專(zhuān)利名稱(chēng)：一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結(jié)晶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結(jié)晶方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,簡(jiǎn)稱(chēng)S0D)作為一種廣泛存在于生物體細(xì)胞內(nèi)，具有防御氧化損傷作用的金屬酶，與機(jī)體衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病和輻射防護(hù)等有關(guān)，且在醫(yī)藥、保健品、食品添加劑和化妝品等領(lǐng)域均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。SOD廣泛存在于生物界，最初生產(chǎn)的SOD的原料也是動(dòng)物血，但是此來(lái)源提純的工藝繁瑣，操作困難，且得到的產(chǎn)品活性低，純度也低。利用基因工程技術(shù)，許多熱穩(wěn)定性較好
的SOD成功地在常溫宿主內(nèi)進(jìn)行了大量表達(dá)，從而大幅度降低了生產(chǎn)成本，擴(kuò)展了生產(chǎn)應(yīng)用。蛋白質(zhì)在體外較難保持其生物學(xué)活性的完整性，然而以晶體結(jié)構(gòu)存在的蛋白質(zhì)一般活性都是比較穩(wěn)定的。收集和分析X射線衍射蛋白質(zhì)晶體的數(shù)據(jù)，就能解析出該蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述的方法是該種耐高溫鐵超氧化物歧化酶的首次結(jié)晶，國(guó)內(nèi)外均無(wú)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結(jié)晶方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種上述耐高溫鐵超氧化物歧化酶的結(jié)晶方法，所述方法通過(guò)構(gòu)建重組載體pET-28a-FeS0D并導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組目的蛋白，再利用親和層析和離子交換層析的方法純化該重組目的蛋白，然后通過(guò)結(jié)晶試劑盒篩選重組目的蛋白的結(jié)晶條件，即可得到耐高溫鐵超氧化物歧化酶的蛋白晶體。上述方法包括以下步驟
(a)通過(guò)設(shè)計(jì)引物，以嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus)基因組DNA為模板，由PCR擴(kuò)增方法獲取耐高溫FeSOD基因，其堿基序列如SEQ ID NO : I所示；
(b)將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因連接到pET28a載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-FeS0D，并導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)獲得大量重組目的蛋白；
(c)將步驟(b)得到的重組目的蛋白上清通過(guò)O.45 μ m纖維素膜過(guò)濾，然后利用Ni柱親和層析法和離子交換層析法純化重組目的蛋白，得到純度達(dá)到95%以上的重組目的蛋白(具有極高的耐熱性，耐熱溫度可達(dá)90°C );
(d)將將步驟(c)純化后的重組目的蛋白進(jìn)行濃縮，用BCA法蛋白定量試劑盒來(lái)測(cè)定重組目的蛋白濃度，當(dāng)濃度達(dá)到5-8mg/ml時(shí),用蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒來(lái)篩選結(jié)晶條件,得到蛋白晶體；(e)將將步驟(d)形成的蛋白晶體，利用顯微鏡以及X射線晶體衍射儀進(jìn)行鑒定。優(yōu)選地，其中所述步驟(b)的具體操作為將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切后，連接到經(jīng)同樣處理的pET28a載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-FeS0D,將重組載體pET-28a_FeS0D導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得基因重組工程菌E. Co I i/pET-28a-FeS0D，將重組基因工程菌于37 °C、220rpm下培養(yǎng)至0D600為O. 6時(shí)，力口入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)培養(yǎng)3-5個(gè)小時(shí)，收集菌液，獲得大量重組目的蛋白。優(yōu)選地,其中所述步驟(d)的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒購(gòu)自Hampton Research公司，結(jié)晶條件為 Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index HR2-14488、Index HR2-14494、PEG/lon2 Screen HR2-0985、PEG/lon2 Screen HR2-0987、PEG/lon2 Screen HR2-09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、CrystalScreen2 HR2-11248。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明所提供的結(jié)晶方法流程簡(jiǎn)單，且獲得的晶體分 辨率高，為研究該種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和功能提供重要的條件。


圖I是耐高溫鐵超氧化物歧化酶的誘導(dǎo)表達(dá)圖；M :低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :只含pET28a載體的重組菌誘導(dǎo)；2 :未誘導(dǎo)重組菌；3 ;誘導(dǎo)后重組菌；
圖2是耐高鐵超氧化物歧化酶純化后的電泳分析圖；M :低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿囷超聲破碎后上清溶液；2 :純化后的目的蛋白；
圖3 A是耐高溫鐵超氧化物歧化酶的一級(jí)鑒定質(zhì)譜 圖3 B是耐高溫鐵超氧化物歧化酶的二級(jí)鑒定質(zhì)譜 圖4是可見(jiàn)光下耐高溫鐵超氧化物歧化酶的晶體 圖5是紫外光照射下耐高溫鐵超氧化物歧化酶的晶體 圖6是耐高溫鐵超氧化物歧化酶晶體的X射線衍射圖。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說(shuō)明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義，本說(shuō)明書(shū)中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法是按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法；本說(shuō)明書(shū)中所用的試驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品，各種試劑和培養(yǎng)基的成分和配制方法可參見(jiàn)常規(guī)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中的操作。下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的具體內(nèi)容。實(shí)施例I :耐高溫FeSOD基因的獲得
為了去除基因中的內(nèi)含子，根據(jù)NCBI上P. vivax Sail的序列(基因登錄號(hào)HM992934. I)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。上游引物5’ -TTACATATGCGTGGGGCAAGCACGGA-3 ’
下游引物5’ -GCGAATTCTTAAAACGGCTGCCAACG-3’
以嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus)基因組DNA(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈(zèng)送)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體程序和反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—種權(quán)利要求I所述耐高溫鐵超氧化物歧化酶的結(jié)晶方法，其特征在于，所述方法通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建重組載體pET-28a-FeS0D并導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組目的蛋白，再利用親和層析和離子交換層析的方法純化該重組目的蛋白，然后通過(guò)結(jié)晶試劑盒篩選重組目的蛋白的結(jié)晶條件，即可得到耐高溫鐵超氧化物歧化酶的蛋白晶體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (a)通過(guò)設(shè)計(jì)引物，以嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus)基因組DNA為模板，由PCR擴(kuò)增方法獲取耐高溫FeSOD基因，其堿基序列如SEQ ID NO : I所示； (b)將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因連接到pET28a載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-FeS0D，并導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)獲得大量重組目的蛋白； (c)將步驟(b)得到的重組目的蛋白上清通過(guò)O.45 μ m纖維素膜過(guò)濾，然后利用Ni柱親和層析法和離子交換層析法純化重組目的蛋白，得到純度達(dá)到95%以上的重組目的蛋白； (d)將將步驟(c)純化后的重組目的蛋白進(jìn)行濃縮，用BCA法蛋白定量試劑盒來(lái)測(cè)定重組目的蛋白濃度，當(dāng)濃度達(dá)到5-8mg/ml時(shí),用蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒來(lái)篩選結(jié)晶條件,得到蛋白晶體； (e)將將步驟(d)形成的蛋白晶體，利用顯微鏡以及X射線晶體衍射儀進(jìn)行鑒定。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)的具體操作為將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切后，連接到經(jīng)同樣處理的pET28a載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-FeS0D，將重組載體pET-28a_FeS0D導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得基因重組工程菌E. coli/pET-28a-FeS0D，將重組基因工程菌于37°C、220rpm下培養(yǎng)至0D600為O. 6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)培養(yǎng)3_5個(gè)小時(shí)，收集菌液，獲得大量重組目的蛋白。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒購(gòu)自Hampton Research 公司，結(jié)晶條件為 Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index HR2-14488、Index HR2_14494、PEG/lon2 Screen HR2_0985、PEG/lon2 Screen HR2_0987、PEG/lon2 Screen HR2_09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、Crystal Screen2 HR2-11248。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結(jié)晶方法。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)將耐高溫FeSOD基因構(gòu)建到載體pET28a上，通過(guò)將重組載體pET-28a-FeSOD導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用親和層析和離子交換層析的方法純化重組目的蛋白，得到純度達(dá)到95%以上的目的蛋白，再通過(guò)結(jié)晶試劑盒篩選目的蛋白的結(jié)晶條件，得到蛋白晶體。本發(fā)明所提供的結(jié)晶方法流程簡(jiǎn)單，且獲得的晶體分辨率高。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102816747SQ20121028497
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者張耀洲, 吳少峰, 張麗, 陳劍清, 舒特俊 申請(qǐng)人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司