芍藥乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因及其編碼產(chǎn)物和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因及其編碼蛋白與用途，該基因為首次利用構(gòu)建cDNA文庫從芍藥中克隆而得，填補了從我國傳統(tǒng)中藥材芍藥中分離克隆出乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶基因的空白。本發(fā)明所提供的芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因可以通過生物技術(shù)提高芍藥中乙酰CoA代謝產(chǎn)物的含量，在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。
【專利說明】芍藥乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因及其編碼產(chǎn)物和應
用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及利用芍藥cDNA文庫克隆乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因及其編碼產(chǎn)物與應用，尤其涉及生物合成有藥理活性成分的有機酸、萜類酶基因及其編碼產(chǎn)物與應用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]藥用植物活性成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機制和解釋藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時為利用生物技術(shù)提高目標成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。藥用植物的化學成分復雜，種類繁多，其中主要含有有機酸類、黃酮類、揮發(fā)油、萜類、二萜類、微量元素等多種成分，芍藥Paeonia lactif 1ra不僅是名花,還是一味常用中藥,其根可供藥用。其中白茍具有鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)痛、通經(jīng)等作用。芍藥根中含有芍藥苷、安息香酸等活性成分，其中芍藥苷屬于單萜類化合物，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、，解痙、解熱、抗炎、抗?jié)?、抗過敏、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、保護肝臟等作用(楊俊，方紅編。芍藥[M]。北京:中國中醫(yī)藥出版社，2001，113)。
[0003]乙酸CoA酸基轉(zhuǎn)移酶(acetyl-CoAC-acetyltransferase,AACT)是職類化合物生物合成甲羥戊酸(MVA)途徑的起始酶，是萜類化合物生物合成途徑上的第一個關(guān)鍵酶，其表達量可能與芍藥苷等萜類成分的含量密切相關(guān)。AACT能催化使2個分子的乙酰CoA縮合為乙酰乙酰CoA(acetoacetyl CoA),再經(jīng)過輕甲基戍二酰CoA合酶(HMGS)、輕甲基戍二酰CoA還原酶(HMGR)等酶的作用生成異戊烯基焦磷酸(IPP)，再進一步合成各種不同的萜類化合物(張長波，孫紅霞，鞏中軍，祝`增榮。植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關(guān)合酶[J]。植物生理學通訊，2007，43 (4):779-786)。芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因的克隆，為利用基因工程提高芍藥活性成分含量提供重要基礎(chǔ)，在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的芍藥中乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因及其氨基酸序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因。
[0005]本發(fā)明第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0006]本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細胞。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因的應用。
[0008]本發(fā)明所提供的芍藥乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因，為以下核苷酸序列之
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0011]該基因所編碼的蛋白質(zhì)為芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因，是以下氨基酸序列之一:
[0012](1)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
[0014]本發(fā)明所提供的芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因是首次從芍藥中克隆制備的，體外實驗表明，PLAACT具有催化使2個分子的乙酰CoA縮合為乙酰乙酰CoA(acetoacetyl CoA)的活性。利用本發(fā)明可以通過基因工程技術(shù)來提高芍藥等植物中萜類物質(zhì)含量。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1:PLAACT功能域預測分析(來源于NCBI數(shù)據(jù)庫)；
[0016]圖2 =PLAACT系統(tǒng)進化樹(鄰接法)；
[0017]圖3:表達載體 pBAD/HisB-AACT 構(gòu)建；
【具體實施方式】
[0018]實施例1、芍藥cDNA文庫的構(gòu)建
[0019]1、芍藥總RNA的分離和檢測
[0020]取茍藥(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末,快速轉(zhuǎn)移至 65°C預熱的 IOmL 提取緩沖液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol.1-1，EDTA25mmol.?Λ NaCl 2.0mol. PVP402%，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% )，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的IOM LiCl，混勻后放置 4°C沉淀過夜；7500g 離心 20 分鐘，沉淀用 500yL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol.?ΛTris-HCl (ρΗ8.0) IOmmol.?Λ EDTA lmmol.?Λ 在 65°C溶解 5 分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2小時；4°C 13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于IOOy L DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定Α260、Α280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。
[0021]2、cDNA文庫的構(gòu)建
[0022]米用mRNA 純化試劑盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分離 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Cat.N0.634903)進行建庫，原理為 SMART (switch mechanism at 5 ' endofmRNAtemplate)。
[0023]實施例2:芍藥相關(guān)基因的克隆
[0024]隨機挑取5000個單克隆進行菌落PCR鑒定。取適量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的滅菌水。用滅過菌的1Oul小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。依次加入:Taq buffer 2.5 μ L，MgCl2 (25mM) 1.8 μ L，dNTP (2.5mM) 1 μ L，M13+引物(1Opmol) 1 μ L，Μ13-引物(1Opmol) 1 μ L，Taq SI 0.4 μ L0 PCR 反應條件為 94°C預變性 5 分鐘后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分鐘，35個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。待PCR反應進入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，根據(jù)膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。選擇條帶單一擴增產(chǎn)物送至華大基因公司進行測序，獲得芍藥相關(guān)基因序列。
[0025]實施例3、PLAACT基因的生物信息學分析
[0026]本發(fā)明涉及的芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因全長cDNA的長度為1218bp，詳細序列見序列表中的序列1，其中開放讀碼框位于l_1218bp。將芍藥全長cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸同源性檢索。該基因在氨基酸水平上與其它物種中的AACT有較高的同源性，同時具有典型的acetyl-CoAC-acetyltransferase結(jié)構(gòu)域。如圖1。
[0027]實施例4、PLAACT基因功能的研究
[0028]1.原核表達載體的構(gòu)建
[0029]以PLAACT cDNA 為模板，利用引物 Pl:5 ' -ATGGATGCAGGGGGAT-3 ' , P2:5' -TTACATGAGCTCTAGAACAAGGGC-3'進行PCR反應，反應體系同實驗例2。取5ul擴增產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭跑電泳，半小時后照相，觀察膠圖，擴增片段為1218bp。利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化切膠回收產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物和pCR4T0P0-TA vector (Invitrogen)連接轉(zhuǎn)化后，對PCR檢測合格的克隆提質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pCR-T0P0AACT。
[0030]利用EcoRI對質(zhì)粒pCR-T0P0AACT在37°C下酶切2小時，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物，同時利用EcoRI酶切pBAD/His B vector (Invitrogen) 2小時，加入5ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用回收試劑盒回收4092bp片段。
[0031]回收片段利用T4連接酶在15°C連接過夜。熱擊轉(zhuǎn)化T0P10E.coli感受態(tài)細胞，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C過夜培養(yǎng)，挑選單克隆加入5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)。經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析，保存具有正確目標序列的重組質(zhì)粒pBAD/HisB-AACT以及菌液用于表達轉(zhuǎn)化。該表達載體命名為pBAD/HisB-AACT(圖 3)。
[0032]2.工程菌的誘導表達
[0033]將含有pBAD/HisB-AACT的5ml T0P10E.coli菌液加入95ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并分成2份于220rpm培養(yǎng)，當0D600為0.5時向其中一份中加入0.2%阿拉伯糖，另一份不加阿拉伯糖作為對照，在37°C誘導4h后取樣。4°C超聲破碎離心過N1-NTA瓊脂糖凝膠柱純化蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，在分子量約為41.4kD處，出現(xiàn)一條明顯的特異蛋白質(zhì)表達條帶，與理論值一致。
[0034]3.粗酶液的制備
[0035]當菌體密度達到OD6tltl = 1.8-2.0A后，12000r/min, 4°C,離心Imin。收集菌體沉淀，重懸于PBS (pH7.4)緩沖液中，洗滌2次。加入10mg/ml的溶菌酶，室溫放置15min，再加入100 μ I細胞裂解液，劇烈振蕩Imin,冰浴Imin,重復6次。12000r/min, 4°C，離心20min,吸取上清液作為粗酶提取液，置冰上備用。
[0036]4.AACT活性測定
[0037]AACT可以催化2分子乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA和CoA，蘋果酸在蘋果酸脫氫酶(MDH)作用下生成NADH和草酰乙酸，而草酰乙酸和乙酰CoA在檸檬酸合酶(CS)作用下生成檸檬酸和CoA。用紫外分光光度計測定反應前后的0D340檢測NADH的形成率，利用NADH的形成和乙酰輔酶A的降解之間的比例是2: I從而計算粗酶液AACT的活力。活性測定按以下條件進行:lmL 反應體系為 175mM Tris-HCl (pH 8.5)，0.12mM CoA, 2.0mM DTE, 2.6mM蘋果酸，0.14mM NAD，58nkat蘋果酸脫氫酶，18nkat檸檬酸合酶，0.05% (w/v)牛血清蛋白和重組粗酶。底物是20 μ M乙酰乙酰輔酶Α。終止反應后測得PLAACT酶活為220nkat/mg。
[0038]5.突變AACT活性測定[0039]以PLAACT cDNA 為模板，利用突變引物 P3:5 ' -ATGGATGCGGGGGGAT-3 '，P4:5' -TTACATGAGCTCTAGAACAAGGGC-3'進行PCR反應，原核表達載體的構(gòu)建、工程菌的誘導表達、粗酶液的制備及粗酶液AACT活性測定方法同上，結(jié)果表明突變PLAACT轉(zhuǎn)基因工程菌株經(jīng)誘導后活力與正常PLAACT沒有顯著差異。
【權(quán)利要求】
1.一種芍藥乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—種芍藥乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶(PLAACT)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
3.重組載體，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的芍藥乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶(PLAACT)基因全序列或部分序列。·
【文檔編號】C12N9/10GK103571857SQ201210262067
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 汪周勇 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所