專利名稱：一種糞腸球菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于菌種領(lǐng)域，具體的說，涉及一種提取降纖酶的菌種。
背景技術(shù)：
血栓是血管系統(tǒng)內(nèi)血液本身組成物形成的腫塊，由血栓造成管道閉塞所導(dǎo)致的許多病變都屬于血栓栓塞性疾病，如心肌梗塞、腦血栓、肺血栓、靜脈血栓塞等。隨著人類壽命的延長(zhǎng)和飲食結(jié)構(gòu)的改變，血栓栓塞性病例也明顯增多，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，全世界血塞性疾病患者不少于1500萬人，血栓栓塞性疾病已成為當(dāng)前危害人類健康，導(dǎo)致死亡率最高的疾病之一。
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目前，治療血栓栓塞性疾病最為可靠并且有效的手段之一是溶栓療法，即注射溶栓劑使血管再通?，F(xiàn)行臨床所用的溶栓劑主要是鏈激酶、尿激酶、葡激酶、人組織性纖維蛋白溶解酶原激活劑(tissue plasminogen activator, t_PA)、蝮蛇抗栓酶等,但鏈激酶、尿激酶、蝮蛇抗栓酶都有較大的副作用；t_PA雖與血栓基質(zhì)纖維蛋白有較強(qiáng)的特異親和力，能在血栓局部高效地激活纖溶系統(tǒng)，但它在血液中半衰期很短，而且血漿中的纖溶酶原激活劑的抑制劑可快速抑制其活性。葡激酶對(duì)纖維蛋白也有很強(qiáng)的特異性，但由于產(chǎn)率低且該菌本身的致病性，限制了它的應(yīng)用。目前國(guó)際上已采用基因工程的方法對(duì)t-PA進(jìn)行改造并生產(chǎn)出第三代溶栓藥物——t-PA的突變體和嵌合體，其療效有所改善，但是價(jià)格昂貴。因此，研制相對(duì)廉價(jià)、高效、快速、防止再栓塞及減低出血等不良反應(yīng)的新型溶栓藥物的需求迫切。自1987年日本學(xué)者Sumi等首先發(fā)現(xiàn)微生物纖溶酶(fibrinolytic enzyme)具有纖溶活性以來，微生物纖溶酶以其具有體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、成本低廉等其它溶栓劑所不具備的特點(diǎn)，受到各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注和深入研究。從作用機(jī)理上劃分，微生物來源的溶栓劑可以分成兩類一類是纖溶酶原激活劑，如鏈激酶、葡激酶，其作用原理是纖溶酶原激活劑能將纖溶酶原激活為纖溶酶，而具有絲氨酸蛋白酶活性的纖溶酶則能降解構(gòu)成血栓骨架的纖維蛋白，從而引起溶栓的作用；另一類是纖溶酶類物質(zhì)，其作用不通過激活纖溶酶原，而是直接降解血塊中的纖維蛋白，溶解血栓，這類物質(zhì)有來源于枯草芽孢桿菌的納豆激酶(nattokinase，NK)以及分別來源于芽孢桿菌、糞鏈球菌、鏈酶菌等的纖溶活性物質(zhì)。除早期發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)鏈激酶的β_溶血鏈球菌(Streptococcus hemolytius)和產(chǎn)葡激酶的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)外,近年來,又陸續(xù)篩選出可產(chǎn)生纖溶酶活性的芽孢桿菌、放線菌、黃青霉菌、尖鐮胞菌、鐮胞菌、旋孢霉菌、海洋假單胞菌、藤黃微球菌等。但這些菌株中有的產(chǎn)酶量較低、有的自身存在致病性、有的菌株產(chǎn)生的降纖酶在臨床應(yīng)用后存在較大的副作用，這些因素在一定程度上制約了微生物纖溶酶的開發(fā)和應(yīng)用，因而篩選出無致病性、易培養(yǎng)、產(chǎn)酶量高的菌株，并且摸索出成熟的工藝條件就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種提取物制備降纖酶的糞腸球菌。糞腸球菌先用富集培養(yǎng)基在自然環(huán)境中富集，然后在瓊脂糖-纖維蛋白培養(yǎng)基平板上初篩，挑選活性較高的菌落再經(jīng)過搖瓶復(fù)篩，取上清液用纖維蛋白平板測(cè)定纖溶活性。經(jīng)富集培養(yǎng)、分離篩選，獲得糞腸球菌，糞腸球菌已于2012年7月2日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝陽區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)=CGMCC Nol. 6313。培養(yǎng)基制備I LB培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，瓊脂1.5%。 2富集培養(yǎng)基豬血粉2%，蛋白胨1%，NaCl 5%，瓊脂2%，pH 7.2。3纖維蛋白培養(yǎng)基稱取纖維蛋白原16. Omg溶解于8mL雙蒸水中，配制成纖維蛋白原溶液，于37°C中水浴保溫；稱取O. 16g瓊脂粉加雙蒸水定容至8mL并煮化，待冷卻至50°C左右加入O. ImL 100IU/mL的凝血酶，搖勻后加入上面配置好的纖維蛋白原溶液，迅速搖勻后倒入直徑為9cm的平皿中，室溫平放30min，待平板凝固后置于4°C下冷藏備用。菌種的分離先用富集培養(yǎng)基在自然環(huán)境中富集，然后在瓊脂糖-纖維蛋白培養(yǎng)基平板上初篩，挑選活性較高的菌落再經(jīng)過搖瓶復(fù)篩，取上清液用纖維蛋白平板測(cè)定纖溶活性。形態(tài)學(xué)特征經(jīng)富集培養(yǎng)、分離篩選，獲得一株纖溶酶產(chǎn)生菌——糞腸球菌(菌株EF608)，在LB固體培養(yǎng)基上呈圓形透明菌落，白色，表面光滑，有光澤，邊緣整齊。菌體成對(duì)或短鏈狀排列，無運(yùn)動(dòng)型，不生成芽孢，革蘭氏染色陽性。菌株鑒定I形態(tài)觀察糞腸球菌(菌株EF608)在LB固體培養(yǎng)基上呈圓形菌落，白色，表面光滑，有光澤，邊緣整齊(圖I)。菌體成對(duì)或短鏈狀排列，無運(yùn)動(dòng)性，不生成芽孢，革蘭氏染色陽性(圖2)。2生理生化特征菌株EF608能在高溫、高pH、高鹽的極端條件下生長(zhǎng)，具有水解膽汁七葉苷的能力，詳細(xì)結(jié)果見表I。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可初步判斷該菌為糞腸球菌。表I菌株EF608的生理生化特征Table I Physiological and biochemical characters of strain EF608
權(quán)利要求
1. 一種類腸球菌(Enterococcus faecalis)菌株 EF608 CGMCC NO. 6313。
全文摘要
本發(fā)明為一種糞腸球菌(Enterococcus faecalis)菌株EF608 CGMCC NO.6313。本發(fā)明從自然界中富集培養(yǎng)、分離篩選得到糞腸球(Enterococcus faecalis)菌株EF608，從糞腸球菌菌株發(fā)酵液中分離純化能得出一種分子量為37.1KD的纖溶酶，易于純化和批量制備，并且纖溶活性強(qiáng)，無毒性，是較為理想的纖溶酶制劑原料。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102899267SQ20121028725
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月13日
發(fā)明者和七一, 余曉東, 文浩平 申請(qǐng)人:重慶師范大學(xué)