專利名稱：一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點(diǎn)突變及其對(duì)噻呋酰胺抗藥性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點(diǎn)突變及其對(duì)噻呋酰胺抗藥性的方法和專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起的一種世界范圍的水稻病害，該病害引起水稻結(jié)實(shí)率和千粒重顯著降低，甚至植株倒伏枯死，是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一。水稻紋枯病菌屬于立枯絲核菌的AG-I融合群，其基因組序列未知，這也為該病原菌的深入研究帶來(lái)一定困難。隨著矮桿、早熟、多蘗型品種的大量推廣，以及施肥水平的不斷提高，水稻紋枯病危害逐步加重，近年來(lái)已成為我國(guó)水稻三大病害之首，嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量和質(zhì)量。目前對(duì)水稻紋枯病的防治以化學(xué)措施為主。噻呋酰胺(thifluzamide)商品名為“滿穗”，是陶氏益農(nóng)公司開發(fā)的噻二唑羧酰苯胺類化合物，是近年來(lái)推出的新型、高效防治紋枯病藥劑。噻呋酰胺屬于呼吸抑制劑中作用于復(fù)合物II處的琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHIs)，這類藥劑還包括萎銹靈、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等，它們具有相似的作用機(jī)制和抗性機(jī)制，相互間具有正交互抗藥性，多對(duì)擔(dān)子菌或子囊菌特效。使用初期，這類藥劑因其用藥量少，防效顯著而備受青睞，但因其作用位點(diǎn)單一，田間很快就產(chǎn)生了抗藥性。已有研究發(fā)現(xiàn)，病原菌對(duì)此類藥劑的抗性機(jī)制主要是琥珀酸脫氫酶B、C、D亞基(sdhB、sdhC、sdhD)發(fā)生點(diǎn)突變所致，如玉米瘤黑粉病菌、小麥殼針孢葉枯病菌、灰霉菌等均在sdhB第三個(gè)半胱氨酸簇的保守組氨酸位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，灰蓋鬼傘病菌、菌核病菌等則在膜錨蛋白sdhC、sdhD位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，脫氮副球菌在sdhB、sdhD發(fā)生點(diǎn)突變，而鏈格孢菌、米曲霉菌、多主棒孢在sdhB、sdhC、sdhD基因均發(fā)生突變。水稻紋枯病菌對(duì)噻呋酰胺的抗性機(jī)制目前還未明確，明確其具體的抗性基因及抗性檢測(cè)方法，可以對(duì)抗性菌株進(jìn)行早期檢測(cè)，了解其抗性發(fā)展動(dòng)態(tài)，制定合理的病害管理方案，延緩抗藥性的產(chǎn)生。傳統(tǒng)的抗性檢測(cè)方法主要為室內(nèi)生物學(xué)測(cè)定，包括菌絲生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法、菌絲干重法、水平擴(kuò)散法等。這些傳統(tǒng)的敏感性測(cè)定方法均需要制備含藥培養(yǎng)基，計(jì)算抑制中濃度，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，靈敏度低。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子技術(shù)得以在抗藥性檢測(cè)中應(yīng)用，其速度快，效率高，是田間抗性檢測(cè)的理想方法。針對(duì)單堿基突變引起的抗性，AS-PCR和CAPS方法已成功應(yīng)用于抗性菌株的分子檢測(cè)。等位特異PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)是在引物的3’端設(shè)計(jì)一個(gè)堿基與突變位點(diǎn)匹配，在PCR擴(kuò)增時(shí)引物只與突變菌株結(jié)合，敏感菌株的DNA則不能擴(kuò)增，從而將敏感和抗性菌株區(qū)分開來(lái)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在原引物基礎(chǔ)上，改變倒數(shù)第二個(gè)堿基為不同核苷酸后，可以顯著提高引物的特異性，使得AS-PCR技術(shù)應(yīng)用更為廣泛。CAPS (Cleaved amplified polymorphicsequences)是酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列標(biāo)記技術(shù)，也稱為PCR-RFLP技術(shù)，敏感和抗性菌株由于核苷酸序列的差異可能導(dǎo)致了酶切位點(diǎn)的改變，對(duì)PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行限制性酶切，經(jīng)電泳分離后敏感和抗性菌株的表型不同，從而加以區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供兩種檢測(cè)或輔助檢測(cè)水稻紋枯病菌中SdhB基因是否存在突變位點(diǎn)的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的第一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟以待測(cè)水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO : I和SEQ ID NO 2所示引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若能擴(kuò)增出條帶，則所述待測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點(diǎn)；所述突變位點(diǎn)指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核 苷酸為C和T雜合或T純合。上述過(guò)程中，所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。上述過(guò)程中，所述PCR擴(kuò)增中，退火溫度為56°C。本發(fā)明所提供的另一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟以待測(cè)水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切產(chǎn)物中含有230bp片段，則所述待測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點(diǎn)；所述突變位點(diǎn)指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。上述過(guò)程中，所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點(diǎn)的引物對(duì)，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供水稻紋枯病菌中sdhB基因或蛋白的突變位點(diǎn)。本發(fā)明所提供的水稻紋枯病菌中sdhB基因的一個(gè)突變位點(diǎn)，為水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。其中，所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ ID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本發(fā)明所提供的水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的一個(gè)突變位點(diǎn)，為水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸為組氨酸與酪氨酸雜合或純合的酪氨酸。其中，所述sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸也就是SEQ ID NO :3中自N端起第249位氨基酸。上述任一所述突變位點(diǎn)在鑒定水稻紋枯病菌抗藥性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述抗藥性為抗噻呋酰胺。上述應(yīng)用中，存在所述突變位點(diǎn)的水稻紋枯病菌具有或候選具有抗藥性。SEQ ID NO :3所示蛋白或SEQ ID NO :4所示基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述中，任一所述水稻紋枯病菌具體是立枯絲核菌。
上述中，所述敏感菌株為噻呋酰胺的平均EC5tl小于O. I μ g/ml，抗性菌株為噻呋酰胺的平均 EC50 為 19. 558 μ g/ml。本發(fā)明提供的檢測(cè)水稻紋枯病菌對(duì)噻呋酰胺產(chǎn)生抗藥性的點(diǎn)突變的方法，對(duì)抗性菌株進(jìn)行高靈敏度、簡(jiǎn)單快速的分子檢測(cè)，及時(shí)了解抗藥性發(fā)生動(dòng)態(tài)，對(duì)制定合理的病害管理方案、有效控制抗藥性病害發(fā)展具有重要意義。本發(fā)明方法具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)結(jié)果可靠用本發(fā)明建立的分子檢測(cè)方法檢測(cè)菌株DNA，所有的抗性菌株都能與敏感菌株區(qū)分開來(lái)，其結(jié)果可靠性有保證。簡(jiǎn)單快速傳統(tǒng)的生物學(xué)測(cè)定方法從病菌分離，到敏感性檢測(cè)，至少需要5天時(shí)間，工作量大，周期長(zhǎng)。而分子檢測(cè)從提DNA到PCR或酶切分析，最多需要I. 5天時(shí)間，省時(shí) 省工。


圖I為水稻紋枯病菌敏感與抗性菌株的序列比對(duì)。A :sdhB、sdhC、sdhD基因的突變情況，B sdhB基因975位的堿基雜合，C :敏感菌株與抗性菌株的sdhB氨基酸比對(duì)。圖2為抗性與敏感菌株的NlaIV酶切位點(diǎn)。圖3為CAPS方法酶切檢測(cè)結(jié)果。I 4泳道為敏感菌株，5 16泳道為抗性菌株。圖4為AS-PCR方法檢測(cè)水稻紋枯病菌抗性突變體。A :四對(duì)AS-PCR引物在不同溫度條件下的電泳結(jié)果。B :引物BF975C/BR32在56°C下的擴(kuò)增結(jié)果。S為敏感菌株，R為抗性雜合菌株，T為抗性純合菌株。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。文中“抗性菌株”均指對(duì)噻呋酰胺抗性的立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKiihn);“敏感菌株”均指對(duì)噻呋酰胺敏感的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。下述實(shí)施例中使用的立枯絲核菌為抗性菌株J-I，J-3，J-3-1、J-6、J_10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、B-U B-I-U B-1-31、T2 ;敏感菌株 FBS-3、B310、D179、JHT158-3,JHM-4 和 E67。上述菌株分別采自FBS-3(福建)，B310、B-1、B-1-1、B-1-31 (廣東)，D179 (廣西)，JHM-4、JHT158-3, J-I、J-3、J-3-1、J-6、J-10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、T2 (吉林)，E67(江蘇)。通過(guò)形態(tài)學(xué)并結(jié)合分子生物學(xué)方法鑒定所有菌株為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani Kiihn)。實(shí)施例I、立枯絲核菌對(duì)噻呋酰胺的敏感性測(cè)定五株立枯絲核菌敏感菌株，菌株編號(hào)分別為FBS-3，B310, D179，JHT158-3, E67 ;十株立枯絲核菌抗性菌株，菌株編號(hào)分別為J-3，J-3-1，J-24，J-20, B-I, B-1-31, J-14，J-6，J-I 和 T2。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200g，瓊脂粉14g，葡萄糖18g，蒸餾水定容至1L，121°C濕熱滅菌20分鐘。
I、實(shí)驗(yàn)步驟如下I)將噻呋酰胺用二甲基亞砜(DMSO)配成105μ g/ml的母液。對(duì)于立枯絲核菌敏感菌株的敏感性測(cè)定，將噻呋酰胺逐級(jí)稀釋成500 μ g/mL, 100 μ g/mL, 50 μ g/mL, 25 μ g/mL, 10 μ g/mL的濃度梯度；對(duì)于立枯絲核菌抗性雜合菌株的敏感性測(cè)定，將供試藥劑噻呋酰胺逐級(jí)稀釋成 2 X IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, I. 5 X IO3 μ g/mL, 500 μ g/mL, 200 μ g/mL 的濃度梯度；對(duì)于立枯絲核菌抗性純合菌株的敏感性測(cè)定，將供試藥劑噻呋酰胺逐級(jí)稀釋成 2 X IO5 μ g/mL, 8 X IO4 μ g/mL, IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, 2. 5 X IO3 μ g/mL, IO3 μ g/mL,500 μ g/mL的濃度梯度。2)用移液槍吸取噻呋酰胺藥液60 μ I加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養(yǎng)基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培 養(yǎng)基倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，設(shè)只加60 μ I二甲基亞砜的處理為空白對(duì)照，每個(gè)比例藥劑設(shè)3次重復(fù)。3)立枯絲核菌在PDA平板上培養(yǎng)3天后，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為O. 5cm的菌餅，菌絲面向下接種于步驟2)中的帶藥和對(duì)照培養(yǎng)基中，置于28°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，I. 5d后測(cè)量菌落直徑。4)十字交叉法測(cè)量菌落直徑，根據(jù)菌落平均直徑值計(jì)算出各濃度藥劑對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制率。然后將抑制率轉(zhuǎn)化成機(jī)率值(Y)，藥劑濃度轉(zhuǎn)換成以10為底的對(duì)數(shù)值(X)，在Microsoft Excel中作回歸直線，求出噻呋酰胺對(duì)立枯絲核菌的毒力回歸曲線方程Y=a+bX,以及相關(guān)系數(shù)r和有效抑制中濃度EC5tl值，并計(jì)算抗性倍數(shù)。
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抗性感菌株的ECso
抗件倍數(shù)= ____
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敏慼菌株I 平均EC502.結(jié)果表I.立枯絲核菌對(duì)噻呋酰胺的敏感性
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)水稻紋枯病菌中SdhB基因是否存在突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟 以待測(cè)水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若能擴(kuò)增出條帶，則所述待測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點(diǎn)； 所述突變位點(diǎn)指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增中，退火溫度為56°C。
3.—種檢測(cè)或輔助檢測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟 以待測(cè)水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切產(chǎn)物中含有230bp片段，則所述待測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點(diǎn)； 所述突變位點(diǎn)指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
4.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點(diǎn)的引物對(duì)，由SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。
5.水稻紋枯病菌中sdhB基因的一個(gè)突變位點(diǎn)，為水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
6.水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的一個(gè)突變位點(diǎn)，為水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸為組氨酸與酪氨酸雜合或純合的酪氨酸。
7.權(quán)利要求5或6所述突變位點(diǎn)在鑒定水稻紋枯病菌抗藥性中的應(yīng)用；所述抗藥性為抗噻呋酰胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于存在所述突變位點(diǎn)的水稻紋枯病菌具有或候選具有抗藥性。
9.SEQ ID NO 3所示蛋白。
10.SEQ ID NO 4 所示基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及及一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點(diǎn)突變及其對(duì)噻呋酰胺抗藥性的分子檢測(cè)方法和專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該引物對(duì)，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成。本發(fā)明提供的檢測(cè)水稻紋枯病菌對(duì)噻呋酰胺產(chǎn)生抗藥性的點(diǎn)突變的方法，具有高靈敏度、簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，可以有效地區(qū)分敏感菌株和抗藥性菌株，用于檢測(cè)田間水稻紋枯病菌對(duì)噻呋酰胺的抗性發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)。本發(fā)明對(duì)于抗性病害的早期預(yù)警，以及制定合理的病害管理方案、有效控制抗藥性病害發(fā)展具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102864220SQ201210281520
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者劉西莉, 牟文君, 李波濤, 劉鵬飛, 李健強(qiáng), 王厚涵, 林東 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)