專利名稱：桉樹(shù)pgef13基因及其植物表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因及其應(yīng)用，特別是涉及桉樹(shù)PGEF13基因及其植物表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和其在促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生長(zhǎng)量上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
林木在凈化大氣、防風(fēng)固沙、保持水土、維持生態(tài)平衡和生物多樣性、提供優(yōu)質(zhì)木材和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)林果等方面發(fā)揮著重要的作用，具有巨大的生態(tài)效益、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。林木等木本植物基因資源豐富，遺傳多樣性復(fù)雜，具有潛在應(yīng)用價(jià)值但目前尚未得到充分發(fā)掘和有效分離的基因。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，文庫(kù)構(gòu)建和篩選技術(shù)、基因克隆技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)等技術(shù)的建立和改進(jìn)，越來(lái)越多的林木基因得到分離和鑒定，為林木的分子育種與以及林木優(yōu)良基因的發(fā)掘和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)(李少鋒等人，植物學(xué)報(bào)46(1) : 79-107(2011))。·
目前，對(duì)已分離的林木基因的功能鑒定主要采用以下方法1)與模式植物的同源基因或功能已經(jīng)過(guò)鑒定的基因進(jìn)行相似性比較，建立進(jìn)化樹(shù)；2)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；3)通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平或蛋白表達(dá)水平的分析方法，例如半定量或定量RT-PCR、Western Blotting等，研究目的基因的時(shí)空表達(dá)以及對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)；4)把基因的與適當(dāng)?shù)脑噙B接制作成表達(dá)盒，并組裝到相應(yīng)的植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到模式植物或來(lái)源物種中，從而改變目標(biāo)基因在宿主中的表達(dá)量，如因過(guò)量表達(dá)而表達(dá)上調(diào)，或因反義抑制或者RNA干擾而表達(dá)下調(diào)，并而通過(guò)觀察轉(zhuǎn)基因植株的性狀，研究基因的功能(何光源等人，植物基因工程，清華大學(xué)出版社(2007);王關(guān)林等人，植物基因工程，科學(xué)出版社(2009))。對(duì)于模式植物，一般選用為擬南芥(Arabidopsis thaliana)或者煙草(Nicotianatabacum)。 Mouradov 等(Proceedings of the National Academy of Sciences 95:6537-6542 (1998))將在輻射松(Pinus radiata)的現(xiàn)7 OVZ7)，一個(gè)與擬南芥的 Z說(shuō)/TUFY) /FLORICAULA基因高度同源的基因轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入Ζ/Τ.·.·#Ζ7的植株可以互補(bǔ)發(fā)育途徑中對(duì)應(yīng)基因的LFY缺失，從而表明NLY與FLY的在功能上的相似性。Sonoda等(Plant Biotechnology 26: 115-120 (2009))將赤桉HD-Zip class II 轉(zhuǎn)錄因子EcHBl 基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因植株纖維長(zhǎng)度和干重增加，葉片、根和莖的生長(zhǎng)量均高于對(duì)照。這兩種植物的遺傳背景清楚，遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也較為成熟，尤其是擬南芥，作為基因組最早被測(cè)序的植物，其基因組序列、代謝途徑以及生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制等方面有大量的研究，能為轉(zhuǎn)基因后代的性狀和機(jī)理分析提供較為完善的參考數(shù)據(jù)。因此，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化模式植物的方法鑒定基因功能的結(jié)果可信性高，所得的結(jié)果距離分子育種的應(yīng)用比較接近。桉樹(shù)是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)的總稱。作為一種集觀賞、用材、紙漿原料、藥用于一體的優(yōu)良樹(shù)種，桉樹(shù)由于其生長(zhǎng)速度快、移栽成活率高等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛的種植。通過(guò)分子生物學(xué)及基因組學(xué)手段篩選及鑒定桉樹(shù)的優(yōu)良基因，并從中發(fā)掘具有能促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生物量應(yīng)用價(jià)值的基因，除了可通過(guò)基因工程改造獲得高產(chǎn)優(yōu)良桉樹(shù)品種奠定基礎(chǔ)外，還可以為其他林木、蔬菜及作物的分子育種提供優(yōu)良的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種桉樹(shù)PGEF13基因及其植物表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及在促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生長(zhǎng)量上的應(yīng)用，以有效促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，提高植物生物量。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，第一方面，本發(fā)明提供一種桉樹(shù)PGEF13基因，其cDNA序列具有如下特征
具有SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 其編碼具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。第二方面，本發(fā)明還提供一種植物表達(dá)載體，其包含如上所述的桉樹(shù)PGEF13基因或其片段。進(jìn)一步地，所述植物表達(dá)載體為pCAMBIA1301。優(yōu)選地，所述植物表達(dá)載體為重組載體 pCAMBIAl301-PGEFl3。第三方面，本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，其包含如上所述的桉樹(shù)PGEF13基因或其片段或者植物表達(dá)載體。進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、農(nóng)桿菌或植物細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌Transl-Tl菌株、農(nóng)桿菌GV3101菌株或雙子葉植物的細(xì)胞。 第四方面，本發(fā)明還提供一種如上所述的基因、植物表達(dá)載體或宿主細(xì)胞在促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生物量方面的應(yīng)用，具體是將所述基因或其片段和/或植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物，或者用所述宿主細(xì)胞感染植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，基因PGEF13或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3被轉(zhuǎn)化入植物，該植物的轉(zhuǎn)化后代與未導(dǎo)入基因PGEF13或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3的對(duì)照植物相比，葉片等營(yíng)養(yǎng)器官的生長(zhǎng)得到促進(jìn)，表現(xiàn)為葉片數(shù)增多，植株直徑增大，同時(shí)地上部分生長(zhǎng)量得到提高。在第二個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，基因PGEF13或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3被轉(zhuǎn)化入植物，該植物的轉(zhuǎn)化后代與未導(dǎo)入基因PGEF13或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3的對(duì)照植物相比，根的生長(zhǎng)得到促進(jìn)，表現(xiàn)為根的長(zhǎng)度增加。在第三個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，基因PGEF13或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3被轉(zhuǎn)化入植物，該植物的轉(zhuǎn)化后與未導(dǎo)入基因PGEF13或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3的對(duì)照植物相比，在組培條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)得到促進(jìn)，生長(zhǎng)量得到提高。通過(guò)采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下有益效果通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的源于桉樹(shù)的PGEF13基因及其編碼的多肽具有促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生物量的功能。具體來(lái)說(shuō)，在植物中提高PGEF13的表達(dá)量可以增加植物葉片數(shù)、植株直徑，促進(jìn)根的生長(zhǎng)，以及提高生物量。本發(fā)明的技術(shù)方案可廣泛應(yīng)用于提高林木、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量。上述的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是指植物在發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)期(Vegetative Phase of Development)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。這個(gè)過(guò)程從胚胎發(fā)生開(kāi)始，一直延續(xù)至植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期，包括種子萌發(fā)和幼苗形成、根和莖的延長(zhǎng)和分支、葉片的形成與延伸，以及根和莖的次生加厚(Taiz等人，Plant Physiology, Sinauer Associates,第三版(2002) ；Leyser 等人，Mechanismsin Plant Development, Blackwell Science Ltd. (2003)X


圖I是PGEF13編碼的多肽的氨基酸序列利用NCBI網(wǎng)站的⑶-Search檢索蛋白保守域數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD v3. 05 - 42589 PSSMs)輸出的結(jié)果。圖2是未轉(zhuǎn)化的Col-O擬南芥和過(guò)表達(dá)PGEF13擬南芥植株在移栽后28天的地上部分生長(zhǎng)狀況對(duì)比照片。圖3是未轉(zhuǎn)化的Col-O擬南芥和過(guò)表達(dá)PGEF13擬南芥植株在移栽后28天的蓮座 直徑和葉片數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖。圖4是未轉(zhuǎn)化的Col-O擬南芥根生長(zhǎng)狀況的照片。圖5是過(guò)表達(dá)PGEF13擬南芥植株根生長(zhǎng)狀況的照片。圖6是是未轉(zhuǎn)化的Col-O擬南芥和過(guò)表達(dá)PGEF13擬南芥幼苗的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)柱狀圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例并參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)該理解的是，以下所述的實(shí)施例僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。一、PGEF13基因的克隆與序列分析
I.桉樹(shù)cDNA的制備
選取新鮮的桉樹(shù)(Mucalyptus)葉片，例如桉屬尾巨桉品種DH32-29 {EucalyptusurophyllaXgrandis cv DH32-29)葉片,迅速放入液氮中冷凍,然后放入-80° C超低溫冰箱(SANY0，MDF-382E)中保存?zhèn)溆?。根?jù)現(xiàn)有的十六燒基三甲基溴化胺(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)提取法(Chang 等人，Plant Molecular Biology Reporter 11(2): 113-116 (1993))提取桉樹(shù)葉片總RNA。使用不含RNA酶的DNA酶(Takara，目錄號(hào)D2270A)處理提取的RNA以清除里面混雜的的基因組DNA。取約5 μ g的桉樹(shù)葉片組織總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，如Invitrogen公司的SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT_PCR(目錄號(hào) 18080-051),合成桉樹(shù)cDNA(DNA序列如SEQ ID NO: I所示)，所述cDNA可編碼氨基酸序列為SEQ ID NO: 2的多肽。合成的cDNA于-20° C保存?zhèn)溆谩?.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法擴(kuò)增PGEF13基因
根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法(Mullis 等人，ColdSpring Harbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986)),使用高保真熱聚合酶，如 invitrogen 的 Platinum Pfx DNA Polymerase (目錄號(hào)11708-039)或者Τ0Υ0Β0的KOD FX (目錄號(hào)KFX_101X5)，設(shè)計(jì)帶有含酶切位點(diǎn)接頭的引物，所述引物對(duì)應(yīng)的序列是SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4，以上述桉樹(shù)cDNA為模板，克隆PGEF13基因。PCR產(chǎn)物可在1%瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶，并使用TaKaRa的MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (目錄號(hào)D823A)回收純化?；厥盏钠问褂闷侥┒丝寺≡噭┖羞B接到克隆載體，例如pEASY-Blunt Cloning Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)CB101)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，將陽(yáng)性菌落送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。選取測(cè)序正確的單菌落保存。3. PGEF13基因保守區(qū)域分析
使用諸如 CD-Search (保守結(jié)構(gòu)域搜索(Conserved Domain Search) ；Marchler~Bauer等人，Nucleic Acids Research 39 (D) : 225-229 (2011);也參見(jiàn)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(National Libraryof Medicine, NLM)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)的萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng)址上對(duì)CD-Search及保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved DomainDatabase)的解釋)之類的分析工具，對(duì)PGEF13編碼的多肽序列(氨基酸序列為SEQ IDNO:2)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。圖I展示了利用⑶-Search以一種算法在 ⑶D數(shù)據(jù)庫(kù)里面檢索的結(jié)果。二、PGEF13過(guò)表擬南芥植株的獲得及其地面部分營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察
1.重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3的構(gòu)建
通過(guò)使用工具酶進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切、目的片段回收和連接，將PGEF13克隆至植物表達(dá)載體，如PCAMBIA1301，使得該基因位于啟動(dòng)子如CaMV 35S啟動(dòng)子的控制下。按照以下操作方法實(shí)施，詳細(xì)的步驟可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行修改使用SanPr印柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司，目錄號(hào)SK8192)從上述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中提取含有PGEF13的重組質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶(NEB,目錄號(hào)R0144)和作71 (NEB,目錄號(hào):R0532)進(jìn)行雙酶切;另取pCAMBIA1301質(zhì)粒，使用汝"/11和進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，分別切下大小約為800bp的PGEF13和大小約為10000 bp的pCAMBIAl301骨架條帶，并使用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver. 3. O (Takara,目錄號(hào)D823A)回收。將上述兩個(gè)片段按照PGEF13:pCAMBIAl301的摩爾比為3:1混合，使用T4 DNA連接酶(Fermentas，目錄號(hào)#EL0011)進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將陽(yáng)性菌落送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。選取測(cè)序正確的單菌落使用SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，所得的質(zhì)粒即為重組載體 pCAMBIAl301-PGEFl3。2.擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化后代的篩選
2.I含有重組載體pCAMBIA1301-PGEF13的根癌農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞的制備
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(Wang等人，Agrobacterium Protocols, HumanPress,第2版(2006))，制備根癌農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞，并使用熱激轉(zhuǎn)化法將重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，制備含有pCAMBIAl301-PGEFl3的根癌農(nóng)桿菌GV3101 細(xì)胞。2. 2擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化后代的篩選
取擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態(tài)型Columbia-O (Col-O)種子，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(Weigel D 等人，Arabidopsis: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press (2002))將種子播種在培養(yǎng)土進(jìn)行種植。種植環(huán)境溫度20-23°C，濕度 70-85%，光照 16 h/天，光照強(qiáng)度 4500 Lux。
以現(xiàn)有的蘸花浸染法(Zhang等人，Nature Protocols 1(2): 641-646 (2006))轉(zhuǎn)化擬南芥及從后代中篩選陽(yáng)性植株。根據(jù)該方法，轉(zhuǎn)化后當(dāng)代收獲的種子為Tl代轉(zhuǎn)基因種子。取擬南芥Tl代轉(zhuǎn)基因種子消毒后在含有50 mg/L潮霉素B (Hygromycin B),l%鹿糖和 O. 8 g/L 的 Murashige and Skoog 培養(yǎng)基(MS 培養(yǎng)基；Murashige 等人，PhysiologiaPIantarum 15(3) : 473-497 (1962))上篩選培養(yǎng)12天，能正常生長(zhǎng)發(fā)育的幼苗即為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性Tl代植株。將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性Tl代植株幼苗小心轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)土上，于上述培養(yǎng)條件中培養(yǎng)，植株成熟后收獲的種子即為T2代轉(zhuǎn)基因種子。為了進(jìn)一步確認(rèn)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，可使用PCR法(Mullis等人，Cold SpringHarbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986))對(duì)篩選得到的陽(yáng)性植株進(jìn)行分子鑒定。在幼苗長(zhǎng)出8-10片葉片后，取一片約I cm長(zhǎng)的葉片提取基因組DNA作為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增超霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hygromycin phosphotransferase, hpt)的特異引物，如序列號(hào)為SEQ ID NO: 5的hpt-F3和序列號(hào)為SEQ ID NO:6的hpt_R3對(duì)hpt基因進(jìn)行擴(kuò)增，能成功擴(kuò)增出約750 bp條帶的樣品對(duì)應(yīng)的植株可確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。 3. PGEF13過(guò)表擬南芥植株地面部分生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察
取上述T2代轉(zhuǎn)基因種子，消毒后在含有25 mg/L潮霉素B，1%蔗糖和O. 8 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)12天，能正常生長(zhǎng)發(fā)育的幼苗即為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性T2代植株。另取非轉(zhuǎn)基因Col-O擬南芥種子消毒后在營(yíng)養(yǎng)成分相同但不含潮霉素B的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天，作為對(duì)照。選取形態(tài)正常的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因幼苗和對(duì)照幼苗分別小心轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)土上，于前述的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)。移栽28天后統(tǒng)計(jì)植株蓮座直徑和葉片數(shù)(樣本量>15)，并拍下生長(zhǎng)狀況的照片，如圖2所示。根據(jù)圖3所示的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，過(guò)表達(dá)PGEF13的擬南芥轉(zhuǎn)化后代(PGEF13-T2)植株相比起未轉(zhuǎn)化的Col-O植株，蓮座直徑和葉片數(shù)均有顯著增加，其中蓮座直徑 PGEF13-T2 為 7. 1±1· 9 cm，Col-O 為 5. 2 ± I. I cm ;葉片數(shù) PGEF13-T2 為 18. 2±2· 3片，Col-O為14. 5±3. 8片，如圖3所示。在t test中，P值〈O. 01，說(shuō)明PGEF13-T2植株較未轉(zhuǎn)化植株在這兩個(gè)指標(biāo)上有明顯提聞。三、PGEF13過(guò)表達(dá)擬南芥植株根系生長(zhǎng)表型
過(guò)表達(dá)PGEF13的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子可根據(jù)以上所述的方法獲得。并可使用垂直平板檢測(cè)分析過(guò)表達(dá)PGEF13的擬南芥植株根系生長(zhǎng)表型。取上述T2代轉(zhuǎn)基因種子，消毒后點(diǎn)播于有25 mg/L潮霉素B，O. 5%蔗糖和O. 8 1%植物凝膠(Phytagel)的垂直MS培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板點(diǎn)10個(gè)種子。另取非轉(zhuǎn)基因Col-O擬南芥種子消毒后點(diǎn)播于相同營(yíng)養(yǎng)成分但不含潮霉素B的垂直MS培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板點(diǎn)10個(gè)種子，作為對(duì)照。接種后的平板擺放在溫度20-23°C，濕度70-85%，光照16 h/天，光照強(qiáng)度2000 Lux的環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)12天后統(tǒng)計(jì)幼苗的根長(zhǎng)(樣本量>15)，并分別拍下生長(zhǎng)狀況的照片，如圖4及圖5所示。并結(jié)合圖6所示的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，PGEF13-T2幼苗根長(zhǎng)為4·5±0·5 cm, Col-O 幼苗根長(zhǎng)為 3. 2±0. 6 cm。在 t test 中，P 值〈O. 01，說(shuō)明 PGEF13-T2植株較未轉(zhuǎn)化植株幼苗的根長(zhǎng)有顯著增加。四、PGEF13過(guò)表達(dá)擬南芥植株無(wú)菌培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀態(tài) 過(guò)表達(dá)PGEF13的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子可根據(jù)以上所述的方法獲得。取上述T2代轉(zhuǎn)基因種子，消毒后在含有25 mg/L潮霉素B，1%蔗糖和O. 8 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)12天，能正常生長(zhǎng)發(fā)育的幼苗即為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性T2代植株。另取非轉(zhuǎn)基因Col-O擬南芥種子消毒后在營(yíng)養(yǎng)成分相同但不含潮霉素B的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天，作為對(duì)照。選取形態(tài)正常的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因幼苗和對(duì)照幼苗分別小心轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，所述的培養(yǎng)瓶為直徑8 cm、高12 cm的玻璃廣口瓶，內(nèi)有60 ml含有1%蔗糖和O. 8 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基，使用通氣的瓶蓋。培養(yǎng)瓶擺放在溫度20-23° C，濕度70-85%，光照16 h/天，光照強(qiáng)度3500 Lux的環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)35天后統(tǒng)計(jì)植株的鮮重(樣本量>15)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，PGEF13-T2 植株鮮重 3. 68±0. 4 g，Col-O 植株鮮重 2. 88±0. 3 g。在 t test 中，P 值〈O. 01，說(shuō)明PGEF13-T2植株較未轉(zhuǎn)化植株在組培條件下，生物量(鮮重)有顯著增加?！?br> 權(quán)利要求
1.一種桉樹(shù)PGEF13基因，其特征在于，其cDNA序列具有如下特征 具有SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 其編碼具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。
2.一種植物表達(dá)載體，其特征在于其包含如權(quán)利要求I所述的桉樹(shù)PGEF13基因或其片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物表達(dá)載體，其特征在于所述植物表達(dá)載體為pCAMBIAl30I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述植物表達(dá)載體為重組載體pCAMBIAl301-PGEFl3 ο
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于包含如權(quán)利要求I所述的桉樹(shù)PGEF13基因或其片段或 者如權(quán)利要求2 4中任一項(xiàng)所述的植物表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、農(nóng)桿菌或植物細(xì)胞。
7.—種如權(quán)利要求I所述的基因在促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生物量方面的應(yīng)用，其特征在于，將所述基因或其片段轉(zhuǎn)化入植物。
8.—種如權(quán)利要求2或3或4所述的植物表達(dá)載體在促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生物量方面的應(yīng)用，其特征在于，將所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物。
9.一種如權(quán)利要求5或6所述的宿主細(xì)胞在促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生物量方面的應(yīng)用，其特征在于，用所述宿主細(xì)胞感染植物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種桉樹(shù)PGEF13基因，其cDNA序列具有如下特征具有SEQIDNO:1所示的DNA序列；或者其編碼具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還提供一種植物表達(dá)載體，其包含如上所述的桉樹(shù)PGEF13基因或其片段。本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包含如上所述的桉樹(shù)PGEF13基因或其片段或如上所述的植物表達(dá)載體。本發(fā)明還提供上述基因、植物表達(dá)載體或宿主細(xì)胞在促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高植物生物量方面的應(yīng)用，具體是將所述基因或其片段和/或植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物，或者用所述宿主細(xì)胞感染植物。通過(guò)在植物中提高PGEF13的表達(dá)量可增加植物葉片數(shù)、植株直徑，促進(jìn)根的生長(zhǎng)，以及提高生物量。本發(fā)明可廣泛用于提高林木、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102888411SQ20121026905
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者李奕恒, 孫長(zhǎng)斌, 許文釗 申請(qǐng)人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司