專利名稱：實(shí)時熒光定量rt-pcr定量檢測南方水稻黑條矮縮病植株中病毒rna拷貝數(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻植株上南方水稻黑條矮縮病毒的檢測及病毒RNA拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
南方水稻黑條矮縮病毒(Southernrice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)第2組的一個建議新種。主要由白背飛風(fēng)(Sogatella furcifera)以持久性不經(jīng)卵的方式傳播,可侵染水稻、玉米等引起南方水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病。該病毒粒體球狀，基因組由10條雙鏈RNA組成。水稻各生育期均能夠受到SRBSDV的浸染，田間癥狀主要表現(xiàn)為植株矮縮、葉色深綠、葉背及莖桿有初期乳白色、后期褐色的瘤狀突起，拔節(jié)期病株莖節(jié)部數(shù)節(jié)產(chǎn)生倒生的氣生須根及高節(jié)·位分蘗，寄主除水稻外還包括玉米及多種雜草。對水稻的產(chǎn)量影響很大，重病田甚至可導(dǎo)致無產(chǎn)量。近年來該病在長江下游地區(qū)蔓延發(fā)生，且呈日漸嚴(yán)重的趨勢，2009年南方水稻黑條矮縮病毒全國發(fā)生面積達(dá)300萬畝，2010年迅速上升至1900萬畝，僅湖南省就發(fā)生近1000萬畝，絕收面積8萬畝，給水稻生產(chǎn)帶來了巨大的損失。迫切需要建立可靠、準(zhǔn)確的檢測方法。目前，植物病毒常用的檢測方法有生物學(xué)接種實(shí)驗(yàn)，血清學(xué)檢測，電鏡觀察及分子方法檢測。但由于SRBSDV與水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)基因組序列同源性高，在田間癥狀、病毒粒體形態(tài)、大小及血清學(xué)等多方面特征非常相似，所以給其診斷及鑒定造成了困難，而且傳統(tǒng)方法存在耗時長、操作復(fù)雜及成本高等缺陷，PCR等分子方法的敏感性高，但只能進(jìn)行半定量或得出“有或無”的結(jié)論，不能準(zhǔn)確定量病毒RNA拷貝數(shù)，使得發(fā)病機(jī)制及SRBSDV的基礎(chǔ)研究等受到了一定的限制。Real time RT-PCR是一種簡單有效的檢測基因拷貝數(shù)的方法，實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，可精確地判斷病毒RNA的拷貝數(shù)，而且具有耗時少，靈敏性高、操作簡便、安全經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。SYBR Green I是一種雙鏈DNA染料，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，在擴(kuò)增體系中加入該染料即可直接實(shí)時檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。該染料沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，對不同模板不需特別定制，不需要設(shè)計特異性很好的探針，通用性比較好。可以通過測定擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線來正確區(qū)分特異性與非特異性。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，只要獲得未知樣品的循環(huán)閾值(threshold cycle, (^值)，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。擁有常規(guī)PCR技術(shù)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)，通過特異性引物或探針與靶標(biāo)基因的特異性雜交來完成模板的鑒別，準(zhǔn)確性很高，不易出現(xiàn)二聚體等非特異性產(chǎn)物；靈敏度更高，用能夠產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標(biāo)記的序列特異性熒光探針或能量信號轉(zhuǎn)移探針等方法獲得，極大地提高了檢測的靈敏度；精確性好，可以利用指數(shù)期的Ct值精確定量起始模板量，還可以檢測到單拷貝基因；快速、簡便，擴(kuò)增和檢測在同一管內(nèi)完成，不需要開蓋進(jìn)行電泳檢測，大大減少了操作、縮短了時間，避免了交叉污染、環(huán)境污染，有效地解決了 PCR污染問題；自動化程度高，將光譜技術(shù)于計算機(jī)技術(shù)結(jié)合使用，擴(kuò)增和檢測是同步完成，通過計算機(jī)進(jìn)行實(shí)時檢測，而且操作系統(tǒng)封閉。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)正在越來越廣泛的應(yīng)用到科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測并準(zhǔn)確定量水稻病株中南方水稻黑條矮縮病毒的方法，通過該方法可以排除水稻黑條矮縮病毒的干擾，快速診斷出水稻植株中是否攜帶南方水稻黑條矮縮病毒并得到病毒RNA的拷貝數(shù)。本發(fā)明所提供的一種快速檢測并定量水稻植株中南方水稻黑條矮縮病毒的方法，是通過以下方法獲得的I)根據(jù)NCBI已報道的南方水稻黑條矮縮病毒S9核苷酸序列，通過軟件DNAstar·分析后選擇相對保守區(qū)域(尤其是與RBSDV相比)，利用EU523359. I上的對應(yīng)區(qū)域通過Primer5設(shè)計引物，選擇最佳的2條引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R ；2) TRIzol ReaSent (Invitrogen)提取水稻病株總 RNA ;3)以提取的水稻病株總RNA為模板，SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R為引物進(jìn)行RT-PCR獲得目的基因，割膠回收SRBSDV S9目的片段(141bp)，將其連接pGEM_T easy構(gòu)建克隆載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，篩選、鑒定獲得陽性克隆，提取并純化重組質(zhì)粒，經(jīng)RT-PCR和BlAST分析再次鑒定重組質(zhì)粒，至此獲得含有目的片段的重組質(zhì)粒。4)以限制性內(nèi)切酶Sal I對陽性重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行單酶切，回收純化獲得線狀質(zhì)粒DNA,以含有目的片段的線狀質(zhì)粒DNA為模板,根據(jù)T7Transcription Kit (Fermentas)的說明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得線狀RNA,根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄純化試劑盒EZ-IOSpin CoIumn5 MinutesRNA Cleanup&Concentration Kit的說明純化體外轉(zhuǎn)錄的RNA,得到RNA標(biāo)準(zhǔn)品；5)參照試劑盒 iScript One-Step RT-PCR Kit With SYBR Green (BIO-RAD)的要求，以得到RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，對引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R的濃度以5X5矩陣形式(上、下游引物終濃度分別為100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系；在55-651范圍內(nèi)對退火-延伸進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件，結(jié)果數(shù)據(jù)通過軟件 IQ5 Optical System Software Version 2. 0 分析；6)計算標(biāo)準(zhǔn)品RNA拷貝數(shù)，用Nuclease-free water進(jìn)行10倍梯度稀釋(2. 5 X 101CI_2· 5 X IO4Copies/μ L),用優(yōu)化得到 SYBR Green I-based one-step real timeRT-PCR最佳反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到各自的Ct值，利用隨機(jī)軟件分析得到定量曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線中初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X軸)、對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)(y軸)；7) Real time RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，從55°C到95°C，每隔O. 5°C (80個循環(huán))測定擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光值，利用隨機(jī)軟件分析得到熔解曲線，判斷該方法的特異性。8)與 RT-PCR 方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證 SYBR Green I-based one-step real timeRT-PCR的靈敏性。本發(fā)明提供的引物序列如下
SRBSDV-S9-F GAGACCCACCTCCACTGATTSRBSDV-S9-R ACGTTTACCACTGCGCCTTCSYBR Green I-based one-step real time RT-PCR反應(yīng)體系中引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R的濃度都為300nM時擴(kuò)增效果最佳，退火-延伸溫度為60. (TC最合適。依據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以準(zhǔn)確定量田間水稻病株樣品中SRBSDV RNA拷貝數(shù)，通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線可以判定該方法的特異性。一種檢測并定量植株中南方水稻黑條矮縮病毒RNA拷貝數(shù)方法的應(yīng)用包括在水稻和玉米等疑似病株的快速診斷與定量。利用這一方法可以快速得到南方水稻黑條矮縮病毒植株樣品中SRBSDVRNA拷貝數(shù)，為該病毒病的發(fā)病機(jī)制及SRBSDV的基礎(chǔ)研究等提供了支持。·


圖I 引物濃度優(yōu)化(1，SRBSDV-S9-F 和 SRBSDV-S9-R 終濃度均為 300nM ;2，SRBSDV-S9-F 終濃度 400nM 和 SRBSDV-S9-R 終濃度 300nM ;3，SRBSDV-S9-F 終濃度 500nM 和SRBSDV-S9-R 終濃度 300nM)。圖2 溫度梯度優(yōu)化(1, 56. 4 0C ;2，60. 0°C ;3，57.9°C ;4，55.4°C ;5，63· I °C ;6，65. 3 °C )。圖310倍系列稀釋RNA標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量曲線(由左至右依次為2. 5X101(I，
2.5 X IO9, 2. 5 X IO8, 2. 5 X IO7, 2. 5 X IO6, 2. 5 X IO5, 2. 5 X IO4Copies/ μ L 的 RNA 標(biāo)準(zhǔn)品)。圖4以10倍系列梯度稀釋RNA標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(2. 5 X 1010copies/μ L~2. 5 X IO4Copies/ μ L)。圖510倍系列稀釋RNA標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線。具體實(shí)施方法實(shí)施例I，體外轉(zhuǎn)錄與純化制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品選擇合適的限制性內(nèi)切酶Sal I，按照表I依次加入試劑，37°C 8h，對陽性重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行單酶切。表I限制性內(nèi)切酶分析體系Tablel The system of restriction enzyme analysis
_ ^
j Buffer2.0 μΕ
質(zhì)粒15 μ
Sail1.0 μ
0.1%DEPC 處理水2.0 μ 單酶切產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳，按照AxyPrep DNA Gel Extration Kit(Axygen)的回收純化說明書進(jìn)行回收獲得線狀質(zhì)粒DNA。以線狀質(zhì)粒DNA為模板，SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R為引物進(jìn)行PCR鑒定線狀質(zhì)粒DNA，常規(guī)PCR體系(25 μ L)，擴(kuò)增條件首先，在95°C預(yù)變性5min，接著在以下條件下進(jìn)行35個循環(huán)95°C變性45s，57_60°C退火45s，72°C延伸30s，在最后一個循環(huán)結(jié)束后，72°C保溫lOmin，取2 μ L PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以含有目的片段的線狀質(zhì)粒DNA為模板,根據(jù)Τ7 Transcription Kit (Fermentas)的說明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得線狀RNA。(I)按照表2順序依次加入試劑，完全混勻，稍作離心，37°C 2h，即為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；表2體外轉(zhuǎn)錄Table2 In vitro transcription
權(quán)利要求
1.一種準(zhǔn)確檢測并定量植株上南方水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于利用SYBRGreen I-based one-step real time RT-PCR反應(yīng)的特異性引物，以提取的水稻病毒總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)完成后通過軟件分析數(shù)據(jù)，該方法可以排除水稻黑條矮縮病的干擾，準(zhǔn)確鑒定出南方水稻黑條矮縮病毒植株中的病毒，并同時獲得SRBSDV RNA的準(zhǔn)確拷貝數(shù)。
上述“ SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR 反應(yīng)的特異性引物”是指以下2條引物SRBSDV-S9-F GAGACCCACCTCCACTGATTSRBSDV-S9-R ACGTTTACCACTGCGCCTTC 。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水稻植株上南方水稻黑條矮縮病毒的檢測及RNA拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量方法。利用這一方法可以排除水稻黑條矮縮病的干擾，快速得到南方水稻黑條矮縮病毒植株樣品中病毒RNA的拷貝數(shù)，進(jìn)而為SRBSDV的致病機(jī)制、分子生物學(xué)研究等奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/70GK102787176SQ201210281579
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者周彤, 周益軍, 杜琳琳 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院