專利名稱：豬捷申病毒dbn-10021株全基因組序列，測定其的引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及捷申病毒4型全基因組序列測定方法，具體的說是豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列測定方法。
背景技術(shù)：
豬捷申病毒(Porcine teschovirus,豬捷申病毒)可引起豬的腦脊髓灰質(zhì)炎、繁殖障礙、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮膚損傷及無癥狀等多種臨床表現(xiàn)。捷申病毒基因型眾多，目前至少存在11個基因型，并且同一基因型的不同分離株的基因組間也存在較大差異。我國許多研究顯示，豬群中豬捷申病毒的陽性率比較高，而在我國僅見有關(guān)豬捷申病毒2型和豬捷申病毒8型基因組的研究報道，其主要原因在于豬捷申病毒基因組變異大，不易設(shè)計引物，直接影響到豬捷申病毒基因組全長序列的測定。 針對上述問題，目前急需一種有效、簡單、準(zhǔn)確可靠的豬捷申病毒4型全基因組測序方法，并通過該方法得到豬捷申病毒4型的全基因組序列。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題,本發(fā)明提供豬捷申病毒(Porcine teschovirus)DBN_10021株全基因組序列，測定其的引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列，序列如SEQ ID No. I所示。本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列的引物，其包括序列如SEQ ID No. 2 13所示的引物。進(jìn)一步地，所述的引物還可包括SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 15所示的引物。本發(fā)明還提供一種測定擴(kuò)增豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列的方法，其包括如下步驟I)提取豬捷申病毒DBN-10021株RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；2)用SEQ ID No. 2^15所示引物對全基因組序列進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，分別為SEQID No. 2 和 14 擴(kuò)增后再用 SEQ ID No. 3 和 15 嵌套擴(kuò)增；SEQ ID No. 4 和 5 ；SEQ ID No. 6 和7 ；SEQ ID No. 8 和 9 ；SEQ ID No. 10 和 11 ；SEQ ID No. 12 和 13 ；3)目的片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性菌的鑒定、測序；4)利用生物軟件對所測定的序列進(jìn)行比對分析、序列拼接，將6個片段首尾相連，得到豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列。其中，所述PCR反應(yīng)條件參數(shù)為94 V預(yù)變性5min，然后94 °C 3(T60s ；50°C 30 60s ；72°C 20s_2min，進(jìn)行 30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin0本發(fā)明提供的用于測定豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列的引物可以用于制備豬捷申病毒DBN-10021株全基因組測序試劑盒，因此本發(fā)明還提供含有所述引物的豬捷申病毒DBN-10021株全基因組測序試劑盒。所述試劑盒還可含有常規(guī)的PCR試劑，如Taq酶，dNTPs 等。本發(fā)明將病毒基因組序列分為6個片段，用RT-PCR方法擴(kuò)增相應(yīng)的cDNA，將擴(kuò)增片段克隆到T載體進(jìn)行測序，在擴(kuò)增中所用的引物是根據(jù)豬捷申病毒保守區(qū)域的核苷酸序列所設(shè)計的，引物3’端盡可能終止在兼并密碼子較少的氨基酸位置且最后一個堿基盡可能避免終止在氨基酸密碼子的第三位堿基上。本發(fā)明可以有效地擴(kuò)增出目的片段，提供了全基因組序列，有利于研究病毒的分類、進(jìn)化、致病性及分子流行病學(xué)等。本發(fā)明的豬捷申病毒DBN-10021株屬于豬捷申病毒4型毒株，于2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 5573。


圖I所示為捷申病毒各亞型進(jìn)化樹。圖2所示為擴(kuò)增片段I飛的瓊脂凝膠電泳圖片。I飛表示基因組第I飛段；Ml、M2,M3分別表示不同的DNA Marker ;N1、N2、N3分別表示陰性對照。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列的克隆(I)病毒RNA的提取取豬捷申病毒DBN-10021株(CGMCC No. 5573)，經(jīng)PK15細(xì)胞傳代，收集第5代細(xì)胞毒液，反復(fù)凍融3次，然后12000r/min，4°C離心5分鐘。取病毒懸液250 U I放在I. 5ml EP管中，加入0. 75mlTranszol (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，混勻；再加入200 氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫孵育3分鐘。12000r/min4°C離心10分鐘。離心后轉(zhuǎn)移上層水相到新的I. 5ml EP管中，加入0. 5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育10分鐘。12000r/min4°C離心10分鐘，棄去上清，留沉淀。加入lml75%乙醇(DEPC處理的水配制)，劇烈震蕩。12000r/min4°C離心5分鐘，棄上清，室溫晾干沉淀，后將沉淀用5(Tl00 u I RNA溶解液中。(2)病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄利用TransScriptTM First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)制備cDNA。以提取的病毒RNA為模板進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系為RNA8 U I, RandomPrimerl u I, 2XTS Reaction MixlO u I, TransScript RT/RI Enzyme Mixlu I。25°C孵育10min,42°C孵育 30min。之后 85°C加熱 5min 使 TransScript RT/RI Enzyme 失活。(3)引物設(shè)計與合成通過對多個豬捷申病毒全基因組序列的比對，選取保守的序列作為引物，引物3’端盡可能終止在兼并密碼子較少的氨基酸位置且最后一個堿基盡可能避免終止在氨基酸密碼子的第三位堿基上，相鄰的擴(kuò)增片段之間有長短不等的重疊。共設(shè)計12條引物，將病毒的全基因組序列分為6段，具體引物序列及其對應(yīng)位點如表I所示，SEQ ID No. 2和SEQID No. 3分別為與5’RACE試劑盒配套使用的反向引物，SEQ ID No. 14為正向外套引物(試劑盒提供)，SEQ ID No. 2為反向外套引物，SEQ ID No. 15為正向內(nèi)套引物(試劑盒提供)，、SEQID No. 3為反向內(nèi)套引物；SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5為正反引物對；SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7為正反引物對；SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9為正反引物對；SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11為正反引物對；SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13為正反引物對?！癋”代表正向引物，“R”代表反向引物。引物位置以捷申病毒4型PS36株(GenBank登錄號AF296089)的基因組為參考。表I引物信息
權(quán)利要求
1.豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列，其序列如SEQID No. I所示。
2.用于擴(kuò)增權(quán)利要求I所述序列的引物，其包括序列如SEQID No.2 13所示的引物。
3.如權(quán)利要求2所示的引物，其特征在于，還包括序列如SEQID No. 14和SEQ IDNo. 15所示的引物。
4.一種測定權(quán)利要求I所述序列的方法，其特征在于，包括如下步驟 1)提取豬捷申病毒DBN-10021株RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA； 2)用SEQID No. 2 15所示引物對全基因組序列進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，分別為SEQ IDNo. 2 和 14 擴(kuò)增后再用 SEQ ID No. 3 和 15 嵌套擴(kuò)增；SEQ ID No. 4 和 5 ；SEQ ID No. 6 和 7 ;SEQ ID No. 8 和 9 ；SEQ ID No. 10 和 11 ；SEQ ID No. 12 和 13 ； 3)目的片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性菌的鑒定、測序； 4)利用生物軟件對所測定的序列進(jìn)行比對分析、序列拼接，將6個片段首尾相連，得到豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5min,然后 94°C 30 60s ；50 °C 30 60s ；72°C 20s-2min,進(jìn)行 30 個循環(huán)，最后 72°C 延伸IOmin0
6.權(quán)利要求2或3所述引物在制備豬捷申病毒DBN-10021株全基因組測序試劑盒中的應(yīng)用。
7.含有權(quán)利要求2或3所述引物的豬捷申病毒DBN-10021株全基因組測序試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列，測定其的引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明的提供用于擴(kuò)增所述豬捷申病毒DBN-10021株全基因組序列的引物，其包括序列如SEQ ID No.2~13所示的引物。本發(fā)明將病毒基因組序列分為6個片段，用RT-PCR方法擴(kuò)增相應(yīng)的cDNA，可以有效地擴(kuò)增出目的片段，提供了全基因組序列，有利于研究病毒的分類、進(jìn)化、致病性及分子流行病學(xué)等。
文檔編號C12Q1/68GK102776210SQ20121026930
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者宮曉文, 張志榜, 焦連國, 王美君, 王貴華, 趙亞榮 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司