一種去除疫苗中宿主dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種去除疫苗中宿主DNA的方法，包括調(diào)整病毒感染的宿主細(xì)胞上清濃縮液的pH值和鹽濃度，使pH值在pH?6~8之間，鹽濃度在0.2~0.5mol/L之間；使調(diào)整后的宿主細(xì)胞上清濃縮液與陰離子交換介質(zhì)充分接觸。采用本發(fā)明所述方法處理后，病毒量檢測結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮液中檢測的病毒量至少是處理前的60%，上清濃縮液中DNA的去除率在99%以上，最終的純化病毒液制備凍干疫苗檢測到宿主DNA殘留量不高于10pg，完全符合疫苗中宿主DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說明】一種去除疫苗中宿主DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種疫苗中宿主DNA的去除方法。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病，在全球分布廣泛，每年死于狂犬病的人數(shù)超過5.5萬人，其中約95%發(fā)生在亞洲和非洲。大多數(shù)死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬傷所致，受害者中30%~60%為15歲以下兒童。狂犬病的預(yù)防和治療通常采用狂犬病疫苗。
[0003]在狂犬疫苗生產(chǎn)中，經(jīng)病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有目標(biāo)物狂犬病毒，而且還有宿主細(xì)胞碎片和蛋白以及宿主DNA。另外，還有細(xì)胞培養(yǎng)基組份。這些雜質(zhì)都是需要去除的。其中，以傳代細(xì)胞制備狂犬疫苗安全性的關(guān)鍵是細(xì)胞殘余DNA的含量。中國藥典規(guī)定狂犬疫苗(Veix)細(xì)胞)的宿主DNA殘留量不得高于IOOpg/劑。
[0004]傳統(tǒng)的狂犬病毒純化路線主要采用超濾濃縮和凝膠過濾色譜法。其中，凝膠過濾色譜法是目前最有效的純化方法，但是該方法的純化效果并不能滿足狂犬疫苗制品新的國家標(biāo)準(zhǔn)IOOpg/劑的要求，主要原因是凝膠過濾色譜法是根據(jù)生物分子量大小進(jìn)行分離的，而病毒與宿主DNA的分子量不相上下，不能在凝膠介質(zhì)中被有效分離。
[0005]此外，采用在病毒收獲液中添加硫酸魚精蛋白的方法去除DNA，原理是硫酸魚精蛋白可以與DNA結(jié)合，結(jié)合物容易沉淀，使用離心的方法能有效去除DNA。但是同時(shí)魚精蛋白也與病毒結(jié)合，病毒損失嚴(yán)重，通常回收率只有25-30%。
[0006]此外，在超濾濃縮后加入核酸酶處理步驟，經(jīng)過酶切以后的DNA變成了小片段，然后再經(jīng)過凝膠過濾色譜步驟，使大部分DNA和病毒分離開。但是由于核酸酶的作用受環(huán)境條件限制，不能完全發(fā)揮效果，仍有極小一部分DNA不能和病毒分開，最終DNA殘留量還停留在納克(ng)級水平。結(jié)果只是接近國家標(biāo)準(zhǔn)，仍然很難達(dá)到合格水平。
[0007]近幾年，在狂犬病毒的純化過程中引入了離子交換色譜步驟，首先是陰離子交換色譜，讓DNA和病毒一起被吸附在介質(zhì)上，然后控制條件僅對病毒洗脫，能夠使病毒液中DNA的殘留量降低至500pg/ml，但是病毒量的回收率只有大約20%。
[0008]CN102282253A公開了一種狂犬病病毒純化方法，使用一步陽離子交換色譜法能夠使DNA的去除率達(dá)到95%以上，而病毒回收率在70%以上。所述的陽離子交換介質(zhì)是MERCK公司的產(chǎn)品Fractogel EMD S03_，結(jié)合后續(xù)的核酸酶處理步驟和超速離心純化步驟，最終得到的病毒液配制成的狂犬疫苗，在含有2.5IU有效劑量里DNA殘留量小于20pg。整個(gè)純化過程病毒回收率在50%左右。然而，CN102282253A公開的狂犬病病毒純化工藝過于復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。
[0009]CN102282253A公開了采用離子交換色譜純化狂犬病病毒的工藝，先將被病毒感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物的上清液與陽離子交換色譜擔(dān)體接觸，以便讓狂犬病毒結(jié)合在擔(dān)體上，隨后從擔(dān)體上洗脫該病毒。這樣的工藝流程主要是為了去除病毒液中的宿主DNA殘留，但是由于病毒先吸附再洗脫的做法使得病毒量損失較大。而且病毒和宿主DNA都吸附在擔(dān)體上，先后洗脫病毒和DNA的做法也導(dǎo)致了 DNA去除不徹底的后果。
[0010]因此開發(fā)一種既能有效去除DNA殘留從而達(dá)到國家藥典標(biāo)準(zhǔn)又能提高病毒回收率的純化工藝非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種去除疫苗中宿主DNA的方法，包括:
[0012]步驟I)調(diào)整病毒感染的宿主細(xì)胞上清濃縮液的pH值和鹽濃度，使pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間；
[0013]步驟2)使調(diào)整后的宿主細(xì)胞上清濃縮液與陰離子交換介質(zhì)充分接觸。
[0014]細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮液在與介質(zhì)接觸之前要進(jìn)行澄清和濃縮，調(diào)整后的上清濃縮液pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間。上清濃縮液pH值優(yōu)選在廣8之間，進(jìn)一步優(yōu)選在7~7.8之間；鹽濃度優(yōu)選0.3~0.5mol/L。
[0015]pH值的區(qū)間是狂犬病毒的活性耐受區(qū)間，越過這個(gè)區(qū)間病毒生物活性會受到很大影響。鹽濃度區(qū)間則是病毒回收和DNA去除的優(yōu)選區(qū)間，當(dāng)鹽濃度低于0.2M/L時(shí)，病毒的回收率只有8% ;而當(dāng)鹽濃度高于0.5M/L時(shí)，DNA的去除率下降到70%。
[0016]陰離子交換色譜介質(zhì)選自偶聯(lián)二乙胺基乙基(DEAE)、季銨鹽(Q)為配基的瓊脂糖微球或者是其他具有陰離子效果的介質(zhì)。本發(fā)明采用的陰離子交換層析并不需要依賴特定的填料，任何具有陰離子效果的介質(zhì)都可以運(yùn)用到本發(fā)明的工藝中。
[0017]在本發(fā)明的實(shí)施例中米用了 Q Sepharose FF和DEAE Sepharose FF這兩種為最普遍的因離子交換色譜介質(zhì)。Q Sepharose FF為強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)，DEAE Sepharose FF是弱陰離子介質(zhì)，兩者均可用于本發(fā)明的工藝中而且去除宿主DNA效果良好。
[0018]在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述宿主細(xì)胞為Veix)細(xì)胞，所選用疫苗為狂犬疫苗。
[0019]Vero細(xì)胞是一種理想的疫苗生產(chǎn)基質(zhì):遺傳背景清楚，核型穩(wěn)定，無外源因子污染，160代以內(nèi)沒有致瘤性，適合大規(guī)模培養(yǎng)，可用生物反應(yīng)器生產(chǎn)，保證了疫苗大批量細(xì)胞的均質(zhì)性和安全性。目前用VeiO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞開發(fā)、研究和生產(chǎn)的疫苗包括但不限于狂犬疫苗、流感疫苗、出血熱疫苗、甲肝疫苗、乙腦疫苗、輪狀病毒疫苗、SARS疫苗等等。
[0020]CHO細(xì)胞與VeiO細(xì)胞被WHO是經(jīng)中國藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可，用于生物制品的生產(chǎn)的傳代細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，所述疫苗包括但不限于狂犬疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙腦疫苗、甲肝疫苗、出血熱疫苗、流感疫苗、SARS疫苗或輪狀病毒疫苗，所述宿主細(xì)胞包括但不限于CHO細(xì)胞與VeiO細(xì)胞，利用本發(fā)明所述方法處理，調(diào)整病毒感染的宿主細(xì)胞上清濃縮液的PH值和鹽濃度，使pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間；使調(diào)整后的宿主細(xì)胞上清濃縮液與陰離子交換介質(zhì)充分接觸，均可達(dá)到去除疫苗中宿主DNA的目的。
[0021]采用本發(fā)明所述方法處理后，細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮液中檢測的病毒量至少是處理前的60%，優(yōu)選至少是處理前的80%以上，病毒量檢測是采用ELISA方法對病毒的G蛋白組分做的檢測。
[0022]接觸介質(zhì)后上清濃縮液中DNA的去除率在99%以上，優(yōu)選99.5%以上，更優(yōu)選99.9%以上，DNA檢測采用斑點(diǎn)雜交法。
[0023]所述狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，在陰離子交換色譜步驟之后優(yōu)選還包含核酸內(nèi)切酶處理步驟。核酸內(nèi)切酶可以選自Benzonase等品牌的內(nèi)切酶。
[0024]酶切后的病毒液經(jīng)過凝膠過濾層析純化，收集含有病毒成分的純化吸收峰，凝膠過濾介質(zhì)是4-6%交聯(lián)度的瓊脂糖微球。凝膠過濾層析純化液中檢測的病毒量是層析前的78%以上，有的高達(dá)95%以上。凝膠過濾層析純化液中宿主DNA殘留量小于40pg/ml。
[0025]上述方法得到的純化液以單劑量配苗并進(jìn)行凍干，檢測到凍干疫苗宿主DNA殘留量< IOpg/ 劑。
[0026]最終的純化病毒液以單劑量配苗，然后進(jìn)行凍干。凍干疫苗有效劑量為8IU (NIH法檢測)時(shí),用斑點(diǎn)雜交法檢測宿主DNA殘留量不高于10pg。
[0027]本發(fā)明提供的更具優(yōu)勢的狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，通過對陰離子交換色譜進(jìn)行了仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)摸索，意外的發(fā)現(xiàn)狂犬病毒不適合被吸附后再洗脫下來，為此，發(fā)明人采用嚴(yán)格控制陰離子交換條件的思路，通過調(diào)整病毒感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮液的PH值和鹽濃度，僅僅使宿主DNA被吸附，而病毒幾乎不受損失，這一思路達(dá)到非常好的去除宿主DNA的效果，
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0029]I)宿主DNA去除率好，能夠達(dá)到99.95%，更優(yōu)的能達(dá)到99.99% ；
[0030]2)病毒損失低，總的病毒回收率在50%以上；
[0031]3)避免使用價(jià)格昂貴的耗材和設(shè)備，生產(chǎn)成本大大降低；
[0032]4)避免使用操作復(fù)雜的技術(shù)和方法，使生產(chǎn)過程大大簡化；
[0033]5)全過程各項(xiàng)技術(shù)結(jié)合緊密，運(yùn)行流暢，易于放大進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。`【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1本發(fā)明所述方法流程圖。
[0035]圖2為對病毒各組分的Western blot檢測結(jié)果。
[0036]圖3為本發(fā)明所述方法處理后的狂犬病毒電子顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明公開了一種去除疫苗中宿主DNA的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0038]在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明所述方法的具體流程如圖1，下面以VeiO細(xì)胞生產(chǎn)狂犬疫苗為例，對本發(fā)明所述方法作進(jìn)一步的詳細(xì)說明:
[0039]1.澄清步驟
[0040]采用0.65um孔徑的套筒式濾器對病毒感染的Vero細(xì)胞培養(yǎng)收獲液做過濾澄清，去除因細(xì)胞被病毒裂解產(chǎn)生的大量細(xì)胞碎片和大顆粒物質(zhì)，病毒顆粒大小在200nm左右，能夠很容易穿透濾器的篩孔，而細(xì)胞碎片和大顆粒物質(zhì)被隔離，使病毒液澄清。
[0041]2.濃縮步驟
[0042]澄清后的病毒液體積大，不利于下一步的純化操作，所以采用超濾方法對澄清病毒液濃縮，濃縮倍數(shù)一般在20-30倍，使用的超濾膜包截留分子量在300-1000KD之間。
[0043]3.陰離子交換介質(zhì)
[0044]與尚子交換介質(zhì)充分接觸之前,調(diào)整病毒濃縮液的pH值在6_8之間，鹽濃度在
0.2-0.5mol/之間，然后進(jìn)行陰離子交換處理，收集處理后病毒液。所述的陰離子交換介質(zhì)是耦聯(lián)DEAE或Q配基的瓊脂糖微球，或者是其他具有陰離子效果的介質(zhì)。
[0045]4.二次超濾濃縮
[0046]經(jīng)過離子交換色譜后，為了減輕下一步操作負(fù)擔(dān)，同時(shí)也為了降低生產(chǎn)成本，對病毒液進(jìn)行二次超濾濃縮，所用超濾膜包截留分子量300-1000KD。
[0047]5.病毒滅活
[0048]采用β -丙內(nèi)酯1:4000稀釋對病毒液滅活24小時(shí),37°C水解2小時(shí)降解β -丙內(nèi)酯。
[0049]6.核酸酶 處理
[0050]米用benzonase酶處理病毒液，30_37°C靜置20小時(shí)。
[0051]7.凝膠過濾色譜法純化
[0052]酶處理后病毒液經(jīng)過凝膠過濾柱層析純化，去除雜蛋白、小片段DNA和殘留核酸酶。所述凝膠過濾介質(zhì)為4-6%交聯(lián)度的瓊脂糖微球。
[0053]本發(fā)明對最終純化液做了電子顯微鏡觀察病毒顆粒形態(tài)，顯示病毒顆粒呈子彈狀，顆粒大小在200nm左右，符合狂犬病毒特征；同時(shí)也對整個(gè)工藝的每個(gè)環(huán)節(jié)做了Western blot檢測(圖2)，結(jié)果顯示從病毒收獲液到純化液，病毒組分沒有發(fā)生改變，見圖3，說明本發(fā)明的去除DNA的方法以及后續(xù)的純化方法比較好的保持了病毒顆粒的完整性，對病毒沒有造成損害。
[0054]本發(fā)明提供的去除狂犬疫苗宿主DNA的方法分別進(jìn)行了 1200ml、12L、30L規(guī)模試驗(yàn)和300L規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。在病毒的純化過程中均高效地去除了宿主DNA，DNA去除率達(dá)到99.95%以上；并且有效地回收了病毒，總的病毒回收率在50%以上；而且外源蛋白的去除到了目前的檢測限度以下。
[0055]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0056]實(shí)施例1:
[0057]取1200ml狂犬病毒收獲液，用0.65um孔徑的套筒濾器澄清過濾，超濾濃縮30倍，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH為7.8，鹽摩爾濃度為0.4mol/L，與50ml Q Sepharose FF介質(zhì)充分接觸15分鐘；然后對介質(zhì)處理后的病毒液超濾濃縮3倍；用β -丙內(nèi)酯終濃度1:4000滅活24小時(shí)；滅活液37°C水解2小時(shí)；用氯化鎂溶液調(diào)整Mg2+濃度為l-2mmol/L，加入終濃度為90IU/ml的Benzonase核酸酶，處理20小時(shí)；上樣到IL Sepharose 4FF凝膠層析柱中，層析柱緩沖液為PBS，線性流速90cm/h收取病毒洗脫峰，檢測殘留DNA和病毒量，DNA殘留量為80pg/ml，去除率為99.95%，病毒回收率55%。
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種去除疫苗中宿主DNA的方法，包括以下步驟: 步驟I)調(diào)整病毒感染的宿主細(xì)胞上清濃縮液的PH值和鹽濃度，使pH值在6~8之間，鹽濃度在0.2^0.5mol/L之間； 步驟2)使調(diào)整后的宿主細(xì)胞上清濃縮液與陰離子交換介質(zhì)充分接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述鹽濃度為在0.3^0.5mol/L之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述上清濃縮液的PH值選自7-8或7-7.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，所述陰離子交換色譜介質(zhì)選自偶聯(lián)二乙胺基乙基或者季銨鹽為配基的瓊脂糖微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述宿主細(xì)胞選自VeiO細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述疫苗選自狂犬疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙腦疫苗、甲肝疫苗、出血熱疫苗、流感疫苗、SARS疫苗或輪狀病毒疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟2)之后還包含核酸內(nèi)切酶處理步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，所述核酸內(nèi)切酶為Benzonase。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，酶切處理后的病毒液經(jīng)過凝膠過濾層析純化。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法 ，所述凝膠過濾介質(zhì)是4-6%交聯(lián)度的瓊脂糖微球。
【文檔編號】C12N7/02GK103571800SQ201210263908
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】杜笑寒, 周童, 賈芳苗, 戚鳳春, 何榮 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司, 江蘇先聲衛(wèi)科生物制藥有限公司