3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及氨?；?tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：3所示氨基酸和它們的保守性變體構(gòu)成的組。本發(fā)明提供利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)定點(diǎn)特異插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，和利用所述翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。所述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)包含：(i)3-吡唑基酪氨酸；(ii)正交氨?；?tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優(yōu)先氨?；稣籺RNA；和(iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
【專利說(shuō)明】3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供氨?；?tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構(gòu)成的組。本發(fā)明還涉及一種3-吡唑基酪氨酸((S)-2-氨基-3-(4-羥基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸，簡(jiǎn)寫為pyTyr)的高效合成方法及包含其的翻譯系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶和它們的配對(duì)將3-吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，和利用所述翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本發(fā)明還涉及用這種翻譯系統(tǒng)和這種方法產(chǎn)生的含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質(zhì)，例如，含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體，以及含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]電子傳遞(Eletctron Transfer, ET)涉及體內(nèi)許多重要的生化過程,包括光合作用和細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化作用等。盡管目前人們?cè)诹私馍锎蠓肿尤绾怂峒暗鞍踪|(zhì)的電子傳遞機(jī)制方面取得了巨大進(jìn)步，但是對(duì)蛋白質(zhì)的電子傳遞實(shí)驗(yàn)仍依賴于在蛋白質(zhì)本身含有的殘基如組氨酸或半胱氨酸上連接探針來(lái)進(jìn)行，因此該方法僅能用于研究小的可溶性蛋白，這也就大大地限制了其應(yīng)用。光誘導(dǎo)電子傳遞(photo-1nduced electrontransfer,PET)導(dǎo)致的突光淬滅是一種用來(lái)探索生物大分子中的電子傳遞機(jī)理及酶分子構(gòu)象動(dòng)力學(xué)等的有利工具，但由于受到目前技術(shù)的限制，缺乏新技術(shù)手段仍是將光電子轉(zhuǎn)移應(yīng)用于生物功能研究中的一個(gè)瓶頸。研究者通常利用色氨酸和酪氨酸等天然氨基酸作為電子供體，熒光基團(tuán)作為電子受體，因此也只能限制于研究相對(duì)簡(jiǎn)單的生物學(xué)系統(tǒng)。
[0003]我們通過在蛋白中遺傳整合金屬螯合非天然氨基酸(UAAs)來(lái)克服上述限制因素。相比于在蛋白電子傳遞過程研究中作為電子供體的多種天然氨基酸以及多巴、3-氨基酪氨酸或者二氟代酪氨酸等非天然氨基酸，3-吡唑基酪氨酸-Cu (II)可以作為電子受體，這種獨(dú)特的性質(zhì)使得我們可以研究復(fù)雜生物學(xué)系統(tǒng)中的電子傳遞過程，而這是先前的電子傳遞研究方法所不能達(dá)到的。盡管已有報(bào)道含有可以結(jié)合金屬基團(tuán)(如聯(lián)吡啶，羥基喹啉等)的非天然氨基酸可以被基因編碼至目標(biāo)蛋白中，但是對(duì)于它們?cè)诘鞍字邪l(fā)揮電子傳遞功能的應(yīng)用至今卻沒有描述，而且，以上非天然氨基酸應(yīng)用的最大瓶頸問題來(lái)自于其合成的復(fù)雜性，目前能夠整合至蛋白中的以上非天然氨基酸的合成至少需要五個(gè)步驟才能得到產(chǎn)率較低的消旋混合物，而且整個(gè)合成過程涉及到重金屬催化，致癌溶劑，強(qiáng)酸強(qiáng)堿以及多重純化步驟。本發(fā)明中，我們開發(fā)了一種高效合成金屬螯合非天然氨基酸-3-吡唑基酪氨酸(PyTyr)的方法，該方法僅需兩步就可以獲得較高產(chǎn)率(50%)的pyTyr，并且不需要經(jīng)過后續(xù)復(fù)雜的過柱純化步驟即可被遺傳整合到蛋白質(zhì)中。
[0004]水母綠色突光蛋白(Aequoreavictoria green fluorescent protein, GFP)目前被廣泛應(yīng)用于研究生物分子定位和相互作用中，但是在水母中該蛋白的生物功能及機(jī)制至今仍在探索研究中。近期，有研究表明GFP可以作為光誘導(dǎo)電子供體，因此在生物體內(nèi)可能通過感光進(jìn)而發(fā)揮體內(nèi)電子傳遞的功能。然而，由于缺乏在目標(biāo)蛋白的特定位點(diǎn)中加入電子受體的有效方法，導(dǎo)致人們無(wú)法深入了解生物體內(nèi)GFP的電子傳遞機(jī)制。本發(fā)明擬通過在GFP中定點(diǎn)特異插入pyTyr,使其通過螯合銅離子Cu(II)形成pyTyr_Cu (II)復(fù)合物，而PyTyr-Cu(II)可以作為電子受體，與作為電子供體的GFP發(fā)色基團(tuán)產(chǎn)生光誘導(dǎo)電子傳遞，該研究將為GFP的電子傳遞機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。本研究現(xiàn)已開發(fā)了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內(nèi)位點(diǎn)特異性地定點(diǎn)插入蛋白質(zhì)的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質(zhì)翻譯組分，所述組分識(shí)別合適的選擇密碼子(selector codon)從而能在體內(nèi)多肽翻譯期間將所需的非天然氨基酸插入限定位置。這些方法利用識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相應(yīng)的特異性正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該Ο-tRNA。這些組分不與宿主生物體內(nèi)的任何內(nèi)源性tRNA、氨?；?tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密碼子交叉反應(yīng)(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對(duì)可能遺傳編碼大量結(jié)構(gòu)各異的非天然氨基酸。
[0005]本領(lǐng)域普遍知道利用適合于制備含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的正交翻譯系統(tǒng)，例如產(chǎn)生正交翻譯系統(tǒng)的通用方法。例如，參見國(guó)際公布號(hào)WO 2002/086075，其發(fā)明名稱為 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS” ；W0 2002/085923，其發(fā)明名稱為 “ IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”;W0 2004/094593，其發(fā)明名稱為“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定點(diǎn)特異插入非天然氨基酸的正交翻譯系統(tǒng)及它們的產(chǎn)生和使用方法的其他討論還可參見Wang和Schultz, Chem.Commun.(Camb) 1:1-11(2002)；Wang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed.44(I):34-66 (2005) ；Xie 和 Schultz,Methods 36(3):227-238(2005) ；Xie 和 Schultz, Curr.0pinion in Chemical Biology9 (6):548-554 (2005) ；ffang 等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35:225-249 (2006)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]1、技術(shù)問題
[0007]本發(fā)明提供一種氨酰基-tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ IDNO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構(gòu)成的組。這種氨?；?tRNA合成酶突變體能夠用3-吡唑基酪氨酸優(yōu)先氨?；c之配對(duì)的正交tRNA，從而在翻譯的氨基酸序列中插入3-吡唑基酪氨酸。這是本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的，相應(yīng)地，在本發(fā)明中將其命名為正交3-吡唑基酪氨酸氨?；?tRNA合成酶(pyTyrRS)。
[0008]本發(fā)明涉及利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3_吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，和利用所述翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本發(fā)明還涉及用這種翻譯系統(tǒng)和這種方法產(chǎn)生的含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。
[0009]因此，本發(fā)明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3-吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入蛋白質(zhì)的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，并且提供該翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸的方法。
[0010]本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的含有至少一個(gè)3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明人利用這種方法將3-吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，綠色熒光蛋白(GFP)。通過本發(fā)明的方法得到的包含3-吡唑基酪氨酸的突變綠色熒光蛋白通過螯合銅離子，可以作為電子受體，與作為電子供體的GFP發(fā)色基團(tuán)產(chǎn)生光誘導(dǎo)電子傳遞。同時(shí)，本發(fā)明還通過解析了 GFP-151pyTyr和GFP-151pyTyr_Cu(II)的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)為pyTyr螯合銅離子及GFP發(fā)色基團(tuán)和PyTyr-Cu(II)之間產(chǎn)生的光誘導(dǎo)電子傳遞提供了結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法也可以用于在綠色熒光蛋白之外的多種蛋白中定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸，并不局限于綠色熒光蛋白。[0011]最后，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種高效的3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法，該方法僅需兩步就可以獲得較高產(chǎn)率的pyTyr，并且不需要經(jīng)過后續(xù)復(fù)雜的過柱純化步驟。
[0012]2、技術(shù)方案
[0013]本發(fā)明人經(jīng)過篩選，首次獲得一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構(gòu)成的組。并且，本發(fā)明人利用所述正交氨?；?tRNA合成酶，研發(fā)了 3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)。
[0014]具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供在體內(nèi)(例如在宿主細(xì)胞內(nèi))對(duì)選擇密碼子(selectorcodon)如琥珀終止密碼子(TAG)起反應(yīng)而將非天然氨基酸3-吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入延伸中的多肽鏈的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)。所述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)包含不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制相互作用的正交-tRNA (Ο-tRNA)和正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)配對(duì)。SP，宿主細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶不會(huì)用氨基酸(天然的或非天然的)加載0-tRNA。類似地，本發(fā)明提供的O-RS不以顯著水平或者某些情況下不以可檢測(cè)水平地用氨基酸(天然的或非天然的)加載內(nèi)源性tRNA。利用所述翻譯系統(tǒng)能夠產(chǎn)生含有在翻譯過程中定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸的大量蛋白質(zhì)。
[0015]在一些方面中，本發(fā)明提供3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述翻譯系統(tǒng)包含:(a)非天然氨基酸，即3-吡唑基酪氨酸，(b)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和(c)正交tRNA(Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)，優(yōu)先氨?；?-tRNA。
[0016]優(yōu)選地，本發(fā)明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子，優(yōu)選地為琥珀密碼子。更優(yōu)選地，本發(fā)明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0017]所述系統(tǒng)中所用的正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)即為本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的氨酰基tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構(gòu)成的組。
[0018]在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明提供一種3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含:
[0019](i) 3-吡唑基酪氨酸；
[0020](ii)正交氨?；?tRNA合成酶；
[0021](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優(yōu)先氨?；稣籺RNA ;和[0022](iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
[0023]優(yōu)選地，所述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0024]該翻譯系統(tǒng)中的各種組分可以衍生自各種物種來(lái)源，例如，該翻譯系統(tǒng)中的各組分衍生自詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA (Ο-tRNA)為古菌來(lái)源的反密碼子突變?yōu)榕c琥珀密碼互補(bǔ)的酪氨酸t(yī)RNA。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，優(yōu)選地，Ο-tRNA的序列如SEQ ID N0:1所示。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于該系統(tǒng)的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列及該序列的保守變體。
[0025]在一些方面中，本發(fā)明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。在優(yōu)選方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
[0026]在一些方面中，本發(fā)明提供包含正交tRNA序列和編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。所用的宿主細(xì)胞不作具體限定，只要O-RS和Ο-tRNA在它們的宿主細(xì)胞環(huán)境中保留它們的正交性即可。例如，所述宿主細(xì)胞可以是真細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌。如實(shí)施例所述，可以將包含正交tRNA序列的重組載體和包含編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重組載體共轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，而獲得包含正交tRNA序列和編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。所述包含正交tRNA序列和編碼本發(fā)明的正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞構(gòu)成本發(fā)明的另一個(gè)方面。
[0027]本發(fā)明還提供產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法。所述方法利用上述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。所述方法通常始于提供含有以下組分的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)的步驟:(i)非天然氨基酸，即3-吡唑基酪氨酸；(?)正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS) ; (iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)優(yōu)先氨?；靓?tRNA;和(iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，然后將編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化到包含正交tRNA序列和編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中，3-吡唑基酪氨酸氨?；摩?tRNA對(duì)所述選擇密碼子起反應(yīng)而將培養(yǎng)基中的3-吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的所選位置，從而產(chǎn)生在所選位置含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。其中包含正交tRNA序列和編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主細(xì)胞可以通過將包含正交tRNA序列的重組載體和包含編碼正交3-吡唑基酪氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重組載體共轉(zhuǎn)化到所選的宿主細(xì)胞中而獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，適當(dāng)?shù)闹亟M載體的構(gòu)建和宿主細(xì)胞的篩選可以通過常規(guī)分子克隆技術(shù)和篩選技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
[0028]在所述方法的一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟包括通過定點(diǎn)誘變使野生型氨?；?tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合口袋發(fā)生突變，選擇用所述非天然氨基酸(即3-吡唑基酪氨酸)優(yōu)先氨?；靓?tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突變體(即，本發(fā)明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述選擇步驟包括定點(diǎn)誘變后從得到的氨?；?tRNA合成酶分子庫(kù)進(jìn)行所述O-RS的正選擇和負(fù)選擇(參見下述實(shí)施例2)。在一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟還包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA為古菌來(lái)源的反密碼子突變?yōu)榕c琥珀密碼互補(bǔ)的酪氨酸t(yī)RNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。在這些方法中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟還包括提供含有所述翻譯系統(tǒng)所用的琥珀選擇密碼子的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸。 [0029]還可在宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)施產(chǎn)生含有3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法。在這些情況中，提供的宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)(即，包含編碼O-RS的核苷酸序列、Ο-tRNA序列和含有至少一個(gè)選擇密碼子的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸)，而在適宜的培養(yǎng)條件下(例如，在培養(yǎng)基中添加3-吡唑基酪氨酸等)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞可導(dǎo)致在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸。在一些實(shí)施方式中，提供步驟包括提供真細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)。
[0030]本發(fā)明還提供生產(chǎn)含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體的方法，所述方法利用上述3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，其中所用的編碼綠色熒光蛋白突變體的核酸序列可以為，但不限于，SEQ ID NO:8，10，12，例如，在野生型綠色熒光蛋白的149位，151位和182位分別引入3-吡唑基酪氨酸，相應(yīng)地，利用本發(fā)明的突變方法所得到綠色熒光蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:7,9,llo這些方法通常始于提供含有以下組分的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)的步驟:(i)3-吡唑基酪氨酸；(ii)正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)；(iii)正交tRNA(Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3-吡唑基酪氨酸優(yōu)先氨?；靓?tRNA ;和(iv)編碼所述綠色熒光蛋白的核酸，例如，但不限于，SEQ ID NO:8，10，12，其中所述核酸含有所述Ο-tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，然后將編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化到所得到的宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中，3-吡唑基酪氨酸氨?；摩?tRNA對(duì)所述選擇密碼子起反應(yīng)而將培養(yǎng)基中的所述3-吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入所述綠色熒光蛋白的所選位置，之后通過螯合銅離子來(lái)研究GFP的光誘導(dǎo)電子傳遞。
[0031]本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體，所述綠色熒光蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:7，9，ll，在野生型綠色熒光蛋白的149位，151位和182位分別引入3-吡唑基酪氨酸，所述綠色熒光蛋白突變體通過螯合銅離子產(chǎn)生光誘導(dǎo)電子傳遞。
[0032]最后，本發(fā)明還提供一種高效的3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法，所述方法包括下列兩個(gè)步驟:第一步:在50ml圓底燒瓶中加入2.46g3-碘代酪氨酸,溶于20ml 10%NaOH水溶液中，另取1.92gt-Boc酸酐溶于20ml THF中后，將其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室溫下攪拌過夜，停止反應(yīng)后，加入適量的鹽酸，調(diào)節(jié)PH值至6.5-7.0之間，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相進(jìn)行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸；
[0033]第二步:取一干凈的50ml三口瓶，加入0.34g吡唑，1.92g無(wú)水Cs2C03，0.019gCuI (作為催化劑)，2.03g Boc-L-3-碘代酪氨酸和8ml無(wú)水DMF。在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，攪拌并于180°C回流18小時(shí)，冷卻后，旋干DMF，用無(wú)水乙醇溶解并抽濾沉淀，取濾液加濃鹽酸至沉淀完全，然后再進(jìn)行抽濾，旋干濾液，用乙酸乙酯和蒸餾水進(jìn)行萃取，收集水相，用制備型HPLC進(jìn)行分離純化。
[0034]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，上述制備方法中各反應(yīng)物的用量?jī)H是舉例說(shuō)明的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所需終產(chǎn)物量等因素，可以適當(dāng)成比例放大或減少各反應(yīng)物用量，這也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0035]3、有益效果
[0036]蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的目的之一是揭示一些通過研究天然蛋白所無(wú)法獲得的生物原理，而這些新的原理可能會(huì)有潛在的生物化學(xué)與生物物理的應(yīng)用前景。然而，近觀一些天然存在的金屬蛋白，我們發(fā)現(xiàn)自然界利用金屬或其配合物的種類十分有限。而且能與這些金屬或其配合物形成配位作用的氨基酸種類也十分有限，自然界存在的20種天然氨基酸中能形成配位作用的不到一半。對(duì)于天然配位性氨基酸的局限性，人們正試圖通過在蛋白的設(shè)計(jì)與構(gòu)建的過程中引入非天然氨基酸來(lái)加以克服。這些非天然氨基酸與天然氨基酸在結(jié)構(gòu)上有著類似性，但其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)更多樣化。
[0037]通過生物正交化學(xué)的方法選擇性的修飾蛋白，可以實(shí)現(xiàn)蛋白位點(diǎn)特異性插入非天然氨基酸。應(yīng)用琥珀密碼子在細(xì)胞中編碼3-吡唑基酪氨酸，實(shí)現(xiàn)在綠色熒光蛋白中特定位點(diǎn)插入該非天然氨基酸，使其螯合銅離子Cu(II)形成PyTyr-Cu(II)復(fù)合物，而PyTyr-Cu(II)可以作為電子受體，與作為電子供體的GFP發(fā)色基團(tuán)產(chǎn)生光誘導(dǎo)電子傳遞。同時(shí)，本發(fā)明還通過解析了 GFP-15IpyTyr和GFP-15IpyTyr-Cu (I I)的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)為pyTyr螯合銅離子及GFP發(fā)色基團(tuán)和PyTyr-Cu(II)之間產(chǎn)生的光誘導(dǎo)電子傳遞提供了結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)。同時(shí)，本發(fā)明涉及的高效合成3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的方法，大大簡(jiǎn)化了合成步驟，避免了合成過程中所涉及到的重金屬催化，致癌溶劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿，并且不需要經(jīng)過后續(xù)復(fù)雜的過柱純化步驟就能得到較高產(chǎn)率的目標(biāo)產(chǎn)物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0039]圖1是(S)-2-氨基-3-(4-羥基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸(簡(jiǎn)寫為pyTyr)的化學(xué)合成；
[0040]圖2是pyTyr的核磁圖譜，上圖是氫譜圖，下圖是碳譜圖；
[0041]圖3是正交tRNA，氨?；?tRNA合成酶，肌紅蛋白及綠色熒光蛋白系列突變體序列；
[0042]圖4是SDS-PAGE電泳圖及質(zhì)譜圖:A是pyTyr_Mb (4TAG)的SDS-PAGE電泳圖，B是pyTyr-GFP(151TAG)的 SDS-PAGE 電泳圖；C 是 pyTyr-Mb (4TAG)的質(zhì)譜圖；
[0043]圖5 是 wt GFP, GFP_149pyTyr 和 GFP_151pyTyr 的熒光光譜圖；
[0044]圖 6 是 wt GFP, GFP_149pyTyr, GFP_151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 中加入不同濃度Cu(II)離子后的熒光強(qiáng)度圖；
[0045]圖7是亞鐵氰化鉀導(dǎo)致的GFP-149pyTyr_Cu(II)熒光強(qiáng)度恢復(fù)；
[0046]圖8是熒光淬滅強(qiáng)度與溫度的關(guān)系圖；
[0047]圖9是pyTyr-Cu (II)的吸收光譜和GFP的熒光光譜圖；[0048]圖10是GFP-149pyTyr-Cu(II)光激發(fā)后加入BCS的吸收光譜圖；
[0049]圖11是GFP系列突變體螯合銅離子后的熒光壽命曲線圖；
[0050]圖12是GFP發(fā)光基團(tuán)和pyTyr殘基間距離值與光誘導(dǎo)電子傳遞速率kET值的線性關(guān)系圖；
[0051]圖13是高分辨率晶體結(jié)構(gòu)圖和電子密度圖:A是GFP-151pyTyr-Cu(II)的晶體結(jié)構(gòu)圖；B是GFP-151pyTyr的電子密度圖；C是GFP-151pyTyr_Cu(II)的電子密度圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052]以下通過實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說(shuō)明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0053]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，除非特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為可通過商業(yè)途徑購(gòu)得的分析純級(jí)別的試劑。
[0054]實(shí)施例1:pyTyr的化學(xué)合成(參見圖1和圖2)
[0055]在50ml圓底燒瓶中加入3_碘代酪氨酸(2.46g，8mmol，購(gòu)自上海吉爾生化公司)，溶于20ml 10% NaOH水溶液中，另取t-Boc酸酐(1.92g，8.8mmol，購(gòu)自北京中勝華騰有限公司)溶于20ml THF中后，將其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室溫下攪拌過夜。停止反應(yīng)后，加入適量的鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至6.5-7.0之間，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相進(jìn)行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸。
[0056]取一干凈的50ml三口瓶，加入吡唑(0.34g, 5mmol,購(gòu)自Sigma公司)，無(wú)水Cs2CO3 (1.92g, IOmmol,購(gòu)自天津 Alfa Aesar 公司)，CuI (0.019g, 0.1mmol,作為催化劑)，Boc-L-3-碘代酪氨酸(2.03g,5mmol)和8ml無(wú)水DMF(購(gòu)自北京百靈威公司)。在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，攪拌并于180°C回流18小時(shí)。冷卻后，旋干DMF，用無(wú)水乙醇溶解并抽濾沉淀，取濾液加濃鹽酸至沉淀完全，然后再進(jìn)行抽濾，旋干濾液，用乙酸乙酯和蒸餾水進(jìn)行萃取，收集水相，用制備型HPLC進(jìn)行分離純化(分離柱YMC AA12S052503WT，購(gòu)自慧德易公司，流速 12ml/min)。收率 50 % ? MS:m/z:248 [M+H]+ ；IH-NMR(600MHz, DMS0_d6(CD3S0CD3)):δ 10-11.6(s-b, 1H)，8.44(t，2H)，8.38(s, 1H)，7.8(s, 1H)，7.7(s, 1H)，7.14(dd, I Η)，
6.6(s, 1H) ,4.27 (dd, 1H, -CH)，3.19 (m，2H，-CH2).13C NMR(600MHz, DMS0_d6) d 35，54，107，118，124，126，127，129，132，139，147，172ppm.[0057]以上合成反應(yīng)所需化學(xué)試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自北京化工廠，純度均為分析純以上級(jí)別。
[0058]實(shí)施例2:進(jìn)化pyTyr特異性氨?；?tRNA合成酶
[0059]為了在基因中位點(diǎn)特異性插入pyTyr，需要在所用的E.coli宿主細(xì)胞中引入氨?；?tRNA合成酶/tRNA正交對(duì)，這個(gè)正交對(duì)來(lái)源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA (MjtRNACUATyr) /酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS，野生型，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2)對(duì)。MjTyrRS突變庫(kù)構(gòu)建在卡納霉素抗性pBK質(zhì)粒(購(gòu)自美國(guó)Scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)中，位于該質(zhì)粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的啟動(dòng)子和終止子之間。所使用的合成酶突變庫(kù)為pBk-lib-jwl庫(kù)，該突變庫(kù)的構(gòu)建方法為:在MjTyrRS 基因上挑選 6 個(gè)位點(diǎn)(Tyr32，Leu65，Phel08，Glnl09，Aspl58，和 Leul62)引入 NNK突變(N = A+T+C+G ;K = T+G)，另外 6個(gè)位點(diǎn)(Ile63,Ala67,His70,Tyrll4, Ilel59,Vall64)或隨機(jī)突變?yōu)?Gly 或保持不變(參見 Xie, J.；Liu, ff.S.；Schultz, P.G.Angew.Chem., Int.Ed.2007,46,9239-9242 ;Wang, JY.；Zhang ff.；Song WJ ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010,132,14812-14818)。
[0060]通過正負(fù)篩選來(lái)進(jìn)化特異性識(shí)別pyTyr的氨?；?tRNA合成酶(參見Liu，X.H.；Yu, Y.；Hu,C.；Zhang, ff.；Lu,Y.；ffang, J.Y,Significant Increase of Oxidase Activitythrough the Genetic Incorporation of a Tyrosine-Histidine Cross-Link in aMyoglobin Model of Heme-Copper Oxidase.Angewandte Chemie-1nternational Edition2012,51 (18),4312-4316.)。正篩選質(zhì)粒包含MjtRNACUATylr，TAG突變的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，啟動(dòng)表達(dá)綠色熒光蛋白的琥珀突變的T7 RNA聚合酶，四環(huán)素抗性基因。負(fù)篩選質(zhì)粒包含MjtRNAa/'在阿拉伯糖操縱子下的琥珀突變芽孢桿菌RNA酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。進(jìn)行3輪正負(fù)篩選:包含有正篩選質(zhì)粒的E.coli DHlOB細(xì)胞作為正篩選寄主細(xì)胞。細(xì)胞電轉(zhuǎn)pbk-lib-jwl庫(kù)，SOC培養(yǎng)基(2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母粉，0.05%(W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM葡萄糖)在37°C培養(yǎng)I小時(shí)。之后換用極限培養(yǎng)基(GMML 極限培養(yǎng)基的配方:M9 鹽 / 甘油:764gNa2HP04.7H20 或者 30g Na2HPO4,15g KH2PO4,
2.5g NaCl，5g NH4Cl, 50ml 甘油，高壓滅菌，pH 7.0 ；1M MgSO4:高壓滅菌；50mM CaCl2:高壓滅菌；25mM FeCl2:過濾滅菌；0.3M亮氨酸:溶解于0.3M NaOH中，過濾滅菌；1L液體GMML培養(yǎng)基:200ml M9鹽/甘油，2ml MgSO4, 2ml CaCl2, 2ml FeCl2, Iml亮氨酸)洗兩次，鋪板固體極限培養(yǎng)基(在液體GMML培養(yǎng)基中加入500ml 3%瓊脂粉，0.5mM pyTyr，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四環(huán)素)，37°C培養(yǎng)60小時(shí)。收取細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，電泳分離，膠回收。然后，將經(jīng)過正篩選 的pBK-lib-jwl轉(zhuǎn)化到包含負(fù)篩選質(zhì)粒的DH10B感受態(tài)細(xì)胞中。SOC培養(yǎng)基中恢復(fù)I小時(shí)。之后涂板包含0.2%阿拉伯糖(購(gòu)自sigma公司)的LB固體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含IOg胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl)。37°C培養(yǎng)8_12小時(shí)。共重復(fù)3輪。
[0061]最后一輪正篩選挑384個(gè)克隆，分別點(diǎn)板在含有0.5mM pyTyr、氯霉素60，80，100，120mg/L的GMML固體培養(yǎng)基上，及不包含pyTyr、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固體培養(yǎng)基。挑選在在0.5mM pyTyrl20mg/L氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在OmM pyTyr 40mg/L氯霉素培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。挑出3個(gè)克隆，其中克隆I的3-吡唑基酪氨酸插入效率最高，測(cè)序表明，克隆I所包含的氨?；?tRNA合成酶突變體(pyTyrRS)的氨基酸序列為SEQ ID N0:3所示，其中突變位點(diǎn)為Tyr32Asp，Leu65Thr，His70Gly和Aspl58Ala。
[0062]實(shí)施例3:表達(dá)pyTyr-肌紅蛋白，pyTyr-綠色突光蛋白及質(zhì)譜鑒定
[0063]將正交tRNA(SEQ ID NO:1)和篩選出來(lái)的pyTyrRS (SEQ ID NO:3)分別構(gòu)建到pEVOL載體(購(gòu)自美國(guó)scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)上,然后共轉(zhuǎn)化到包含有pbad-肌紅蛋白(4TAG)或pET-綠色熒光蛋白(151TAG)表達(dá)質(zhì)粒(該質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)(其中肌紅蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO:5,綠色熒光蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO:10)的DH10B細(xì)胞(購(gòu)自全式金公司)中。挑取單個(gè)克隆在37°C培養(yǎng)到OD6tltl約等于1.1時(shí)，向LB培養(yǎng)基中加入0.5mM pyTyr, ImM IPTG及0.2%阿拉伯糖(購(gòu)自Sigma公司)培養(yǎng)細(xì)胞,對(duì)照不加入pyTyr。6_8小時(shí)之后，收菌，N1-NTA純化蛋白，并用SDS-PAGE電泳分析(圖4A，圖4B)。[0064]我們發(fā)現(xiàn)，只有在存在pyTyr的培養(yǎng)基中才能純化出全長(zhǎng)的肌紅蛋白和綠色熒光蛋白，這說(shuō)明篩選出來(lái)的pyTyrRS可以特異性的識(shí)別pyTyr。在LB培養(yǎng)基中pyTyr-肌紅蛋白的產(chǎn)率為10mg/L，而野生型肌紅蛋白的產(chǎn)率為50mg/L ;pyTyr_綠色熒光蛋白的產(chǎn)率為20mg/L,而野生型綠色突光蛋白的產(chǎn)率為100mg/L。為了檢測(cè)pyTyr僅僅插入到肌紅蛋白的4位琥珀突變位點(diǎn)，我們對(duì)pyTyr-肌紅蛋白進(jìn)行了 ES1-TOF質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果分子量為18496Da(圖4C)，與計(jì)算的分子量18496Da吻合。
[0065]實(shí)施例4:表達(dá)pyTyr-綠色熒光蛋白突變體進(jìn)行光誘導(dǎo)電子傳遞研究
[0066]我們用基因工程方法構(gòu)建了綠色熒光蛋白系列突變體(核苷酸序列如SEQ ID NO:8，10，12所示)，其中149位，151位和182位分別突變?yōu)門AG終止密碼子，然后用實(shí)施例3中的相同方法在GFP的突變位定點(diǎn)特異插入pyTyr，表達(dá)產(chǎn)生突變蛋白GFP_149pyTyr，GFP-151pyTyr 和 GFP_182pyTyr (氨基酸序列如 SEQ ID NO:7，9，11 所示)。
[0067]由于本發(fā)明主要通過測(cè)量熒光淬滅和熒光壽命的方法來(lái)研究GFP的光誘導(dǎo)電子傳遞，因此首先需驗(yàn)證GFP突變后有沒有對(duì)蛋白自身的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響，所以我們測(cè)量了 ΙμΜ wt GFP(核苷酸序列為 SEQ ID NO:6)，GFP_149pyTyr 和 GFP_151pyTyr 在 60mMTris-HCl (pH 7.0)緩沖液中的發(fā)射光譜，結(jié)果顯示GFP系列突變體與其野生型的發(fā)射光譜相似，說(shuō)明GFP中引入非天然氨基酸后沒有影響蛋白的發(fā)光團(tuán)形成及其熒光量子產(chǎn)率(圖5)。然后，我們往 5μ M Wt GFP，GFP-149pyTyr, GFP_151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 中加入不同濃度的Cu(II)離子，測(cè)量其熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖6所示，加入5μΜ的Cu(II)離子可以導(dǎo)致 GFP-149pyTyr，GFP-151pyTyr 和 GFP_182pyTyr 的熒光強(qiáng)度分別淬滅 85 %，50 %和 25 %，而wt GFP僅僅淬滅了不到5%,證明GFP中插入pyTyr后可以有效地螯合銅離子,且蛋白熒光可以被Cu(II)不同程度的淬滅。接著，我們又往GFP-149pyTyr-Cu(II)中分別加入多種對(duì)Cu(II)離子具有不同親和力的銅離子螯合劑:甲硫氨酸、乙二胺、組氨酸、44'-聯(lián)吡啶和N-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸，通過測(cè)量GFP-149pyTyr-Cu(II)的熒光強(qiáng)度，再結(jié)合Scatchard分析法計(jì)算發(fā)現(xiàn)GFP-149pyTyr對(duì)Cu (II)具有高度親和力，其Kd值為0.9nM。然后，我們用還原滴定法往5 μ M GFP-149pyTyr-Cu (II)中加人50mM還原劑亞鐵氰化鉀，發(fā)現(xiàn)其可以完全恢復(fù)GFP-149pyTyr-CU(II)的熒光強(qiáng)度(圖7)，根據(jù)能斯特方程設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并計(jì)算得出GFP-149pyTyr-Cu(II)的還原電位為168mV，這與Cu2++丨一Cu+中產(chǎn)生的153mV電位值很接近。以上這些結(jié)果都充分地證明GFP-149pyTyr對(duì)Cu(II)的高度親和力。
[0068]由于GFP在不同位置含有結(jié)合金屬離子的非天然氨基酸pyTyr，其熒光強(qiáng)度可以被Cu(II)離子不同程度的淬滅，為了驗(yàn)證這種淬滅機(jī)制，我們還檢測(cè)了熒光淬滅強(qiáng)度和溫度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)淬滅強(qiáng)度隨著溫度的增加而降低(圖8)，說(shuō)明該淬滅現(xiàn)象并非動(dòng)態(tài)熒光淬滅；如圖9所示，pyTyr-Cu(II)的吸收光譜和GFP的熒光光譜沒有重疊，因此由FRET引起的淬滅機(jī)制也可能得到排除；為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上的熒光淬滅機(jī)制為PET機(jī)制，我們選用一種Cu(I)特異性螯合劑-bathocuproine disulfonate (浴酮靈二磺酸二鈉鹽,BCS)來(lái)驗(yàn)證GFP-149pyTyr-Cu(II)中的光誘導(dǎo)電子傳遞現(xiàn)象，因?yàn)楫?dāng)GFP_149pyTyr螯合Cu(II)并且經(jīng)過光激活后，如果能夠在GFP和Cu(II)之間形成電子傳遞，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生Cu(I),而BCS和Cu (I)特異性結(jié)合形成的復(fù)合物在483nm處具有較強(qiáng)吸收(摩爾消光系數(shù)為12，δΟΟΜ^1)。測(cè)量結(jié)果如圖10所示，當(dāng)2μΜ GFP-149pyTyr,5yM Cu(II)和10 μ M BCS的混合液經(jīng)過405nm激光激發(fā)后，其在483nm處的吸光值迅速升高，并且在10分鐘后達(dá)到最高值。計(jì)算發(fā)現(xiàn)，該過程中產(chǎn)生了 4.ΙμΜ Cu1(BCS)2產(chǎn)物。即I當(dāng)量的蛋白通過光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移可以產(chǎn)生兩個(gè)當(dāng)量的電子轉(zhuǎn)移，這些結(jié)果與之前報(bào)道的GFP能通過光誘導(dǎo)產(chǎn)生2個(gè)電子氧化的結(jié)果一致。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 GFP發(fā)色基團(tuán)和pyTyr-Cu(II)之間確實(shí)產(chǎn)生了光誘導(dǎo)電子傳遞現(xiàn)象。
[0069]通過測(cè)量熒光壽命進(jìn)一步研究GFP發(fā)色基團(tuán)和pyTyr-Cu(II)之間的光誘導(dǎo)電子傳遞速率。如圖11所示，加入Cu(II)后，PyTyr-GFP不同突變體的熒光壽命均不同程度的減短，其中GFP-149pyTyr的突光壽命從3.4ns降低至0.7ns,根據(jù)公式:kET = τ 加入Cu(II))-τ2_Η不加Cu(II))可以得到GFP-149pyTyr-Cu(II)的光誘導(dǎo)電子傳遞速率kET為 1.13X IOV1 ;同理計(jì)算出 GFP-151pyTyr-Cu(II)和 GFP_182pyTyr_Cu (II)的 kET 分別為
0.37X IO9 和 0.08X IOV1 (表 I)。相比于 GFP_149pyTyr_Cu (II)，GFP-15IpyTyr-Cu (II)和GFP-182pyTyr-Cu(II)電子傳遞速率有所降低，我們推測(cè)很有可能是因?yàn)镚FP發(fā)色團(tuán)與pyTyr殘基之間的距離增大而導(dǎo)致的，因此我們根據(jù)GFP-151pyTyr_Cu (II)高分辨率晶體結(jié)構(gòu)(如實(shí)施例5所述)計(jì)算出GFP發(fā)色基團(tuán)與pyTyrl51殘基之間的距離為為11.4A，而GFP發(fā)色基團(tuán)與pyTyr 149和pyTyr 182之間的距離則通過測(cè)量GFP-15IpyTyr-Cu (II)晶體結(jié)構(gòu)中其與Asnl49和Tyrl82之間的距離得到。結(jié)果如圖12所示，GFP發(fā)色基團(tuán)和PyTyr-Cu(II)之間的光誘導(dǎo)電子傳遞速率隨著它們之間距離的增加而減慢。由于GFP 二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β桶組成的，實(shí)驗(yàn)證明該種類型結(jié)構(gòu)相對(duì)于α螺旋更有利于GFP中的電子傳遞發(fā)生。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)GFP-151pyTyr-Cu (II)的距離衰減因子β值為0.7,該值小于在通常蛋白中的距離衰減因子，因此推測(cè)在該GFP蛋白中的電子傳遞有可能還存在跳躍模式，使電子傳遞更加有效的進(jìn)行。需要值得關(guān)注的是，GFP-151pyTyr-Cu(II)的電子傳遞速度約10-100倍低于光系統(tǒng)(II)的主要電子傳遞反應(yīng)，但高于目前為止的光系統(tǒng)(II)模擬系統(tǒng)。
[0070]表1.GFP系列突變體的熒光壽命值及電子傳遞速率kET值。
【權(quán)利要求】
1.一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它們的保守性變體構(gòu)成的組。
2.一種3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)權(quán)利要求1所述的正交氨?；?tRNA合成酶；和 (iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述正交tRNA。
3.如權(quán)利要求2所述的翻譯系統(tǒng)，其還包含(iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
4.如權(quán)利要求2所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子，并且其還包含編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
5.一種宿主細(xì)胞，其包含所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列，并且該所述宿主細(xì)胞是真細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。
6.一種產(chǎn)生在至少一 個(gè)所選位置定點(diǎn)特異插入3-吡唑基酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟: (a)提供權(quán)利要求3所述的3-吡唑基酪氨酸翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)權(quán)利要求1所述的正交氨?；?tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸優(yōu)先氨?；稣籺RNA ;和 (iv)編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子；和 (b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，然后將編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化到所得到的宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白質(zhì)的翻譯期間，3-吡唑基酪氨酸氨?；恼籺RNA對(duì)所述選擇密碼子起反應(yīng)而將培養(yǎng)基中的3-吡唑基酪氨酸定點(diǎn)特異插入所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的所述所選位置，從而產(chǎn)生在所選位置含3-吡唑基酪氨酸的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。
7.生產(chǎn)含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體的方法，其利用權(quán)利要求6所述的方法，其中所用的編碼綠色熒光蛋白突變體的核酸序列分別為SEQ ID NO:8，10，12，在野生型綠色熒光蛋白的149位，151位和182位分別引入3-吡唑基酪氨酸，所述綠色熒光蛋白突變體的氨基酸序列分別為SEQ ID NO:7,9,llo
8.由權(quán)利要求7所述的方法獲得的含有3-吡唑基酪氨酸的綠色熒光蛋白突變體，其氨基酸序列選自SEQ ID NO:7，9或11。
9.由權(quán)利要求8獲得的綠色熒光蛋白突變體及其螯合銅離子后形成的復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，其中所述綠色熒光蛋白突變體的核酸序列為SEQ ID NO:8，10，12，氨基酸序列分別為 SEQ ID NO:7,9,11ο
10.一種高效的3-批唑基酪氨酸(pyTyr)的合成方法,其包括下述兩個(gè)步驟: 第一步:在50ml圓底燒瓶中加入2.46g 3-碘代酪氨酸，溶于20ml 10% NaOH水溶液中，另取1.92g t-Boc酸酐溶于20ml THF中后，將其滴加于3-碘代酪氨酸NaOH溶液中，室溫下攪拌過夜，停止反應(yīng)后，加入適量的鹽酸，調(diào)節(jié)PH值至6.5-7.0之間，然后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相進(jìn)行旋蒸，可得到2.94g的Boc-L-3-碘代酪氨酸；
第二步:取一干凈的50ml三口瓶，加入0.34g吡唑，1.92g無(wú)Cs2CO3,0.019g

CuI，2.03g Boc-L-3-碘代酪氨酸和8ml無(wú)水DMF，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，攪拌并于180°C回流18小時(shí)，冷卻后，旋干DMF，用無(wú)水乙醇溶解并抽濾沉淀，取濾液加濃鹽酸至沉淀完全，然后再進(jìn)行抽濾，旋干濾液，用乙酸乙酯和蒸餾水進(jìn)行萃取，收集水相，用制備型HPLC進(jìn)行分離純化。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK103571804SQ201210285659
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月10日
【發(fā)明者】王江云, 劉曉紅, 李家松, 董建樹, 胡誠(chéng), 龔為民, 江歡歡 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所