氨酸試驗(yàn)呈陽(yáng)性，氧化酶反應(yīng)、明膠水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸試驗(yàn)、V-P反應(yīng)呈陰性，利用葡萄糖、乳糖等產(chǎn)酸，不利用水楊苷，最適宜生長(zhǎng)溫度為37°C。本發(fā)明的CA8菌株，分離自嘻麥隆Ebolowa 土壤，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、BiologGENIII鑒定和16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)該菌株屬于彭氏變形桿菌，命名為Proteus penneri CA8。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到有關(guān)變形桿菌應(yīng)用于在輔酶Qltl生產(chǎn)的研究報(bào)道。本發(fā)明發(fā)酵菌體的超聲破碎和提取輔酶Qltl的工藝同樣未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明還涉及所述的彭氏變形桿菌CA8在微生物發(fā)酵制備輔酶Qltl中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為以彭氏變形桿菌CA8接種于適用于彭氏變形桿菌的液體培養(yǎng)基，于3(T37°C下培養(yǎng)48飛Oh，所得發(fā)酵液離心收集濕菌體，濕菌體經(jīng)破碎提取得到所述的輔酶
Qio。
所述適用于彭氏變形桿菌的液體培養(yǎng)基為常規(guī)適用于彭氏變形桿菌的液體培養(yǎng)基，本發(fā)明中可按如下組成配制碳源l(T20g、氮源5 15g、KH2PO4 O. 5g、Na2HPO41. 5g、MgSO4 O. 5g,水 1000ml, pH6. 0 8. 0。所述碳源為常規(guī)用于培養(yǎng)基配制的碳源，如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖等，優(yōu)選為乳糖。所述氮源為常規(guī)用于培養(yǎng)基配制的碳源，如酵母膏、硫酸銨等，優(yōu)選為酵母膏。更為優(yōu)選的，所述適用于彭氏變形桿菌的液體培養(yǎng)基按如下組成配制加入乳糖40g、酵母膏 40g、KH2PO4 O. 5g、Na2HPO41. 5g、MgSO4O. 5g，水 1000ml，ρΗ8· 0。優(yōu)選的，所述破碎提取為超聲破碎提取，方法如下將濕菌體移入離心管內(nèi)，加入足量乙醇，混勻，30(T500W超聲處理8 IOmin后，離心，過(guò)濾，于濾液中得到所述輔酶Q1(1。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株新的輔酶Qltl產(chǎn)生菌，利用該菌株微生物發(fā)酵制備輔酶Qltl,產(chǎn)量高，且后續(xù)提取方法簡(jiǎn)單，利于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為彭氏變形桿菌(Proteus penneri) CA8的電鏡圖(X 30000)；圖2為不同碳源對(duì)CA8輔酶Qltl產(chǎn)量的影響；圖3為不同氮源對(duì)CA8輔酶Qltl產(chǎn)量的影響；圖4為乳糖濃度對(duì)CA8輔酶Qltl產(chǎn)量的影響；圖5為酵母膏濃度對(duì)CA8輔酶Qltl產(chǎn)量的影響；圖6為溫度對(duì)輔酶Qltl產(chǎn)量的影響；圖7為裝液量對(duì)輔酶Qltl產(chǎn)量的影響；圖8為初始pH值對(duì)輔酶Qltl產(chǎn)量的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例彭氏變形桿菌(Proteus penneri)CA8的分離、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)輔酶Qltl特性1、菌株的分離(I)采集樣品采集嘻麥隆Ebolowa 土壤樣品后,取IOg,加無(wú)菌水90ml,制成土壤懸浮液。吸取上清液用無(wú)菌水稀釋制成10' 10_2、10' 10_4、10_5、10_6不同稀釋度。(2)菌株分離取菌懸液1ml，于選擇性平板上劃線，選擇性培養(yǎng)基按如下組成配制異戊二烯O. 5ml, (NH4)2SO41. 0g, KH2PO4 4. 5g, Na2HPO4 · 12H20 21. 6g,瓊脂 15 20g,水 1000ml,ρΗ7· O。按照微生物純種分離的常規(guī)方法，將上述分離培養(yǎng)基于28°C放置2 3d。挑取多個(gè)單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基上，并編號(hào)保存。再在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵性檢驗(yàn)，結(jié)果得到一株輔酶Qltl產(chǎn)量較高的菌株CA8。所用的培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏 10g，KH2PO4 0. 5g, Na2HPO41. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，水 1000ml，pH7. 0。(如為固體培養(yǎng)基，則再加入20g/L的瓊脂)。2、菌株的鑒定(I)輔酶Qltl生產(chǎn)菌CA8的菌體及菌落形態(tài)特征輔酶Qltl生產(chǎn)菌CA8為桿狀，大小為(O. 4 1.0) μ mX (O. 8 1. 8) μ m，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢， 具周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；菌落呈半透明潤(rùn)澤，較小，圓形，表面光滑，易挑起。(2)輔酶Qltl生產(chǎn)菌CA8的生理生化特征生理生化特征為兼性厭氧，苯丙氨酸試驗(yàn)呈陽(yáng)性，氧化酶反應(yīng)、明膠水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸試驗(yàn)、V-P反應(yīng)呈陰性，利用葡萄糖、乳糖等產(chǎn)酸，不利用水楊苷。上述菌學(xué)特征與文獻(xiàn)(伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè))編錄的彭氏變形桿菌的生理生化性狀相吻合。結(jié)合菌株的16S rRNA序列同源性分析和Biolog系統(tǒng)分析結(jié)果，該菌珠鑒定為屬于彭氏變形桿菌的產(chǎn)輔酶Qltl新菌珠。3、產(chǎn)輔酶Qltl性能將彭氏變形桿菌(Proteus penneri ) CA8以5%接種量,接種于500ml裝有IOOml液體培養(yǎng)基(20g 碳源，IOg 蛋白胨，IOg 酵母膏，KH2PO4O. 5g, Na2HPO41. 5g,MgSO4 O. 5g，水補(bǔ)足至1000ml，pH7. O)的搖瓶中，以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖這幾種常用碳源作為發(fā)酵的碳源，考察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)總量和輔酶Qltl總量的影響，進(jìn)行碳源的單因素研究。結(jié)果如圖2所示，表明碳源的利用對(duì)菌生長(zhǎng)量和輔酶Qltl產(chǎn)量影響較不均勻。從菌生長(zhǎng)量和輔酶Qltl產(chǎn)量之間的比例關(guān)系來(lái)看，乳糖為最佳碳源。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行乳糖濃度添加的影響研究，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)乳糖添加量為40g/L時(shí)輔酶Qltl產(chǎn)量較高。將彭氏變形桿菌(Proteus penneri)CA8以5%接種量,接種于液體培養(yǎng)基(40g乳糖，IOg 氮源，KH2PO4 O. 5g，Na2HPO41. 5g，MgSO4 O. 5g，水補(bǔ)足至 1000ml, ρΗ7· 0)，氮源的結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明有機(jī)氮源中以酵母膏為最佳，其與無(wú)機(jī)氮源硫酸銨比較，無(wú)機(jī)氮源不利于菌體生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行酵母膏濃度添加的影響研究，結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示當(dāng)酵母膏添加量為40g/L時(shí)輔酶Qltl產(chǎn)量較高。分別考察不同溫度、裝液量、初始pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)總量和輔酶Qltl總量的影響。結(jié)果如圖6、圖7、圖8所示，表明當(dāng)溫度、裝液量、初始pH分為30°C、80ml、8. O時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)輔
酶Qki最佳。在此條件下，由菌株彭氏變形桿菌(Proteus penneri) CA8發(fā)酵產(chǎn)輔酶Qltl的產(chǎn)量最高，達(dá)到了 105. lmg/L,比優(yōu)化前提高了 500%。
權(quán)利要求
1.一株輔酶Q1O產(chǎn)生菌-彭氏變形桿菌(Proteus penneri) CA8,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCC No :M2012208，保藏日期2012年6月10日。
2.如權(quán)利要求1所述的彭氏變形桿菌CA8在微生物發(fā)酵制備輔酶Qltl中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以彭氏變形桿菌CA8接種于適用于彭氏變形桿菌的液體培養(yǎng)基，于3(T37°C下培養(yǎng)48飛0h，所得發(fā)酵液離心收集濕菌體， 濕菌體經(jīng)破碎提取得到所述的輔酶Q1q。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述適用于彭氏變形桿菌的液體培養(yǎng)基按如下組成配制碳源 l(T20g、氮源 5 15g、KH2PO4O. 5g、Na2HPO4L 5g、MgSO4O. 5g，水 1000ml, ρΗ6· 0 8· O。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述碳源為乳糖。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述氮源為酵母膏。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述適用于彭氏變形桿菌的液體培養(yǎng)基按如下組成配制加入乳糖 40g、酵母膏 40g、KH2PO4O. 5g、Na2HPO4L 5g、MgSO4O. 5g，水 1000ml, pH8. O0
8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述破碎提取為超聲破碎提取，方法如下將濕菌體移入離心管內(nèi)，加入足量乙醇,混勻，30(T500W超聲處理8 IOmin后，離心，過(guò)濾，于濾液中得到所述輔酶Q1(l。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)輔酶Q10新菌株——彭氏變形桿菌CA8及其在微生物發(fā)酵制備輔酶Q10中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCCNoM 2012208，保藏日期2012年6月10日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株新的輔酶Q10產(chǎn)生菌，利用該菌株微生物發(fā)酵制備輔酶Q10，產(chǎn)量高，且后續(xù)提取方法簡(jiǎn)單，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102994409SQ201210260349
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者鐘衛(wèi)鴻, 孔卓怡, 柳華貴, 鐘莉, 邱樂(lè)泉, 吳石金 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)