專利名稱：一種水稻淀粉分支酶sbe3基因的突變基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及水稻高抗性淀粉含量主效基因的突變篩選及所述突變的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
歐洲抗性淀粉協(xié)會(huì)(EURESTA)的定義,抗性淀粉(Resistant Starch,簡(jiǎn)稱RS)是指在健康個(gè)體的小腸中不能被吸收的淀粉或淀粉降解產(chǎn)物?？剐缘矸劬哂薪档脱?、降低血脂及有利于腸道健康等多種重要的生理功能。已有研究表明，RS不能在小腸消化吸收和提供葡萄糖，而在大腸中可以被腸道生理性細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chainfatty acid，簡(jiǎn)稱SCFA)和氣體。RS的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為是近年來(lái)碳水化合物與健康關(guān)系的研究中一項(xiàng)最重要的成果。RS有 著重要的生理功能，它能夠降低餐后血糖和胰島素應(yīng)答，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，預(yù)防便秘和結(jié)腸癌的發(fā)生，降低血清中膽固醇和甘油三酯含量，降低和控制體重，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收。與低抗性淀粉飲食者相比，高抗性淀粉飲食者具有較少的胰島素反應(yīng)，這對(duì)糖尿病患者控制餐后血糖值有很大影響。尤其對(duì)于非胰島素依賴型病人，攝食高抗性淀粉食物，可延緩餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。然而，日常食用的稻米中抗性淀粉含量很低，米飯及其制品主要在胃和小腸中被淀粉酶以酶解的方式消化，最終產(chǎn)物為葡萄糖。因此，稻米被認(rèn)為是高血糖指數(shù)(Glycemic index, GI)的食物。熱米飯抗性淀粉含量低于1%，冷米飯抗性淀粉含量也僅為1%_2. 1%。鑒于上述情況，近幾年來(lái)，抗性淀粉引起了國(guó)內(nèi)外水稻育種專家的極大關(guān)注。目前市場(chǎng)上的抗性淀粉均是利用高直鏈淀粉生產(chǎn)的。已有一些報(bào)道通過(guò)提高作物直鏈淀粉含量來(lái)提高RS含量，例如=Bird等獲得一個(gè)SSIIa基因突變的大麥突變體，該突變體產(chǎn)生的直鏈淀粉比例增加，RS含量顯著提高；Regina等利用RNAi技術(shù)獲得了直鏈淀粉含量高達(dá)70%的小麥突變體，其RS含量也明顯提高;Wei等通過(guò)RNAi技術(shù)降低水稻淀粉分支酶的表達(dá)，獲得了直鏈淀粉和抗性淀粉含量比野生型水稻品種“特青”明顯提高的轉(zhuǎn)基因品種；浙江大學(xué)的科研人員利用航天誘變和理化誘變技術(shù)，培育了高RS水稻新品種“浙輻201”，并與相關(guān)企業(yè)合作進(jìn)行了產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)，產(chǎn)品命名為“宜糖”米。目前，對(duì)于RS功能產(chǎn)品的絕大多數(shù)研究仍集中于采用物理加工的方法提高RS含量，關(guān)于遺傳改良方面的報(bào)道尚不多見(jiàn)。常規(guī)育種技術(shù)是目前稻米品質(zhì)改良的主要手段，其方法也比較簡(jiǎn)單，即將待改良親本與高抗性淀粉含量親本雜交，在雜交后代或回交后代中再進(jìn)一步選育目標(biāo)品系，但在選育抗性淀粉含量高的水稻中往往需要精確測(cè)定。由于抗性淀粉的測(cè)定不但費(fèi)時(shí)、成本高，而且容易受到環(huán)境的影響，加之測(cè)定方法的復(fù)雜性，稻米抗性淀粉含量的改良一直比較困難。此外，目前鮮見(jiàn)與抗性淀粉含量緊密連鎖的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和利用的報(bào)道。僅在2008年，牟方貴等報(bào)道在雜交組合II-32B/RS111中，位于第8染色體的RM72和RM547與抗性淀粉存在一定的連鎖關(guān)系，而在宜香B/RS111的&中，和Wx基因連鎖的RM217和RM225與抗性淀粉存在一定的連鎖關(guān)系。2009年王琳等利用BSA法在小麥中找到一個(gè)與高抗性淀粉含量密切相關(guān)的SSR標(biāo)記Xbarc59。分子標(biāo)記輔助選擇可以大大減少育種的工作量，育種效率也會(huì)明顯提高。開(kāi)發(fā)與稻米抗性淀粉含量相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記或功能標(biāo)記，利用開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記對(duì)育種材料進(jìn)行早代選擇，加快育種進(jìn)程，改良稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種水稻高抗性淀粉含量主效基因(命名為sbe3-rs)的分子標(biāo)記。通過(guò)檢測(cè)該分子標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)高抗性淀粉含量水稻植株，從而加快高抗性淀粉含量水稻品種的選擇進(jìn)度，提高育種選擇效率。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種水稻淀粉分支酶SBE3基因的突變基因，所述突變基因在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子的第105位處具有T — C的堿 基突變。優(yōu)選地，所述突變基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。此核苷酸序列與水稻淀粉分支酶SBE3基因相比，在對(duì)應(yīng)于其第16個(gè)外顯子的第105位處具有T — C的堿基突變。另一方面，本發(fā)明還提供一種DNA核酸序列，所述DNA核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示(本文中命名為“PCR-SpeI”XSEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列為571bp的片段，其與水稻淀粉分支酶SBE3基因相比，涵蓋了水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子及其上下游的部分非編碼區(qū)，并且此DNA核酸序列中在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處具有堿基C，從而原本與其上下游堿基構(gòu)成的限制性內(nèi)切酶SpeI的酶切位點(diǎn)ACTAGT被突變成ACCAGT，由此喪失了限制性內(nèi)切酶SpeI的酶切位點(diǎn)。研究表明，包含本發(fā)明提供的上述突變基因或DNA核酸序列的水稻品種，其抗性淀粉含量顯著高于對(duì)應(yīng)的基因或DNA核酸序列中不包含該堿基點(diǎn)突變的水稻品種。因此，在又一方面，本發(fā)明提供上述突變基因或DNA核酸序列在篩選高抗性淀粉含量的水稻品種中的用途。再一方面，本發(fā)明提供一種篩選高抗性淀粉含量的水稻品種的方法，所述方法包括以下步驟以擴(kuò)增包含水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位的核酸序列為目標(biāo)設(shè)計(jì)引物，然后采用該引物并以待篩選水稻的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定在得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處是否具有T —C的堿基突變。具體而言，所述方法包括以下步驟I)提取待篩選水稻的基因組DNA ；2)以該基因組DNA為模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR-SpeI F: ATGTGATGTGCTGGATTTGG SEQ ID NO. 3PCR-SpeI R: TGTGGTTTTCATACCGTTCTTA SEQ ID NO. 4;以及3)鑒定在得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處是否具有T — C的堿基突變。優(yōu)選地，所述步驟3)中采用以下方式進(jìn)行鑒定A.對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增可得到571bp的片段，可以對(duì)其進(jìn)行片段全長(zhǎng)測(cè)序，從而確定在該核苷酸片段中在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處是否具有T — C的堿基突變，具有此堿基突變的植株為高抗性淀粉含量的品種。替代地或額外地，所述步驟3)中采用以下方式進(jìn)行鑒定B.采用限制性內(nèi)切酶SpeI對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。對(duì)于PCR擴(kuò)增得到的571bp片段，如果在其對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處具有T-C的堿基突變，則此點(diǎn)突變?cè)斐闪嗽撐恢锰幍南拗菩詢?nèi)切酶SpeI的酶切位點(diǎn)喪失(由于ACTAGT被突變成ACCAGT)。采用SpeI酶切，低抗性淀粉含量植株P(guān)CR產(chǎn)物的酶切結(jié)果有375bp和196bp兩條譜帶；高抗性淀粉含量植株P(guān)CR產(chǎn)物不能被酶切，只有571bp—條譜 帶；雜合基因型的有3條譜帶。還一方面，本發(fā)明提供一種用于篩選高抗性淀粉含量的水稻品種的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括能夠擴(kuò)增包含水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位的核酸序列的PCR引物；優(yōu)選地，所述試劑盒還包括Taq DNA聚合酶、PCR緩沖體系和dNTP。優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的試劑盒中，所述PCR引物為核苷酸序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物；并且優(yōu)選地，所述試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶Spel。另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的水稻淀粉分支酶SBE3基因的突變基因(優(yōu)選核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的突變基因)編碼的蛋白，其中所述突變基因在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子的第105位處具有T — C的堿基突變；優(yōu)選地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。并且本發(fā)明還提供由根據(jù)本發(fā)明的DNA核酸序列(SEQ ID NO. 2)編碼的氨基酸序列。由此，本發(fā)明還提供上述蛋白或氨基酸序列在篩選高抗性淀粉含量的水稻品種中的用途。又一方面，本發(fā)明提供另一種篩選高抗性淀粉含量的水稻品種的方法，所述方法包括以下步驟獲得待篩選水稻的水稻淀粉分支酶SBE3的氨基酸序列或其部分序列，然后鑒定該氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3第599位處是否具有亮氨酸一脯氨酸的氨基酸突變。本發(fā)明人通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明，在不同水稻品種中，如在水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處具有T — C的堿基突變，其抗性淀粉含量高。因此，采用人工合成的引物序列擴(kuò)增基因組DNA，然后通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物酶切電泳得到多態(tài)性，由此檢測(cè)此堿基點(diǎn)突變形成的分子標(biāo)記，可以有效地檢測(cè)高抗性淀粉含量品種降糖稻及其衍生品種(系)中是否含有該主效基因位點(diǎn)，從而大大提聞聞抗性淀粉含量水稻新品種的選擇效率，獲得聞抗性淀粉含量水稻品種。此外，采用本發(fā)明提供的鑒別水稻抗性淀粉含量的分子標(biāo)記方法，步驟簡(jiǎn)單快捷、穩(wěn)定性可靠。實(shí)驗(yàn)證明，其鑒別結(jié)果與表型測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確一致、重復(fù)性好，特別適用于抗性淀粉分子標(biāo)記輔助育種，可以省去復(fù)雜的抗性淀粉含量測(cè)定過(guò)程，節(jié)省育種成本，提高選擇效率，加速育種進(jìn)程。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖I為覆蓋sbe3_rs的連鎖遺傳圖，其中示出了物理圖譜及交換重組情況分析。圖2為對(duì)親本植株進(jìn)行擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物SpeI酶切結(jié)果，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)品DL2000，泳道I和2分別為親本密陽(yáng)23的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SpeI酶切前后的電泳結(jié)果，泳道3和4分別為親本降糖稻I號(hào)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SpeI酶切前后的電泳結(jié)果。 圖3為F2代單株的突變檢測(cè)結(jié)果電泳圖譜，其中Pl為降糖稻I號(hào)，P2為密陽(yáng)23，其余為178個(gè)F2代單株。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品?？剐缘矸酆繙y(cè)定應(yīng)用Megazyme公司提供的抗性淀粉含量測(cè)定試劑盒(Megazyme, Co. Wicklow, Ireland)對(duì)抗性淀粉含量測(cè)定,略有改進(jìn)。具體步驟為準(zhǔn)確稱取IOOmg米粉樣品，小心放入帶螺旋蓋的塑料試管中，依次加入a -胰淀粉酶反應(yīng)液和淀粉葡萄糖苷酶(AGM)，37°C震蕩孵育16小時(shí)，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖；孵育結(jié)束后加入99%乙醇終止反應(yīng)；離心上述溶液，棄上清，底部殘留絮狀團(tuán)即為樣品中的抗性淀粉，再用50%乙醇洗滌沉淀；倒置離心管，沉淀干燥后用2M KOH溶解沉淀，并加入AGM，置于60°C水浴中孵育I小時(shí)，最后用D-葡萄糖用葡糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑(GOPOD)試劑測(cè)定葡萄糖含量，并計(jì)算抗性淀粉含量(以重量百分比計(jì)，簡(jiǎn)稱RS (%))。實(shí)施例I(一)降糖稻I號(hào)/密陽(yáng)23F2群體構(gòu)建及表型鑒定2008年夏季，在上海農(nóng)科院綜合試驗(yàn)基地以高抗性淀粉含量材料降糖稻I號(hào)為母本與秈稻品系密陽(yáng)23為父本雜交獲得F1代種子。母本以人工剪穎去雄的方法進(jìn)行處理。2008年冬季在海南基地種植雜種F1代獲得F2代種子，2009年夏季在上海農(nóng)科院種植F2代。每個(gè)F2代單株采集葉片抽提DNA用于基因型分析，自交種子單株收獲用于抗性淀粉含量測(cè)定。用F2代對(duì)控制抗性淀粉含量的基因進(jìn)行初步定位，在2號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記RM13366和RM6611區(qū)間內(nèi)存在一個(gè)與抗性淀粉含量相關(guān)的QTL，能解釋抗性淀粉含量變異的60.4%，挑選此區(qū)段雜合單株，自交后代群體進(jìn)一步對(duì)目的基因精細(xì)定位。根據(jù)初定位結(jié)果，選擇目的區(qū)段雜合單株連續(xù)自交構(gòu)建F3:4群體，用于目的性狀的精細(xì)定位。(二)降糖稻I號(hào)/密陽(yáng)23 F2群體的分子標(biāo)記分析(I)用CTAB法提取親本及F2代群體個(gè)單株的基因組DNA水稻小量DNA提取法，主要參考McCouch等(1988)的報(bào)道，方法簡(jiǎn)述如下
I)剪取一小片葉片 4-5 cm，加入 700 ii L I. 5 X CTAB (含 I. 5% CTAB，75 mMTris-HCl, 15mM EDTA, I. 05 M NaCl)，充分研磨；2)將勻漿轉(zhuǎn)入I. 5 ml的離心管，56°C水浴20 min后冷卻至室溫；3)加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，搖勻；4)最高速度(13200 rpm)離心 10 min ；5)將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，并加入兩倍體積的預(yù)冷的100%酒精，靜止20 min后尚心收集DNA ；6)去上清，風(fēng)干DNA，加50-100 U L雙蒸水溶解，于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)。稀釋DNA,制備一套DNA工作溶液，其濃度為50-100ng/ u L左右，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?(2)根據(jù) gramene 網(wǎng)站公布的 SSR 分子標(biāo)記(http: IIwm. gramene. org/markers/),按照較均勻5cM的遺傳距離選擇一定數(shù)目的分子標(biāo)記進(jìn)行合成。用所獲標(biāo)記對(duì)兩親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，在親本間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記用于后續(xù)分析。(3)利用F2代分離群體的基因型資料，根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用軟件Joinmap3. 0構(gòu)建水稻抗性淀粉含量性狀的遺傳連鎖圖譜并獲得各個(gè)分子標(biāo)記的遺傳距離。最后根據(jù)F2代群體各個(gè)單株的分子標(biāo)記基因型資料和相應(yīng)的抗性淀粉含量表型值，利用MapQTL 6. 0軟件符合區(qū)間作圖法，對(duì)目標(biāo)染色體進(jìn)行QTL位點(diǎn)基因掃描。(三)利用分子標(biāo)記篩選降糖稻I號(hào)/密陽(yáng)23F4自交群體精細(xì)定位sbe3-rs基因。在初步定位的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用擴(kuò)大作圖群體和標(biāo)記加密分析對(duì)高抗性淀粉含量相關(guān)基因進(jìn)行精細(xì)定位，采用的精細(xì)定位群體是656株F4群體，所用的SSR標(biāo)記系從禾本科數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www. gramene. org)獲得。根據(jù)QTL定位結(jié)果,本發(fā)明把控制水稻抗性淀粉含量主效基因定位到物理距離約為573kb (圖I)。結(jié)合生物信息學(xué)工具分析候選區(qū)段序列，從http://rice. plantbiology. msu. edu/ 網(wǎng)站上搜索 573Kb 長(zhǎng)的定位區(qū)段(從 Indel2到InDel6) DNA序列總計(jì)找到86個(gè)已知和未知基因。這86個(gè)基因中只有一個(gè)淀粉分支酶基因SBE3與淀粉合成相關(guān)。該基因基因組序列全長(zhǎng)ll，380bp(SEQ ID NO. 5)，含有22個(gè)外顯子，CDS全長(zhǎng)2478bp (SEQ ID NO. 8)，編碼825個(gè)氨基酸(SEQ ID NO. 6)。我們?cè)O(shè)計(jì)了 9對(duì)引物擴(kuò)增突變體降糖稻I號(hào)和野生型的SBE3基因組DNA，覆蓋全部的外顯子，測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，位于突變體降糖稻I號(hào)SBE3基因組DNA第16個(gè)外顯子區(qū)具有一個(gè)堿基突變(T — C)，該點(diǎn)突變同時(shí)造成SpeI酶切位點(diǎn)的喪失。采用PCR-SpeI F: ATGTGATGTGCTGGATTTGG SEQ ID NO. 3PCR-SpeI R: TGTGGTTTTCATACCGTTCTTA SEQ ID NO. 4作為引物PCR擴(kuò)增親本密陽(yáng)23和親本降糖稻I號(hào)，得到571bp片段，本文中命名為“PCR-SpeI”。將PCR產(chǎn)物在37°C下經(jīng)SpeI酶切5小時(shí)后，酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析。圖2所示電泳結(jié)果表明，低抗性淀粉含量植株即親本密陽(yáng)23的酶切產(chǎn)物(泳道2)有375bp和196bp兩條譜帶，高抗性淀粉含量植株即親本降糖稻I號(hào)的PCR產(chǎn)物不能被酶切，只有571bp —條譜帶(泳道4)。從而找到了與抗性淀粉含量性狀共分離的分子標(biāo)記，即位于第16個(gè)外顯子區(qū)的堿基突變(T — C)。實(shí)施例2分子標(biāo)記的驗(yàn)證
I材料和方法I. I 材料降糖稻I號(hào)/密陽(yáng)23雜交F2代178個(gè)單株。PCR擴(kuò)增引物PCR-SpeI F: ATGTGATGTGCTGGATTTGG SEQ ID NO. 3PCR-SpeI R: TGTGGTTTTCATACCGTTCTTA SEQ ID NO. 4I. 2 方法 用引物擴(kuò)增F2群體樣本DNA。反應(yīng)體系中包括2 μ I 10XPCR buffer (100 mMTris-HCl pH 8. O, 15 mM MgC12, 500 mM KCl, 1% TritonX-100), 0. 2 mM dNTPs,0. 2 μ M上游和下游引物，50-100 ng樣本DNA和O. 625 U Taq酶。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，循環(huán)(94°C 30s，56°C 30s, 72°C I min)35 次，最后72°C延伸IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)SpeI(TaKaRa)酶切，酶切反應(yīng)體系20μ 1，包括17. 5 μ IPCR產(chǎn)物，2 μ I IOX M buffer，0. 5μ I Spel。37 °C酶切5小時(shí)，酶切產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè)多態(tài)性。親本密陽(yáng)23帶型2條(375bp和196bp)，親本降糖稻I號(hào)不能被酶切，帶型只有一條571bp。雜合型單株有三條帶型，571bp，375bp和196bp。后代與親本密陽(yáng)23基因型一致的標(biāo)記為A，與親本降糖稻I號(hào)基因型一致的標(biāo)記為B，雜合型的標(biāo)記為H02 結(jié)果利用F2代群體的178個(gè)單株對(duì)突變進(jìn)行驗(yàn)證，限制性內(nèi)切酶SpeI對(duì)特異擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切，其電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，分離群體單株出現(xiàn)3種帶型，即分別與親本密陽(yáng)23、降糖稻I號(hào)和雜合型一致。帶型均與抗性淀粉含量測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)。178個(gè)&群體中，有70個(gè)單株基因型與親本密陽(yáng)23 —致，其抗性淀粉含量以重量百分比計(jì)為O. 25%-0. 73%，17個(gè)單株的基因型與降糖稻I號(hào)親本基因型一致，其抗性淀粉含量為4. 56%-12. 73%，91株基因型為雜合型，其抗性淀粉含量為O. 35%-2. 19%。F2代單株基因型及表現(xiàn)型即抗性淀粉含量測(cè)定值(RS (%))結(jié)果見(jiàn)下表I。由此說(shuō)明，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記篩選方法能夠準(zhǔn)確篩選出高抗性淀粉含量單株和純合單株。表I.
權(quán)利要求
1.一種水稻淀粉分支酶SBE3基因的突變基因，其特征在于，所述突變基因在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子的第105位處具有T — C的堿基突變； 優(yōu)選地，所述突變基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種DNA核酸序列，其特征在于，所述DNA核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的突變基因或根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA核酸序列在篩選高抗性淀粉含量的水稻品種中的用途。
4.一種篩選高抗性淀粉含量的水稻品種的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 以擴(kuò)增包含野生型水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位的核酸序列為目標(biāo)設(shè)計(jì)引物，然后采用該引物并以待篩選水稻的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定在得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處是否具有T —C的堿基突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)提取待篩選水稻的基因組DNA； 2)以該基因組DNA為模板，采用核苷酸序列如SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及 3)鑒定得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位處是否具有T — C的堿基突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中采用以下方式進(jìn)行鑒定 A.對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；和/或 B.采用限制性內(nèi)切酶SpeI對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。
7.一種用于篩選高抗性淀粉含量的水稻品種的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括能夠擴(kuò)增包含水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子第105位的核酸序列的PCR引物； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括Taq DNA聚合酶、PCR緩沖體系和dNTP。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR引物的核苷酸序列如SEQID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶Spel。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的突變基因編碼的蛋白； 優(yōu)選地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA核酸序列編碼的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白或根據(jù)權(quán)利要求10所述的氨基酸序列在篩選高抗性淀粉含量的水稻品種中的用途。
12.—種篩選高抗性淀粉含量的水稻品種的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 獲得待篩選水稻的水稻淀粉分支酶SBE3的氨基酸序列或其部分序列，然后鑒定該氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3第599位處是否具有亮氨酸一脯氨酸的氨基酸突變。
全文摘要
本發(fā)明提供一種水稻淀粉分支酶SBE3基因的突變基因，所述突變基因在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16個(gè)外顯子的第105位處具有T→C的堿基突變。本發(fā)明還提供一種篩選高抗性淀粉含量的水稻品種的方法。本發(fā)明提供的突變基因的堿基突變可以作為分子標(biāo)記，有效地檢測(cè)高抗性淀粉含量品種降糖稻1號(hào)及其衍生品種(系)，從而大大提高高抗性淀粉含量水稻新品種的選擇效率，獲得高抗性淀粉含量水稻品種。
文檔編號(hào)C12N9/44GK102816778SQ201210266649
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者樸鐘澤, 楊瑞芳, 張建明, 白建江, 樓素芬 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上海昊洋農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司