專利名稱：重組豬α干擾素及其在制備治療豬巨嗜細(xì)胞病毒病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組豬a干擾素的一種新用途，具體的說是重組豬a干擾素及其在制備治療豬巨嗜細(xì)胞病毒病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗增殖及免疫調(diào)節(jié)作用的分泌型糖蛋白，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。依據(jù)干擾素對酸的敏感性通常分為I型干擾素(酸敏感型)和II型干擾素(耐酸型)兩類，幾乎所有脊椎動物均可產(chǎn)生這兩類干擾素。I型干擾素主要起抗病毒和抗腫瘤作用，至今已發(fā)現(xiàn)INF-a、@、《、K、t、S以及干擾素樣細(xì)胞因子1加^111、1128、1129等；11型又稱免疫干擾素，迄今為止僅發(fā)現(xiàn)1即-￥ — 種。由于干擾素具廣譜、高效抗病毒功能，及其對免疫系統(tǒng)起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，因此成為當(dāng)今免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為活躍的領(lǐng)域之一。目前有5種豬干擾素I型干擾素a、P、Co、S和II型干擾素Y被發(fā)現(xiàn)。豬INF-a、co分別是由12個和5個以上的相關(guān)功能基因編碼的蛋白質(zhì)家族，這兩種干擾素的各亞型之間同源性很高，天然INF-a常常是INF-a、Co功能基因表達產(chǎn)物的混合體，而INF-P、6和INF-Y僅由單一基因編碼?，F(xiàn)在已完成基因克隆、測序和定位的豬干擾素基因主要包括INF-a、@、o和INF- y。豬a干擾素(PolFN a)在獸醫(yī)臨床上可作為廣譜抗病毒藥用于豬病毒性疾病的防治。如對豬的流行性腹瀉、輪狀病毒腹瀉、傳染性胃腸炎等多種病毒性疾病有較好的防治作用，但目前國內(nèi)用豬a干擾素治療豬巨嗜細(xì)胞病毒感染的研究幾乎空白，尚無相關(guān)報道。本發(fā)明中的豬巨嗜細(xì)胞病毒病(porcine cytomegalovirus, PCMV)亦稱細(xì)胞包涵體病毒。PCMV屬于皰疹病毒科，P皰疹病毒亞科，巨嗜細(xì)胞病毒屬的成員。PCMV分布相當(dāng)廣泛，該病至報道以來，在英國、日本、德國、美國和澳大利亞先后報道了該病的存在，其血清抗體陽性率達90%以上，全世界98%以上的豬受到過本病毒的感染，感染豬群98%以上的血清抗體均呈陽性。對3-5周齡仔豬的肺巨噬細(xì)胞高度敏感，感染后3-14天可看到巨嗜細(xì)胞形成和核包涵體，最高峰出現(xiàn)在接種后11-14天。感染豬后，感染細(xì)胞體積是正常細(xì)胞的6倍?；钾i特征性臨診癥狀為食欲廢絕，母豬繁殖障礙，表現(xiàn)為流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎、產(chǎn)弱仔等；仔豬有明顯的眼炎、鼻炎和肺炎癥狀，生長發(fā)育不良，增重差，給豬場造成了嚴(yán)重的損失。迄今尚未研制出有效的PCMV疫苗，在化學(xué)類治療藥物中，也尚未研制出特效藥物來預(yù)防和治療本病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種重組豬a干擾素及其在制備治療豬巨嗜細(xì)胞病毒病的藥物中的應(yīng)用。提供一種重組后的畢赤酵母表達載體pGAPZ a -IFN a的閱讀框序列。
本發(fā)明所述的豬a干擾素具有序列表中序列I所示核苷酸序列。一種重組豬a干擾素，通過以下方法制備Al :人工修飾后的豬a干擾素基因的合成將天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點序列及保護堿基。將基因中第24位氨基酸的三聯(lián)體密碼子的第3個堿基進行點突變，即將TGC突變?yōu)門GT ;第29位氨基酸的第2個堿基進行點突變，即將ACC突變?yōu)锳TC ;第48位氨基酸的第3個堿基進行點突變，即將TCC突變?yōu)門CT ;第101位氨基酸的第I個堿基進行點突變，即將GAT突變?yōu)锳AT ;第132位氨基酸的第3個堿基進行點突變，將ACG突變?yōu)锳CC ;第158位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由AAC突變?yōu)锳GC ;第161位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由CTC突變?yōu)镃CC ;第167位氨基酸的第I個堿基進行點突變，由ATC變?yōu)镚TC ;第174位氨基酸的第I和第2個堿基進行點突變，由GTC突變?yōu)門CC ;第179位氨基酸的第2個堿基進行點突變，由ACA突變?yōu)锳GA，突變后的基因序列編碼的氨基酸未改變豬天然IFNa的氨基酸序列，又為甲醇酵 母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率；A2 :構(gòu)建重組真核表達載體pGAPZ a-IFNa :將克隆得到的IFNa基因，連接到PGM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，得到PGM-T-IFN a ^fPGM-T-IFNa和pGAPZ a載體分別酶切后進行連接得pGAPZ a -IFNa，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性菌株，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到了與理論大小一致的載體片段和干擾素目的片段；A3 :真核細(xì)胞酵母表達系統(tǒng)高效表達IFN a :將上述重組表達載體pGAPZ a -IFN a經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化受體菌GSl 15，經(jīng)篩選得到陽性克隆，28度培養(yǎng)，使IFN a進行表達，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，分子量19. 4KD,與理論值相符，將發(fā)酵上清液用層析柱進行純化收集。將工程菌大量培養(yǎng)并表達的豬a干擾素，取上清液用層析柱純化后，收集目標(biāo)蛋白洗脫液，經(jīng)0. 22 ii m微孔濾膜過濾后，采用細(xì)胞病變抑制法測定活性，按50%病變計算效價單位。測定用的細(xì)胞為牛腎細(xì)胞MDBK，攻擊病毒采用水泡性口炎病毒VSV。本發(fā)明將純化獲得的豬a干擾素應(yīng)用于防治豬巨嗜細(xì)胞病毒病，實驗證明對豬巨嗜細(xì)胞病毒感染細(xì)胞具有明顯的保護作用。其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。


圖I畢赤酵母表達載體pGAPZ a -IFNa的雙酶切(Xhol/Xbal)鑒定；1. DNA MarkerD20002, 3. pGAPZ a -IFN a 雙酶切產(chǎn)物 4. DNA Marker D15000 ；圖2豬干擾素基因畢赤酵母表達載體pGAPZ a-IFNa的線性化；I. DNA MarkerD150002,3pGAPZa -IFNa 線性化產(chǎn)物；圖3 高抗篩選菌株的 PCR 鑒定；I. DNA Marker D2000 2-4,6-8 pGAPZ a -IFN a 轉(zhuǎn)化酵母陽性克隆子；5，9 :pGAPZa -IFNa轉(zhuǎn)化酵母陰性克隆子圖4表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；I.蛋白質(zhì)Marker 2-5 :陰性菌株6_7 :酵母陽性菌株表達產(chǎn)物圖5重組豬a干擾素對VSV病毒誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變的抑制作用；5_1為試驗組(加干擾素)后細(xì)胞；5_2為對照組(未加干擾素)的細(xì)胞.
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。實施例一豬a干擾素的制備方法I、人工修飾后的豬a干擾素基因的合成將豬天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1_69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點及保護堿基。
具體操作如下將天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1_69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點序列及保護堿基。將基因中第24位氨基酸的三聯(lián)體密碼子的第3個堿基進行點突變，即將TGC突變?yōu)門GT ;第29位氨基酸的第2個堿基進行點突變，即將ACC突變?yōu)锳TC ;第48位氨基酸的第3個堿基進行點突變，即將TCC突變?yōu)門CT ;第101位氨基酸的第I個堿基進行點突變，即將GAT突變?yōu)锳AT ;第132位氨基酸的第3個堿基進行點突變，將ACG突變?yōu)锳CC ;第158位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由AAC突變?yōu)锳GC ；第161位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由CTC突變?yōu)镃CC ;第167位氨基酸的第I個堿基進行點突變，由ATC變?yōu)镚TC ;第174位氨基酸的第I和第2個堿基進行點突變，由GTC突變?yōu)門CC ;第179位氨基酸的第2個堿基進行點突變，由ACA突變?yōu)锳GA，突變后的基因序列編碼的氨基酸未改變豬天然IFNa的氨基酸序列，又為甲醇酵母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率。序列SEQ ID NO. I為人工設(shè)計合成的不改變豬天然IFNa氨基酸序列的核苷酸序列，大小為523bp。2、重組真核表達載體pGAPZ a-IFN a的構(gòu)建以上述人工修飾后合成的豬IFNa基因為模板，設(shè)計一對特異性引物進行PCR擴增上游引物IFNl TA CTCGAG AAA AGA TGT GAC CTG CCT CAG，引入 XhoI 酶切位點；下游引物IFN2:GC TCTAGA TCA CTC CTT CTT CCT GAG TCT GTC，引入 XbaI 酶切位點；按以下程序進行擴增94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸lmin，共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸5min，PCR結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳和膠回收試劑盒回收IFN a基因片段，用T4DNA連接酶與PGM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，得到陽性重組質(zhì)粒PGM-T-IFN a。將PGM_T_IFN a和pGAPZ a載體用XhoI和XbaI雙酶切，用膠回收試劑盒分別回收IFNa基因片段和pGAPZa載體，然后用T4DNA連接酶將IFN a基因片段與pGAPZ a連接得DGAPZa-IFN a ,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性菌株，提取質(zhì)粒做XhoI/XbaI雙酶切鑒定，雙酶切后得到了與預(yù)期大小一致的載體片段和干擾素目的片段，見圖I。雙酶切鑒定結(jié)果正確的送往上海英俊生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果表明成功構(gòu)建7 pGAPZ a -IFN a表達載體，其閱讀框序列見SEQ ID NO. 2。3、IFNa基因的表達3. I重組表達載體pGAPZ a -IFNa轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15用限制性內(nèi)切酶將pGAPZ a -IFNa線性化，回收線性化完全的酶切產(chǎn)物(圖2)，將線性化的pGAPZ a -IFN a轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母細(xì)胞，于28°C溫箱中培養(yǎng)3_5天。待平板上的單菌落長出后，將其分別依次點種在含抗生素ZeocinTM 500,1000,1500,2000 u g/ml的YPDS平板上，28-30°C孵育2-3天，然后將ZeocinTM 2000 u g/ml的YPDS平板上的單菌落再分別依次點種在ZeocinTM 2500,3000 u g/ml的YPDS平板上，28_30°C孵育2_3天，得重組酵母菌株。3. 2畢赤酵母電轉(zhuǎn)化菌株的陽性鑒定提取重組畢赤酵母電轉(zhuǎn)化菌株GS115的基因組DNA和轉(zhuǎn)化的空載體基因組DNA，用pGAP Forward和3' AOXl引物進行PCR擴增，序列為Forward :5' —GTCCCTATTTCAATCAATTGAA—3'，3 ' AOXl 5 ' —GCAAATGGCATTCTGACATCC—3 '，如是空載體，只能擴增出載體上的片段，大小為466bp，而連接了 IFNa片段的陽性克隆，則能擴增出967bp大小片段(載體片段466bp+IFNa片段50lbp)，結(jié)果2-4，6-8均擴增出了 967bp左右的條帶，見圖3，得至Ij了 pGAPZ a-IFN a載體轉(zhuǎn)化后的酵母陽性菌株。 3. 3重組畢赤酵母電轉(zhuǎn)化菌株GSl 15的誘導(dǎo)表達挑取重組畢赤酵母電轉(zhuǎn)化菌株GS115的單克隆菌株，接種于YH)培養(yǎng)基中培育到0D600值達到6. 0，離心收菌；用表達培養(yǎng)基BMGY重懸沉淀，在28_30°C震蕩培養(yǎng)過夜后每日補加純甲醇至終濃度為1% (v/v)進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4天；離心收集上清液；用SDS-PAGE電泳法檢測上清液中的干擾素，結(jié)果樣品6，7在19. 4KD左右出現(xiàn)了蛋白條帶，見圖4，與理論值基本相符，選擇該菌株進行發(fā)酵、蛋白純化。3. 4重組畢赤酵母發(fā)酵菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)將保存菌株(Pichia pastoris GS115 (pPICz-ifn)劃線接種于YPD平板培養(yǎng)基上，28-30°C恒溫培養(yǎng)24-32h ;再從YPD平板培養(yǎng)基上挑出單菌落，接入250ml三角瓶裝的30mlBMGY培養(yǎng)基中，于200-300rpm/min，28_30°C振蕩培養(yǎng)24h，作為搖瓶種子；搖瓶種子再以10% (V/V)接入IOL發(fā)酵罐的BMGY培養(yǎng)基中，200_300rpm，28_30°C進行攪拌培養(yǎng)24h ；然后，每日補加甲醇于培養(yǎng)基中至終濃度為1% (v/v)，用10% (v/v) NH4OH和10% (v/v)H3P04調(diào)pH至5. 5，溶氧為50%，連續(xù)培養(yǎng)4d ;離心，收集含IFN a的上清液。4、表達產(chǎn)物豬a干擾素的分離純化將重組畢赤酵母菌發(fā)酵上清液通過層析柱，用乙酸鈉洗脫目的蛋白峰，再進行陽離子交換柱，洗脫后進一步凝膠層析，目的蛋白得到很好的分離。實施例二豬a干擾素生物學(xué)活性測定一、材料方法病毒來源水泡性口炎病毒VSV (保藏編號⑶V-Ol I，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。細(xì)胞牛腎細(xì)胞MDBK (NBL-1，上海生化試劑有限公司)。待檢樣品(豬a干擾素):通過基因工程方法制備。檢測方法細(xì)胞病變抑制法，按50%病變計算效價單位。測定用的細(xì)胞為牛腎細(xì)胞MDBK，攻擊病毒用VSV。生物學(xué)活性計算法
供試品生物學(xué)活(IU/ml) =PrX
DrxEr
Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，IU/ml ；Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；Es為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)；待檢樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的OD值
權(quán)利要求
1.一種重組豬a干擾素，其特征在于，通過以下方法制備 Al :人工修飾后的豬a干擾素基因的合成將天然IFNa核苷酸序列中的信號肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位點序列及保護堿基。將基因中第24位氨基酸的三聯(lián)體密碼子的第3個堿基進行點突變，即將TGC突變?yōu)門GT ;第29位氨基酸的第2個堿基進行點突變，即將ACC突變?yōu)锳TC ;第48位氨基酸的第3個堿基進行點突變，即將TCC突變?yōu)門CT ;第101位氨基酸的第I個堿基進行點突變，即將GAT突變?yōu)锳AT ;第132位氨基酸的第3個堿基進行點突變，將ACG突變?yōu)锳CC ;第158位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由AAC突變?yōu)锳GC ;第161位氨基酸的第2位堿基進行點突變，由CTC突變?yōu)镃CC ;第167位氨基酸的第I個堿基進行點突變，由ATC變?yōu)镚TC ;第174位氨基酸的第I和第2個堿基進行點突變，由GTC突變?yōu)門CC ;第179位氨基酸的第2個堿基進行點突變，由ACA突變?yōu)锳GA，突變后的基因序列編碼的氨基酸未改變豬天然IFN a的氨基酸序列，又為甲醇酵母所喜歡的密碼子，在甲醇酵母中具有高表達效率； A2 :構(gòu)建重組真核表達載體pGAPZa-IFNa :將克隆得到的IFNa基因，連接到PGM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，得到PGM-T-IFN a ^fPGM-T-IFNa和pGAPZ a載體分別酶切后進行連接得PGAPZa-IFN a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性菌株，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到了與理論大小一致的載體片段和干擾素目的片段； A3 :真核細(xì)胞酵母表達系統(tǒng)高效表達IFNa :將上述重組表達載體pGAPZ a-IFN a經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化受體菌GS115，經(jīng)篩選得到陽性克隆，28度培養(yǎng)，使IFNa進行表達，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，分子量19. 4KD,與理論值相符，將發(fā)酵上清液用層析柱進行純化收集。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組豬a干擾素在制備治療豬巨嗜細(xì)胞病毒病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用制備的藥物，其特征在于，其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組豬α干擾素，通過以下方法制備A1人工修飾后的豬a干擾素基因的合成；A2構(gòu)建重組真核表達載體pGAPZα-IFNα；A3真核細(xì)胞酵母表達系統(tǒng)高效表達IFNα。將工程菌大量培養(yǎng)并表達的豬a干擾素，取上清液用層析柱純化后，收集目標(biāo)蛋白洗脫液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，采用細(xì)胞病變抑制法測定活性，按50％病變計算效價單位。測定用的細(xì)胞為牛腎細(xì)胞MDBK，攻擊病毒采用水泡性口炎病毒VSV。本發(fā)明將純化獲得的豬a干擾素應(yīng)用于防治豬巨嗜細(xì)胞病毒病，實驗證明對豬巨嗜細(xì)胞病毒感染細(xì)胞具有明顯的保護作用。其用藥途徑通過注射給藥或粘膜給藥，劑型為注射劑或滴鼻劑。
文檔編號C12N15/81GK102796758SQ201210284368
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者李猶平, 劉宗秀, 王建軍, 房春林, 陳元坤 申請人:成都乾坤動物藥業(yè)有限公司