專利名稱：一種鱇浪白魚鰭細胞系的構(gòu)建方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種錬浪白魚鰭細胞系的構(gòu) 建方法，屬于淡水水生生物細胞培養(yǎng)技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
錬浪白魚Anabarilius grahami 隸屬于鯉形目 Cypriniforms、鯉科 Cyprinidae、白魚屬Anabarilius,俗稱白魚,是僅分布于云南撫仙湖的珍稀魚種,是云南四大名魚之一。此魚肉細嫩鮮美，軟刺薄鱗，清香可ロ，是沿湖漁民的主要漁業(yè)對象，歷史上產(chǎn)量曾占撫仙湖總漁產(chǎn)量的70% — 80%。近十多年來，由于外來魚種入侵，以及水質(zhì)惡化，捕撈過度，已處于瀕危邊緣。雖然1999年以來，中國科學院昆明動物研究所人工繁殖鰊浪白魚成功，并有效保護和挽救了這ー珍稀魚種，使其近年產(chǎn)量保持平穩(wěn)上升，但其野生種群的數(shù)量仍在銳減。構(gòu)建與培養(yǎng)動物細胞系已成為研究病毒學、免疫學、遺傳學、毒理學、腫瘤治療的有力工具。錬浪白魚鰭細胞系的建立為錬浪白魚細胞水平理論研究和應用提供可能。經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明的相同報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便易行的錬浪白魚鰭細胞系的構(gòu)建方法，以滿足對錬浪白魚理論研究以及其在功能基因中的應用。本發(fā)明的錬浪白魚鰭細胞系的構(gòu)建方法，具體步驟如下(I)制備細胞培養(yǎng)液選擇DMEM/F12培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細胞生長因子，使胎牛血清的終濃度為20%，人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為5 ng/ml, pH值為
7.0-7. 4，保存于4°C冰箱中，備用；(2)原代培養(yǎng)先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min,對魚進行整體消毒，在超凈臺上取錬浪白魚鰭條組織；然后用含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的HBSS溶液清洗,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 u g /ml，兩性霉素B的濃度為10 u g /ml，然后剪成土 I mm3的小塊，對鰭條組織塊用0. 5%透明質(zhì)酸酶和0. 2%11型膠原酶聯(lián)合消化30min ;經(jīng)上述處理的組織塊均勻接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 u g /ml鏈霉素+10 u g /ml兩性霉素B的細胞培養(yǎng)液5 ml，在28°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)；取完組織的魚體放回魚缸中常規(guī)飼養(yǎng)，兩個月后鰭條重新長出。(3)繼代培養(yǎng)待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用不含抗生素的HBSS溶液清洗兩遍，加入0.25%的胰蛋白酶I ml，消化2 min，細胞變圓后，加入原來吸出的培養(yǎng)液I ml，用吸管吹打培養(yǎng)瓶底，制成細胞懸液；向細胞懸液內(nèi)補入8ml DMEM/F12+20%FBS+5 ng/mlbFGF細胞培養(yǎng)液，然后接種于兩個培養(yǎng)瓶內(nèi)，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞再次長成單層后，仍按步驟(3)進行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。本發(fā)明的有益效果在干I、在保證魚體存活的前提下，操作簡便易行；2、構(gòu)建的錬浪白魚鰭細胞系(AGF)形態(tài)為成纖維樣細胞，細胞生長狀態(tài)良好，可連續(xù)傳代，直接用于錬浪白魚細胞生物學特性及功能基因的研究，滿足了對錬浪白魚分子細胞水平理論研究的需要；
3、該構(gòu)建方法也適用于其他魚類構(gòu)建鰭條的細胞系。
具體實施例方式本發(fā)明的錬浪白魚鰭細胞系的構(gòu)建方法，具體步驟如下I、制備細胞培養(yǎng)液選擇DMEM/F12培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細胞生長因子，使胎牛血清的終濃度為20%，人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為5 ng/ml, pH值為
7.0-7. 4，保存于4°C冰箱中，備用；2、原代培養(yǎng)先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min,對魚進行整體消毒，在超凈臺上取錬浪白魚鰭條組織；然后用含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的HBSS溶液清洗,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 u g /ml，兩性霉素B的濃度為10 u g /ml，然后剪成土 I mm3的小塊，對鰭條組織塊用0. 5%透明質(zhì)酸酶和0. 2%11型膠原酶聯(lián)合消化30min ;經(jīng)上述處理的組織塊均勻接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 u g /ml鏈霉素+10 u g /ml兩性霉素B的細胞培養(yǎng)液5 ml，在28°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)；取完組織的魚體放回魚缸中常規(guī)飼養(yǎng)，兩個月后鰭條重新長出。3、繼代培養(yǎng)待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用不含抗生素的HBSS溶液清洗兩遍，加入0.25%的胰蛋白酶I ml，消化2 min，細胞變圓后，加入原來吸出的培養(yǎng)液I ml，用吸管吹打培養(yǎng)瓶底，制成細胞懸液；向細胞懸液內(nèi)補入8 ml DMEM/F12+20%FBS+5 ng/mlbFGF的細胞培養(yǎng)液，然后接種于兩個培養(yǎng)瓶內(nèi)，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞再次長成單層后，仍按步驟3進行傳代培養(yǎng)。4、細胞凍存對上述構(gòu)建的細胞進行凍存，配置細胞凍存液，分別取胎牛血清，DMEM/F12和DMSO,按5:4:1的體積比混合,現(xiàn)用現(xiàn)配。細胞凍存取處于對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)上述胰酶消化后獲得細胞懸液，1200 rpm離心8 min，棄掉上清液。向細胞沉淀中加入適量配置好的細胞凍存液，重懸，使細胞濃度至IX IO6個/ml，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8 ml無菌凍存管中，每管Iml懸液。將凍存管放入程序降溫盒中，-80°C冰箱過夜，最后放入液氮中長期保存。
5、細胞復蘇對上述凍存的細胞進行復蘇，將凍存管從液氮罐中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌條件下將解凍細胞轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，并加入I ml DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF細胞培養(yǎng)液，1200 rpm離心8 min，去除上清，收集細胞。用10 ml新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至兩個細胞培養(yǎng)瓶中，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長成單層后，按上述方法(步驟3)傳代。
權(quán)利要求
1.一種錬浪白魚鰭細胞系的構(gòu)建方法，其特征在于該構(gòu)建方法的具體步驟如下 a.制備細胞培養(yǎng)液 選擇DMEM/F12培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入胎牛血清和人堿性成纖維細胞生長因子，使胎牛血清的終濃度為20%，人堿性成纖維細胞生長因子的濃度為5 ng/ml，pH值為7. 0-7. 4，保存于4°C冰箱中，備用； b.原代培養(yǎng) 先用8 mg/L高錳酸鉀浸泡鮮活錬浪白魚10 min，對魚進行整體消毒，在超凈臺上取錬浪白魚鰭條組織；用HBSS+100 IU/ml青霉素+100 y g /ml鏈霉素+10 U g /ml兩性霉素B的溶液清洗，然后剪成土 I mm3的小塊，對鰭條組織塊用0. 5%透明質(zhì)酸酶和0. 2%11型膠原酶聯(lián)合消化30 min ;經(jīng)上述處理的組織塊均勻接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml 青霉素 +100 u g /ml 鏈霉素 +10 u g /ml 兩性霉素B的細胞培養(yǎng)液5 ml，在28°C培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)；取完組織的魚體放回魚缸中常規(guī)飼養(yǎng)，兩個月后鰭條重新長出； c.繼代培養(yǎng) 待細胞長成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用不含抗生素的HBSS溶液清洗兩遍，カロ入0.25%的胰蛋白酶I ml，消化2 min，細胞變圓后，加入原來吸出的培養(yǎng)液I ml，用吸管吹打培養(yǎng)瓶底，制成細胞懸液；向細胞懸液內(nèi)補入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF的細胞培養(yǎng)液8 ml，然后接種于兩個培養(yǎng)瓶內(nèi)，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞再次長成單層后，仍按c步驟進行傳代培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鱇浪白魚鰭細胞系的構(gòu)建方法，屬于淡水水生生物細胞培養(yǎng)技術(shù)領域。鱇浪白魚鰭細胞系的構(gòu)建方法，是以鱇浪白魚尾鰭組織細胞為材料，采用組織塊法啟動原代培養(yǎng)，在含有胎牛血清和人堿性成纖維細胞生長因子的pH值為7.0-7.4的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)；采用胰蛋白酶消化法進行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果在于1、在保證魚體存活的前提下，操作簡便易行；2、構(gòu)建的鱇浪白魚鰭細胞系(AGF)形態(tài)為成纖維樣細胞，細胞生長狀態(tài)良好，能夠連續(xù)傳代，直接用于鱇浪白魚細胞生物學特性及功能基因的研究，滿足了對鱇浪白魚分子細胞水平理論研究的需要；3、該構(gòu)建方法也適用于其他魚類構(gòu)建鰭條的細胞系。
文檔編號C12N5/071GK102757934SQ201210277940
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛, 陳小勇 申請人:中國科學院昆明動物研究所