專利名稱：一種纖維素酶水解促進(jìn)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶水解促進(jìn)劑，尤其是一種纖維素酶水解促進(jìn)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在化石能源即將消耗殆盡的今天，開發(fā)可再生能源是人類維持社會(huì)發(fā)展的必然趨勢。燃料乙醇的使用能降低化石燃料的用量，減輕日益嚴(yán)重的化石環(huán)境污染問題，因此世界各國都在大力開發(fā)燃料乙醇生產(chǎn)技術(shù)。燃料乙醇作為目前應(yīng)用最為廣泛的可再生機(jī)動(dòng)燃料，其商業(yè)化生產(chǎn)主要以淀粉和糖類作物為原料，如世界乙醇產(chǎn)量第一大國(巴西)就以甘蔗作為原料進(jìn)行生產(chǎn)，美國則以玉米作為原料進(jìn)行生產(chǎn)。近年來，商業(yè)化使用玉米等糧食作物進(jìn)行生產(chǎn)導(dǎo)致糧食價(jià)格的上漲，加劇了世界糧食危機(jī)，迫使世界各國提倡以非糧食原料進(jìn)行燃料乙醇的生產(chǎn)與開發(fā)。我國作為人口大國，糧食安全顯得尤為重要，因此我國也明確 強(qiáng)調(diào)開發(fā)使用非糧食原料進(jìn)行乙醇生產(chǎn)。木質(zhì)纖維生物質(zhì)作為地球儲(chǔ)量最為豐富的生物質(zhì)資源，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，纖維素和半纖維素通過化學(xué)法或者酶法可以降解為單體糖，這些單糖通過微生物酵母發(fā)酵可以轉(zhuǎn)化為燃料乙醇。木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為燃料乙醇過程，因?yàn)榫哂袕V泛原料來源，工藝環(huán)境友好，條件溫和，是目前世界研究開發(fā)熱點(diǎn)。木質(zhì)纖維原料具有比淀粉類原料更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，纖維素被半纖維素和木質(zhì)素包裹著，這種結(jié)構(gòu)使得木質(zhì)纖維原料具有更高的穩(wěn)定性和抗生物降解性。實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化首先要先將纖維素和半纖維素等多糖類物質(zhì)降解為微生物能代謝的單糖物質(zhì)，目前常用酸水解和酶水解。作為傳統(tǒng)工藝，酸水解具有較高的效率，但是酸水解工藝對(duì)設(shè)備要求高，需要脫毒和中和過程，不符合綠色化工原則，不代表未來發(fā)展方向。酶水解具有條件溫和，環(huán)境友好以及水解過程和后期發(fā)酵過程兼容性好等特點(diǎn)，是目前研究最多的工藝。植物纖維素資源是地球上最大的可利用的再生資源，有效地水解纖維素為葡萄糖進(jìn)而發(fā)酵為乙醇等，將會(huì)減輕人類糧食和能源的壓力。但是，酶水解工藝目前還不具備規(guī)?；瘧?yīng)用的可能，這由三方面的原因?qū)е?、酶生產(chǎn)成本居高，盡管研究致力于不斷降低酶生產(chǎn)成本，04年美國的可再生能源實(shí)驗(yàn)室將酶生產(chǎn)成本降低到了原來的1/10，酶生產(chǎn)成本仍然達(dá)不到規(guī)模應(yīng)用的要求；2、木質(zhì)纖維原料復(fù)雜的結(jié)構(gòu)降低了纖維素酶對(duì)纖維素的可及性，也就是降低了酶水解效率，增大酶用量；3、原料中木質(zhì)素吸附部分纖維素酶組分，這也大大降低酶有效組分濃度。目前，提高纖維素酶水解效率的方法如下1)選育和開發(fā)能生產(chǎn)高效酶系的菌株，采用過程集成技術(shù)去消除酶濃縮成本從而降低酶生產(chǎn)成本；2)對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理提高纖維素酶的可及性，或者采用一些工業(yè)廢棄木質(zhì)纖維素作為原料，這些原料通常在其產(chǎn)生過程中已經(jīng)過了一些處理，具有疏松結(jié)構(gòu)，易于被酶水解；3)采用表面活性劑降低木質(zhì)素對(duì)酶組分的吸附，或者通過一定預(yù)處理降低原料中木質(zhì)素的含量。木質(zhì)素通過植物的光合作用產(chǎn)生，基本結(jié)構(gòu)為苯丙烷，木質(zhì)素的存在會(huì)阻礙酶與底物的接觸，導(dǎo)致酶水解效率降低。采用表面活性劑是行之有效且實(shí)用的一種方法，但化學(xué)合成表面活性劑合成成本高，同時(shí)其生物難降解性會(huì)增加下游生物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物分離過程的負(fù)擔(dān)。天然表面活性劑中蛋白類具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，其能作為下游生物轉(zhuǎn)化過程的潛在營養(yǎng)-氮源。盡管牛血清蛋白等精制的蛋白提高酶活的效果顯著，但其不適合用作酶水解添加劑，因?yàn)槠渫瑯泳哂懈叩纳a(chǎn)成本。因此，開發(fā)低廉有效的蛋白作為表面活性劑成為亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種纖維素酶水解促進(jìn)劑及其在提高纖維素酶水解效率中的應(yīng)用。所述纖維素酶水解促進(jìn)劑是將酵母或酵母廢棄物加入到水中，混勻，調(diào)pH值，力口熱處理得到。上述酵母廢棄物可進(jìn)一步離心，取輕相部分處理。其中，調(diào)pH值至2.0-7.5，所述加熱處理的處理溫度100-1211;處理時(shí)間5_60mino 本發(fā)明還提供一種提高纖維素酶水解效率的方法，包括在纖維素原料中加入上述纖維素酶水解促進(jìn)劑、纖維素酶進(jìn)行酶水解。具體地，包括以下步驟I)對(duì)糠醛渣水溶液進(jìn)行堿中和、過濾，得到糠醛渣濾渣；2)糖化加入上述纖維素酶水解促進(jìn)劑、纖維素酶進(jìn)行酶水解，得酶水解液。所述糠醛渣水溶液含有9-12%的糠醛渣，所述堿中和為用固體NaOH中和糠醛渣水溶液至PH5飛，所述糠醛渣濾渣含水量8(Γ85%。所述糖化為處理后的糠醛渣濾渣經(jīng)過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為3 9%糠醛渣(w/v),纖維素酶用量12-15FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度10g/l-30g/I，糖化溫度為45-47 °C，糖化時(shí)間48-96h。其中，步驟2)中所述纖維素酶由適應(yīng)性培養(yǎng)的擬康氏木霉得到。所述擬康氏木霉的適應(yīng)性培養(yǎng)的條件在2%糠醛渣固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)擬康氏木霉菌種的孢子；將孢子用生理鹽水稀釋；將孢子懸浮液接種到含糠醛渣的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述2%糠醛渣固體培養(yǎng)基組成為4g糠醛渣、200ml Mandels營養(yǎng)鹽和4g瓊脂，所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。在步驟2)得到的酶水解液中進(jìn)一步加入接種濃度I. 25g/l的酵母或加入接種濃度3g/l的乳酸菌，溫度為38-42°C，發(fā)酵72-120h，pH值5. 5-6. 5，進(jìn)行發(fā)酵，得到乙醇或乳酸。其中，所述酵母或乳酸菌經(jīng)步驟I)中所述過濾得到的糠醛渣中和濾液進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)。適應(yīng)性培養(yǎng)條件為每kg活菌加入15L糠醛渣中和濾液，使乳酸菌或酵母在發(fā)酵使用前提前適應(yīng)含抑制物發(fā)酵液環(huán)境。所述乳酸菌的適應(yīng)性培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度為30-32°C，培養(yǎng)時(shí)間為32_45h，pH 值 6. 0-6. 5，培養(yǎng)基組成KH2PO4 O. 5g/l, MgSO4 · 7Η200· 5g/l, NaCl O. lg/1,固體 CaCO32% (w/v)，糠醛渣中和濾液。所述酵母的適應(yīng)性培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度為30_32°C，培養(yǎng)時(shí)間為18_24h，pH值
4.5-6. 0，培養(yǎng)基組成=KH2PO4O. 5g/l，MgSO4 · 7H200. 5g/l，糠醛渣中和濾液。
所述纖維素酶水解促進(jìn)劑的活性組分主要是低分子量的蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，通過酸熱處理可使大分子酵母蛋白降解為低分子量物質(zhì)。本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明酶水解促進(jìn)劑原料酵母價(jià)格低廉，來源廣泛，其能從工業(yè)廢棄資源中獲得。(2)本發(fā)明酶水解促進(jìn)劑制備工藝簡 單，易于實(shí)現(xiàn)，和現(xiàn)有工業(yè)具有良好兼容性。(3)本發(fā)明酶水解促進(jìn)劑能明顯提高酶水解效率。(4)本發(fā)明酶水解促進(jìn)劑具有良好的生物兼容性，其加入基本對(duì)后期生物轉(zhuǎn)化無抑制作用。(5)本發(fā)明酶水解促進(jìn)劑能同時(shí)作為發(fā)酵微生物優(yōu)良的營養(yǎng)源，其能取代合成培養(yǎng)基，大大降低發(fā)酵培養(yǎng)基的成本。(6)本發(fā)明原料酵母含有一定量的多糖(約20%)，同樣能為生物轉(zhuǎn)化過程提供碳源，實(shí)現(xiàn)酵母組分的全利用。(7)本發(fā)明原料可降低酶水解木質(zhì)纖維原料過程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同時(shí)較大程度降低下游轉(zhuǎn)化過程化學(xué)品的消耗。


圖I為本發(fā)明的工藝流程。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。質(zhì)量體積比(w/v)為g/Ι，工業(yè)糠醛渣購自河北春蕾集團(tuán)，含水量55飛0%，pH值2 3。擬康氏木霉菌購自中國工業(yè)微生物保藏管理中心。酵母為耐高溫型安琪活性干酵母，乳酸菌為嗜熱乳桿菌，均為市售商品。實(shí)施例II、糠醛渣預(yù)處理脫毒過程向10%的糠醛渣水溶液中加入固體NaOH調(diào)pH5，攪拌O. 5h后，進(jìn)行過濾，得糠醛渣濾渣，濾渣含水量80 85%。2、I)制備纖維素酶水解促進(jìn)劑按照6% (w/v)的比例將純酵母加入水中，調(diào)節(jié)pH值為7. O,攪拌IOmin使酵母分散均勻，之后對(duì)酵母溶液進(jìn)行加熱處理，處理溫度121°C ;處理時(shí)間10min，處理液備用。2)制備纖維素酶將在2%糠醛渣固體培養(yǎng)基(4g糠醛渣+200ml Mandels營養(yǎng)鹽+4g瓊脂)上培養(yǎng)好的擬康氏木霉菌種的孢子用無菌生理鹽水稀釋至孢子懸浮液的濃度為IX IO8個(gè)/mL，將5mL孢子懸浮液接種到含50mL糠醛渣的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(馬鈴薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然)的250mL的燒瓶中，并在32°C下，轉(zhuǎn)速150r/min，pH4. 8條件下放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)15天得到。3、糖化處理后的糠醛渣濾渣經(jīng)過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為3%糠醛渣濾渣(w/v)，纖維素酶用量12FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度為10g/l，加水至酶水解體系1L，糖化溫度為45°C，糖化時(shí)間48h。實(shí)施例2步驟同實(shí)施例1，不同之處在于纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度為20g/l。實(shí)施例3步驟同實(shí)施例1，不同之處在于纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度為30g/l。實(shí)施例4步驟同實(shí)施例1，不同之處在酵母溶液進(jìn)行加熱處理的處理時(shí)間60min。實(shí)施例5 (對(duì)照例) 步驟同實(shí)施例1，不同之處在糖化步驟中未加纖維素酶水解促進(jìn)劑。實(shí)施例6I、糠醛渣預(yù)處理脫毒過程向10%的糠醛渣水溶液中加入固體NaOH至pH6，攪拌O. 5h后，進(jìn)行過濾，得糠醛渣濾渣。濾液用于乳酸菌的適應(yīng)性培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)每公斤活菌加入15L糠醛渣中和濾液。2、I)纖維素酶水解促進(jìn)劑按照6% (w/v)的比例將酵母廢棄物加入水中，調(diào)節(jié)pH值為7.0，攪拌IOmin使酵母分散均勻，之后對(duì)酵母溶液進(jìn)行加熱處理，處理溫度121°C;處理時(shí)間30min，離心，取輕相部分得到處理液備用。2)制備纖維素酶同實(shí)施例I。3)乳酸菌適應(yīng)性培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為32°C，培養(yǎng)時(shí)間為36h，pH值6. 0，培養(yǎng)基組成KH2PO4 O. 5g/l，MgSO4 · 7H20 O. 5g/l，NaCl O. lg/1,固體 CaCO3 2%(w/v)，糠醛渣中和濾液。3、分步糖化發(fā)酵處理后的糠醛渣濾渣經(jīng)過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為5%糠醛渣(w/v)，不加發(fā)酵培養(yǎng)基，加固體CaC035%(w/v)，纖維素酶用量15FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度為10g/l，加水至酶水解體系1L，糖化溫度為45°C，糖化時(shí)間48h。加入適應(yīng)性培養(yǎng)過的乳酸菌，乳酸菌接種濃度I. 25g/l，溫度為42°C，發(fā)酵72h，pH值5. 5，進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)施例7I、糠醛渣預(yù)處理脫毒過程向10%的糠醛渣水溶液中加入固體NaOH至pH6，攪拌O. 5h后，進(jìn)行過濾，得糠醛渣濾渣。濾液用于乳酸菌的適應(yīng)性培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)每公斤活菌加入15L糠醛渣中和濾液。2、I)纖維素酶水解促進(jìn)劑按照6% (w/v)的比例將酵母廢棄物加入水中，調(diào)節(jié)pH值為2.0，攪拌IOmin使酵母分散均勻，之后對(duì)酵母溶液進(jìn)行加熱處理，處理溫度121°C;處理時(shí)間30min，離心，取輕相部分得到處理液備用。2)制備纖維素酶同實(shí)施例I。3)乳酸菌適應(yīng)性培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為32°C，培養(yǎng)時(shí)間為36h，pH值6. 0，培養(yǎng)基組成KH2PO4 O. 5g/l，MgSO4 · 7H20 O. 5g/l，NaCl O. lg/1,固體 CaCO3 2%(w/v)，糠醛渣中和濾液。3、分步糖化發(fā)酵處理后的糠醛渣濾渣經(jīng)過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為9%糠醛渣(w/v)，不加發(fā)酵培養(yǎng)基，加固體CaC035%(w/v)，纖維素酶用量15FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度為10g/l，加水至酶水解體系1L，糖化溫度為47°C，糖化時(shí)間96h。加入適應(yīng)性培養(yǎng)過的乳酸菌，乳酸菌接種濃度I. 25g/l，溫度為42°C，發(fā)酵72h，pH值5. 5，進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)施例8 (對(duì)照例)步驟同實(shí)施例6，不同之處在于未加纖維素酶水解促進(jìn)劑。實(shí)施例9 (對(duì)照例)步驟同實(shí)施例6，不同之處在于未加纖維素酶水解促進(jìn)劑，步驟3中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，成分=KH2PO4 O. 5g/l ；MgS04 · 7H20 O. 5g/l ；NaC10. lg/1 ;牛肉膏 5g/l。實(shí)施例10I、糠醛渣預(yù)處理脫毒過程同實(shí)施例6。2、1)纖維素酶水解促進(jìn)劑按照6% (w/v)的比例將純酵母加入水中，調(diào)節(jié)pH值 為7. 0，攪拌IOmin使酵母分散均勻，之后對(duì)酵母溶液進(jìn)行加熱處理，處理溫度121°C;處理時(shí)間30min,處理液備用。2)制備纖維素酶同實(shí)施例6。3)乳酸菌適應(yīng)性培養(yǎng)同實(shí)施例6。3、葡萄糖發(fā)酵67g/l葡萄糖(w/v),加入適應(yīng)性培養(yǎng)過的乳酸菌,加固體CaCO370g/l，加入纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度為10g/l，乳酸菌接種濃度I. 25g/l，溫度為42°C，發(fā)酵96h，pH值5. 5，進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)施例11步驟同實(shí)施例9,不同之處在于酵母加熱處理時(shí)間30min。實(shí)施例12步驟同實(shí)施例9,不同之處在于酵母加熱處理時(shí)間60min。實(shí)施例13步驟同實(shí)施例9，不同之處在于酵母加熱處理溫度100°C。實(shí)施例14 (對(duì)照例)步驟同實(shí)施例9，不同之處在于未加纖維素酶水解促進(jìn)劑。實(shí)施例15 (對(duì)照例)步驟同實(shí)施例9，不同之處在于，未加纖維素酶水解促進(jìn)劑，在步驟3中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，成分=KH2PO4 O. 5g/l ；MgS04 · 7H20 O. 5g/l ；NaCl 0. lg/1 ;牛肉膏 5g/l。實(shí)施例16纖維素酶活性分析1、3%糠醛渣的酶水解生產(chǎn)葡糖糖，如表I。表I 3%糠醛渣酶水解的葡萄糖產(chǎn)量
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶水解促進(jìn)劑，其特征在于，將酵母或酵母廢棄物加入到水中，混勻，調(diào)PH值，加熱處理得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶水解促進(jìn)劑，其特征在于，所述調(diào)PH值為2.0-7. 5 ；所述加熱處理的處理溫度為100-121°C，處理時(shí)間為5-60min。
3.一種提高纖維素酶水解效率的方法，其特征在于，在纖維素原料中加入權(quán)利要求I或2所述的纖維素酶水解促進(jìn)劑、纖維素酶進(jìn)行酶水解。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)纖維素原料處理對(duì)糠醛渣水溶液進(jìn)行堿中和、過濾，得到糠醛渣濾渣； 2)糖化加入所述纖維素酶水解促進(jìn)劑、纖維素酶進(jìn)行酶水解，得酶水解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述糖化的條件糠醛渣濾渣濃度3 9% (w/v),纖維素酶用量12-15FPU/g糠醛渣濾渣，纖維素酶水解促進(jìn)劑濃度IOg/l-30g/l，糖化溫度為45-47°C，糖化時(shí)間48-96h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述纖維素酶由擬康氏木霉經(jīng)適應(yīng)性培養(yǎng)得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，擬康氏木霉經(jīng)適應(yīng)性培養(yǎng)的條件 1)在2%糠醛渣固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)擬康氏木霉菌種的孢子； 2)將孢子用生理鹽水稀釋； 3)將孢子懸浮液接種到含糠醛渣的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 所述2%糠醛渣固體培養(yǎng)基為4g糠醛渣、200ml Mandels營養(yǎng)鹽和4g瓊脂；所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為馬鈴薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，酶水解液進(jìn)一步加入酵母生產(chǎn)乙醇或乳酸菌生產(chǎn)乳酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述酵母或乳酸菌經(jīng)步驟I)中所述過濾得到的糠醛渣中和濾液適應(yīng)性培養(yǎng)，配比為15L濾液1kg活菌。
10.權(quán)利要求I所述纖維素酶水解促進(jìn)劑在提高纖維素酶水解效率中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種纖維素酶水解促進(jìn)劑及其應(yīng)用。所述纖維素酶水解促進(jìn)劑是將酵母或酵母廢棄物加入到水中，混勻，調(diào)pH值，加熱處理得到。本發(fā)明的纖維素酶水解促進(jìn)劑制備工藝簡單，易于實(shí)現(xiàn)，和現(xiàn)有工業(yè)具有良好兼容性，能明顯提高酶水解效率，具有良好的生物兼容性，能同時(shí)作為發(fā)酵微生物優(yōu)良的營養(yǎng)源，其能取代合成培養(yǎng)基，大大降低發(fā)酵培養(yǎng)基的成本，所用原料酵母價(jià)格低廉，來源廣泛，能為生物轉(zhuǎn)化過程提供碳源。本發(fā)明方法可降低酶水解木質(zhì)纖維原料過程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同時(shí)較大程度降低下游轉(zhuǎn)化過程化學(xué)品的消耗。
文檔編號(hào)C12R1/885GK102796718SQ20121028305
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者蔣建新, 唐勇, 趙鵬翔, 朱莉偉 申請人:北京林業(yè)大學(xué)