專利名稱：一種應(yīng)用多重pcr陣列技術(shù)的核酸檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸檢測(cè)方法，特別涉及應(yīng)用多重PCR陣列技術(shù)檢測(cè)核酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多重PCR技術(shù)(multiplex PCR, mPCR)是自上世紀(jì)80年代PCR技術(shù)誕生以來(lái)，該技術(shù)領(lǐng)域的又一大革新。傳統(tǒng)PCR技術(shù)僅使用一對(duì)引物，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，多用于單一目的序列的鑒定。而mPCR是在同一 PCR反應(yīng)體系里應(yīng)用兩對(duì)以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與經(jīng)典的PCR相同。mPCR最大的特點(diǎn)就是提高了檢測(cè)的效率，使PCR成為了一種高通量的手段(I)高效性，在同一 PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種待測(cè)靶物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一個(gè)樣本就可檢測(cè)多種靶標(biāo)；(2)系統(tǒng)性，mPCR很適宜于成組靶標(biāo)，如肝炎病毒、腸道致病性細(xì)菌、性病、食品微生物及細(xì)菌戰(zhàn)劑等類別中不同病原體的同時(shí)檢測(cè)；(3)經(jīng)濟(jì)性，多種靶標(biāo)在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)檢出，則在時(shí)間、試劑、費(fèi)用開(kāi)支等方面的耗費(fèi)都是很大的節(jié)省。mPCR技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。比如多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定等。針對(duì)待檢對(duì)象的多型別，或多位點(diǎn)基因突變等問(wèn)題，mPCR可提高其檢出率。在具體應(yīng)用中，為了提高檢測(cè)的特異性，引物的設(shè)計(jì)與選擇則顯得尤為重要。同時(shí)針對(duì)多個(gè)基因靶序列進(jìn)行PCR檢測(cè)，往往出現(xiàn)為了保證引物的特異性，而使得多對(duì)長(zhǎng)短不一，GC含量有明顯差異的引物間Tm值難以統(tǒng)一的現(xiàn)象，給整個(gè)mPCR體系的退火溫度程序設(shè)置帶來(lái)困難，從而減低了 mPCR檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明針對(duì)這一問(wèn)題，通過(guò)mPCR技術(shù)結(jié)合通用標(biāo)簽序列(universal tag, UT)的方法,即在每條原有檢測(cè)引物的5’端加上一個(gè)自行設(shè)計(jì)的、Tm值統(tǒng)一的UT引物，使得多對(duì)引物在擴(kuò)增中實(shí)現(xiàn)退火溫度的統(tǒng)一，提高反應(yīng)的效率。與此同時(shí)，該發(fā)明還可實(shí)現(xiàn)多物種混合樣本、多個(gè)mPCR體系的同時(shí)實(shí)施，即mPCR陣列?？偠灾?，對(duì)于普通mPCR而言，本發(fā)明的主要特點(diǎn)是使得mPCR中多重引物的不同退火溫度得以統(tǒng)一，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行，提高檢測(cè)靈敏度。此外，由于反應(yīng)體系中UT的Tm值相對(duì)普通檢測(cè)引物偏高，使得PCR的特異性也有所提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種核酸檢測(cè)方法，通過(guò)mPCR結(jié)合UT的方法，以提高核酸檢測(cè)的靈敏度和特異性。本發(fā)明的技術(shù)方案一種應(yīng)用mPCR陣列技術(shù)的核酸檢測(cè)方法本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通用標(biāo)簽(UT)序列，其由20-24個(gè)堿基組成，其特征在于①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超過(guò)±1°C，且大于檢測(cè)引物Tm值5-10°C左右■級(jí)UT序列為隨機(jī)設(shè)計(jì)的DNA片段，與待檢測(cè)生物的核酸序列間無(wú)同源性。優(yōu)選，所述UT序列由多組四個(gè)堿基組成的隨機(jī)四聚體，該四聚體應(yīng)滿足(I)四聚·體間至少要有兩個(gè)堿基是互不相同的；(2)四聚體之間不能彼此互補(bǔ)；(3)四聚體不應(yīng)自身配對(duì)；(4)四聚體不能由兩個(gè)重復(fù)堿基對(duì)組成。更優(yōu)選，所述UT序列，其由6組隨機(jī)四聚體組成。進(jìn)一步優(yōu)選，所述UT序列由以下6組隨機(jī)四聚體組成CAGC、GGTA、GACC、ACCT、ATCG、TGCG。進(jìn)一步優(yōu)選，UT序列具體是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC ;和 / 或
FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGAC ;和 / 或
FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACC ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGAC 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種引物對(duì)，含有上述UT序列以及檢測(cè)引物對(duì)，其中UT序列加在每條檢測(cè)引物的5’端。優(yōu)選，引物對(duì)是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCCTGAATCTTCTGGTAAAAC ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC ；和/或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCATTATCACGGTAATTAGTG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACAGAGCACTGTGCACTTAAG ;和 / 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGTAATGCTTTGATCGGCTT ；R:CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG。優(yōu)選，引物對(duì)是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCAACCGTACAGAATGAAGCGG ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTTATTCGTGCAATACTCGTGCG ;和 / 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGATTTCTGTAACAGCTACCAACGA ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC ；和/ 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGGCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCG。還優(yōu)選，引物對(duì)是FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGCGGTAGGTGGTTCAA ；RAGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACTTGTCGCGGATTTGCAACTA 和 / 或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACCTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT ；和/ 或F GGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCCGGCTCGTTTATCGGCTT ；RAGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACGGTATTTCGTTTCAGCCAAGCo
仍優(yōu)選，引物對(duì)是FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGAGTACCAAACTGCTAACACAGGTACTC ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACAGCTGGTTTGCAGCTTC ;和 / 或F TGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGCTGATTTAAGAGATAGAGGAACA ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACTTTATGTGGTTATTTGCTGTC ;和 / 或
FTGCGCAGCATCGACCT GGTAGACCT CCGCCTGCAAGTCCTAAG ；R:CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種試劑盒，其中含有上述UT序列或的引物對(duì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是的提供上述UT序列、引物對(duì)、試劑盒在非診斷目的的生物檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述UT序列、引物對(duì)、試劑盒用于檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii),尤其是它的 recA、16S-23S ITS、0XA-51 樣基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述UT序列、引物對(duì)、試劑盒用于檢測(cè)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes),尤其是肺炎鏈球菌的lytA、ply和psaA基因；腦膜炎奈瑟菌的ctrA、crgA和porA基因；單核細(xì)胞增生李斯特菌的iap、actA和hly基因。(一 )待測(cè)核酸序列的獲取從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)獲取待檢核酸的完整序列(單個(gè)基因或全基因組)，針對(duì)每個(gè)序列，確定3個(gè)特異性檢測(cè)區(qū)段，通過(guò)多點(diǎn)檢測(cè)以提高檢測(cè)的特異性。(二)PCR特異檢測(cè)弓丨物的設(shè)計(jì)針對(duì)每種待檢核酸序列，分別確定3處特異性基因區(qū)段作為靶序列，并針對(duì)每個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR鑒別引物。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的待檢核酸序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件結(jié)合在NCBI 網(wǎng)站的 BLAST 工具(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進(jìn)行篩選，針對(duì)每種待檢序列中的各個(gè)錨定靶序列設(shè)計(jì)PCR引物。每種待檢序列將分別在一個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)體系中同時(shí)進(jìn)行其3個(gè)靶序列的mPCR，擴(kuò)增產(chǎn)物將通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。因此，引物設(shè)計(jì)有以下原則①每種待檢序列的特異性引物Tm值在50-60°C之間；②每種待檢序列中3個(gè)靶區(qū)段的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度避免接近，便于檢測(cè)后的瓊脂糖凝膠電泳分析，若是陽(yáng)性結(jié)果，每種細(xì)菌則出現(xiàn)3條大小不同、區(qū)別清晰的電泳條帶每對(duì)引物的序列均需要通過(guò)NCBI的BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，避免引物之間出現(xiàn)交叉；④每對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在Ikb以內(nèi)為好，便于PCR的實(shí)施，以及盡可能縮短擴(kuò)增時(shí)間。(三)UT引物的設(shè)計(jì)所謂UT，實(shí)質(zhì)上是一段人為設(shè)計(jì)的連接在特異性檢測(cè)引物5’端統(tǒng)一長(zhǎng)度的核酸序列，長(zhǎng)度一般為20-24個(gè)堿基，其與特異性檢測(cè)引物形成復(fù)合式引物，即5’ -UT引物+特異檢測(cè)引物_3’。每個(gè)待測(cè)核酸的檢測(cè)中，針對(duì)3個(gè)檢測(cè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)引物，此3對(duì)引物的5’端公用I對(duì)UT(每對(duì)檢測(cè)引物的上下游所需UT序列不同)，從而組成一個(gè)統(tǒng)一的mPCR體系。UT的設(shè)計(jì)遵循以下原則①上下游UT序列不同、Tm值相似(相差不超過(guò)± 1°C )，且大于檢測(cè)引物Tm值5-10°C左右 ’②UT為隨機(jī)設(shè)計(jì)的DNA片段，與待檢測(cè)生物的序列間無(wú)同源性。所述UT序列可以通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件生成。習(xí)慣上，UT的堿基數(shù)為4的倍數(shù)，以方便UT序列的設(shè)計(jì)。可事先設(shè)計(jì)多組由四個(gè)堿基組成的隨機(jī)四聚體，從其中選擇6組進(jìn)行排列，則可形成一個(gè)UT。如果改變這些四聚體的排列順序，則可形成其他UT。四聚體在選擇時(shí)，應(yīng)注意(I)四聚體間至少要有兩個(gè) 堿基是互不相同的；(2)彼此互補(bǔ)的四聚體不能選，如GACC和GTCC ； (3)自身配對(duì)的四聚體不能選，如TGCA ； (4)四聚體不能由兩個(gè)重復(fù)的堿基對(duì)組成，如CACA。UT引物的序列初步設(shè)計(jì)好之后，需通過(guò)NCBI網(wǎng)站在線BLAST分析，確定該序列與待測(cè)核酸無(wú)同源性，方可使用。此外，按照此種方法設(shè)計(jì)出的UT引物，其Tm值大多在60以上。根據(jù)需檢測(cè)的物種或核酸序列數(shù)量設(shè)計(jì)相應(yīng)數(shù)量的UT序列對(duì)，即類似于PCR引物的正向UT和反向UT。引物分兩組進(jìn)行合成一組是單純的UT序列；另一組為“5’ -UT+待檢核酸序列的特異性引物_3’ ”的復(fù)合體引物，即在每條特異檢測(cè)引物的5’端加上一段UT序列。每對(duì)特異性引物需鏈接不同的UT片段。同個(gè)待檢核酸的的3對(duì)檢測(cè)引物可公用一對(duì)UT序列。此外，設(shè)計(jì)并合成mPCR體系質(zhì)量控制所需的陽(yáng)性片段、陰性片段及相應(yīng)引物。(四)mPCR的實(shí)施獲取每種待測(cè)核酸樣本，每種核酸的檢測(cè)為I個(gè)獨(dú)立的PCR單元，每個(gè)單元為一個(gè)包含I對(duì)UT、3對(duì)UT+特異檢測(cè)引物復(fù)合體的mPCR體系。若涉及多種物種或多種核酸序列同時(shí)檢測(cè)，則由8聯(lián)PCR管或96孔PCR板來(lái)完成，每個(gè)單管中包括一個(gè)mPCR體系，多管聯(lián)合則形成mPCR陣列。為了在擴(kuò)增前兩輪使得不同檢測(cè)區(qū)段的特異引物均可順利退火，可采用溫度梯度程序，在10°C范圍內(nèi)設(shè)置一系列退火溫度，保證特異性靶序列被成功捕獲，從而也增強(qiáng)了檢測(cè)的靈敏度。(五)mPCR結(jié)果分析采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mPCR擴(kuò)增結(jié)果。若某種待測(cè)核酸被成功檢出，則根據(jù)檢測(cè)該核酸所使用的3對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的大小(再加上下游引物共添加的48個(gè)堿基的UT序列)，通過(guò)凝膠成像分析，會(huì)在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)3條相應(yīng)長(zhǎng)度的清晰條帶。(六)mPCR檢測(cè)模式的擴(kuò)展該發(fā)明涉及技術(shù)可針對(duì)同一核酸模板的不同靶序列進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，也可以針對(duì)分布在不同核酸模板上的不同靶片段進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，特異檢測(cè)引物的數(shù)量也可根據(jù)實(shí)際需求增減。該發(fā)明的技術(shù)流程見(jiàn)附圖I。
四

圖I是基于UT的mPCR體系實(shí)施方案圖。
五具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例一 mPCR檢測(cè)在單一檢測(cè)對(duì)象中的應(yīng)用以鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii,Ab)培養(yǎng)物的檢測(cè)為例,說(shuō)明本發(fā)明涉及mPCR體系的應(yīng)用。由于所采用的樣本均為已知的Ab培養(yǎng)物，因此本實(shí)例旨在對(duì)本發(fā)明方法與不加UT序列的普通mPCR的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行說(shuō)明。I、樣本收集。從地方疾病預(yù)防與控制中心(⑶C)獲得Ab臨床分離株。2、Ab基因組信息獲取。從GenBank獲取Ab全基因組序列信息。確定3個(gè)特異性檢測(cè)區(qū)段，各區(qū)段所錨定基因分別涉及recA基因、16S-23S ITS區(qū)域以及0XA-51樣基因，通過(guò)mPCR檢測(cè)，提高Ab鑒定的特異性。3、針對(duì)三個(gè)檢測(cè)區(qū)段選擇特異性PCR引物，并設(shè)計(jì)用于mPCR的UT序列。選擇針對(duì)上述基因區(qū)段特異性較高的引物用于Ab檢測(cè)。用于Ab各檢測(cè)靶點(diǎn)的引物上下游分別連接兩條序列不同的UT。本檢測(cè)中Ab檢測(cè)涉及3對(duì)引物，3對(duì)引物將公用I對(duì)UT，從而組成一個(gè)統(tǒng)一的mPCR體系。針對(duì)Ab檢測(cè)所設(shè)計(jì)的UT對(duì)分別為 UTAb I-F : 5 ’ -CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG-3 ’ 和 UTAb2_R:5’-CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC-3’。在設(shè)計(jì)UT引物時(shí)，可事先設(shè)計(jì)一些隨機(jī)的核苷酸四聚體，比如上述 UTAbl-F 引物 5’ -CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG-3’，則是由 CAGC、GGTA, GACC,ACCT、ATCG、TGCG等四聚體排列而成，如果改變這些四聚體的排列順序，則可形成其他UT引物。由于mPCR擴(kuò)增體系中每對(duì)檢測(cè)引物的5’端都包含Tm值幾乎相同的UT引物對(duì)，因此，可在相同的擴(kuò)增條件下將3對(duì)引物組成的mPCR體系統(tǒng)一起來(lái)，高效完成Ab不同區(qū)段的擴(kuò)增。具體引物序列信息如附表IA所示。同時(shí)設(shè)有未加UT引物復(fù)合體，僅為特異性檢測(cè)引物的普通mPCR對(duì)照組。具體引物序列信息如附表IB所示。4、mPCR檢測(cè)體系實(shí)施。(DmPCR 模板制備。檢測(cè)中采用40份Ab臨床分離株培養(yǎng)物直接作為mPCR體系的待檢模板。為了評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的靈敏度，對(duì)Ab的過(guò)夜培養(yǎng)物(0D600 = O. 8-1. 0，約為IO8個(gè)細(xì)菌/ml)進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋。每個(gè)稀釋梯度取2 μ I作為模板；(2)mPCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系包括IXPCR緩沖液(IOmM Tris-HCl (pH 8. 3), 50mM KCl，I. 5mMMgCl2)，dNTP各250nM, UT引物O. 3 μ M，UT+特異性檢測(cè)引物復(fù)合體O. I μ M，TaqDNA聚合酶2. 5U/100 μ I PCR體系，經(jīng)梯度稀釋的Ab菌液模板2 μ I。反應(yīng)條件mPCR檢測(cè)過(guò)程分為兩個(gè)階段，第一階段是反應(yīng)中采用“95°C變性30s，50-55°C梯度退火各30s，72°C延長(zhǎng)45s”的程序擴(kuò)增5個(gè)循環(huán)，目的是讓UT+特異檢測(cè)引物復(fù)合體中的后半段——特異性檢測(cè)引物先錨定各自的靶序列；接著，采用“95°C變性30s，60°C梯度退火30s，72°C延長(zhǎng)45s”的程序擴(kuò)增25-30個(gè)循環(huán)，此時(shí)由于退火溫度升高，參與檢測(cè)的引物主要是Tm在60以上的單純UT引物。由于UT序列在設(shè)計(jì)時(shí)盡量做到了 Tm值統(tǒng)一，從而可在均一的退火溫度下實(shí)現(xiàn)3個(gè)檢測(cè)靶點(diǎn)的高效多重?cái)U(kuò)增。mPCR體系的質(zhì)量控制，如陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照單獨(dú)設(shè)置。對(duì)照組由于未使用帶有UT的引物復(fù)合體，因此針對(duì)每個(gè)不同靶物的PCR需根據(jù)不同引物Tm，設(shè)置梯度退火溫度。整個(gè)反應(yīng)程序則為“95°C變性30s，50-55°C梯度退火各30s，72°C延長(zhǎng)45s”，35個(gè)循環(huán)。(3)mPCR檢測(cè)結(jié)果的分析。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分析mPCR產(chǎn)物，借助凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。以232bp、377bp和449bp 3條帶的同時(shí)出現(xiàn)作為Ab檢出的主要標(biāo)志。未使用UT引物復(fù)合體的對(duì)照組，以184bp、329bp和401bp 3條帶的同時(shí)出現(xiàn)作為Ab檢出的主要標(biāo)志。(4)檢測(cè)結(jié)果的比較。采用本發(fā)明方法對(duì)40份Ab臨床分離株培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用未加UT的引物作為普通mPCR對(duì)照。本發(fā)明方法將40份Ab樣本的3個(gè)靶點(diǎn)全部同時(shí)檢出，檢出率為100%，菌液稀釋度為10的一次方；普通mPCR對(duì)40份Ab樣本的檢出率為87. 5% (35/40)，菌液稀釋度亦為10的一次方。
實(shí)施例二 mPCR檢測(cè)在多個(gè)檢測(cè)對(duì)象中的應(yīng)用該實(shí)例主要說(shuō)明mPCR體系如何使用多種特異性檢測(cè)引物來(lái)的鑒定未知樣本。即從臨床腦脊液標(biāo)本中檢測(cè)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, Sp)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis, Nm)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)這三種細(xì)菌性腦膜炎主要病原菌。本實(shí)施例與實(shí)施例一的主要區(qū)別是對(duì)復(fù)雜樣本(含有多個(gè)待檢核酸序列，或者說(shuō)包含多個(gè)物種)，針對(duì)每個(gè)待檢物種的核酸序列都設(shè)置3個(gè)檢測(cè)靶片段，涉及3對(duì)UT+特異檢測(cè)引物復(fù)合體，其UT序列相同；針對(duì)不同待檢物種，有不同的UT引物對(duì)以示區(qū)別，但各UT間的Tm值相近，mPCR反應(yīng)條件統(tǒng)一。這樣以來(lái)，檢測(cè)體系在縱向是每種待檢物種核酸序列的3個(gè)檢測(cè)靶片段，橫向是不同待檢物種核酸序列的平行檢測(cè)，從而形成mPCR陣列式檢測(cè)模式。此外，采用未加UT引物復(fù)合體，僅為特異性檢測(cè)引物作為普通mPCR對(duì)照組。同時(shí)，傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法作為參考，用于衡量本發(fā)明方法與普通mPCR法的特異性和靈敏度。I、樣本收集。依據(jù)相關(guān)條例規(guī)定，從地方醫(yī)院檢驗(yàn)科獲得合格臨床腦脊液標(biāo)本50份。2、基因組信息獲取。確定3個(gè)待檢細(xì)菌中各自的3個(gè)特異性檢測(cè)區(qū)段。Sp檢測(cè)的錨定基因分別涉及l(fā)ytA、ply以及psaA三基因。Nm檢測(cè)涉及ctrA、crgA和porA三基因；Lm的鑒定由iap、actA和hly三基因鎖定。每種細(xì)菌各待檢基因的特異性引物5’端將分別與相應(yīng)UT引物對(duì)組合，形成引物復(fù)合體。3、針對(duì)三個(gè)檢測(cè)區(qū)段選擇特異性的PCR引物，并設(shè)計(jì)用于mPCR的UT序列。選擇針對(duì)上述基因區(qū)段特異性較高的引物用于本研究。本檢測(cè)中Sp、Nm和Lm三種細(xì)菌的檢測(cè)中，每種細(xì)菌均涉及3對(duì)引物，且其3對(duì)引物公用I對(duì)UT，從而組成一個(gè)統(tǒng)一的mPCR體系。本檢測(cè)中針對(duì)Sp檢測(cè)所設(shè)計(jì)的UT對(duì)分別為=UTSpl-F 5’ -CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG-3’ 和 UTSp2_R :5’ -CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC-3’ ；針對(duì)Nm 檢測(cè)所設(shè)計(jì)的 UT 對(duì)分別為UTNml-F :5’ -GGTAACCTTGCGCAGCATCGGACC-3’ 和 UTNm2_R 5’ -AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGAC-3’ ；針對(duì) Lm 檢測(cè)所設(shè)計(jì)的 UT 對(duì)分別為UTLml_F 5，-TGCGCAGCATCGACCTGGTAGACC-3，和 UTLm2_R 5，-GGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGAC-3 ’。UT 引物的序列初步設(shè)計(jì)好之后，需通過(guò)NCBI網(wǎng)站在線BLAST分析，確定該序列與待測(cè)核酸無(wú)同源性，方可使用。此外，按照此種方法設(shè)計(jì)出的UT引物，其Tm值大多在60以上。由于mPCR擴(kuò)增體系中每對(duì)檢測(cè)引物都包含Tm值相似的UT引物對(duì)，因此，可在相同的擴(kuò)增條件下將每種細(xì)菌涉及的3對(duì)引物組成的mPCR體系統(tǒng)一起來(lái)，共檢測(cè)3種細(xì)菌，則形成3X3的mPCR陣列，高效完成Sp、Nm和Lm3種細(xì)菌不同區(qū)段的擴(kuò)增。具體引物信息如附表2A所示。同時(shí)設(shè)有未加UT引物復(fù)合體，僅為特異性檢測(cè)引物的普通mPCR對(duì)照組。具體引物序列信息如附表2B所示。4、mPCR檢測(cè)體系實(shí)施。(l)mPCR 模板制備。向200 μ I 臨床標(biāo)本中加入 100 μ I 含 O. 04g/ml 溶菌酶的 TE (Tris-EDTA, ρΗ8· O)緩沖液，混合均勻，置于37°C水浴中孵育lh。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(寶生物(大連)生物工程有限公司)提取DNA，然后用100 μ I TE (Tris-EDTA, ρΗ8. O) 緩沖液洗脫DNA，置于-20°C保存。DNA濃度可通過(guò)Smart Spec plus核酸蛋白測(cè)定儀(BI0-RAD，美國(guó))測(cè)定。(2)mPCR 檢測(cè)。每種細(xì)菌的mPCR 體系為 100 μ 1，包括1 XPCR 緩沖液(IOmM Tris-HCl (ρΗ8. 3)，50mM KCl，I. 5mM MgCl2)，相應(yīng)UT引物各O. 3 μ M, UT+特異性檢測(cè)引物復(fù)合體O. I μ M, TaqDNA聚合酶2. 5U，臨床樣本DNA2. 5μ I。反應(yīng)條件mPCR檢測(cè)過(guò)程分為兩個(gè)階段，第一階段是反應(yīng)中采用“95°C變性30s，50-55°C梯度退火各30s，72°C延長(zhǎng)45s”的程序擴(kuò)增5個(gè)循環(huán)，目的是讓UT+特意檢測(cè)引物復(fù)合體先錨定各自的待測(cè)靶序列；接著，采用“95°C變性30s，60°C梯度退火30s，72°C延長(zhǎng)45s”的程序擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，此時(shí)由于退火為溫度升高，參與檢測(cè)的引物主要是Tm在60以上的UT引物。從而在統(tǒng)一反應(yīng)的條件下實(shí)現(xiàn)3個(gè)檢測(cè)靶點(diǎn)的高效多重?cái)U(kuò)增。mPCR體系的質(zhì)量控制，如陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照單獨(dú)設(shè)置。對(duì)照組由于未使用帶有UT的引物復(fù)合體，因此針對(duì)每個(gè)不同靶物的PCR需根據(jù)不同引物Tm，設(shè)置梯度退火溫度。整個(gè)反應(yīng)程序則為“95°C變性30s，50-55°C梯度退火各30s，72°C延長(zhǎng)45s”，35個(gè)循環(huán)。(3)mPCR檢測(cè)結(jié)果的分析。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分析mPCR產(chǎn)物，借助凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。以3條不同大小的條帶的同時(shí)出現(xiàn)作為每種細(xì)菌檢出的主要標(biāo)志(各檢測(cè)靶物的PCR產(chǎn)物大小見(jiàn)附表2A和2B)。(4)檢測(cè)結(jié)果的比較。本發(fā)明方法與細(xì)菌培養(yǎng)法的效能比較以及普通mPCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法的效能比較見(jiàn)附表3-5。檢測(cè)結(jié)果顯示，以細(xì)菌培養(yǎng)法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，本發(fā)明mPCR方法與普通mPCR法對(duì)50份臨床樣本檢測(cè)的靈敏度和特異性比較如下(I)針對(duì)Sp的lytA、ply和psaA三基因同時(shí)檢測(cè)(三基因PCR均為陽(yáng)性，下同)，本發(fā)明mPCR法的靈敏度為100% (36/36，p<0. 05)，特異性分別為85.7% (12/14, P < O. 05);普通mPCR法的靈敏度為86. I % (31/36，p<0.05)，特異性為 71. 4% (10/14, P < O. 05) ； (2)針對(duì) Nm 的 crtA、crgA 和 porA 三基因同時(shí)檢測(cè)，本發(fā)明mPCR法的靈敏度為96. 7% (29/30，ρ<0· 05)，特異性分別為90% (18/20，P < O. 05);普通 mPCR 法的靈敏度為 83. 3% (25/30，p < O. 05)，特異性為 80 % (16/20，p< O. 05) ； (3)針對(duì)Lm的iap、actA和hly三基因同時(shí)檢測(cè)，本發(fā)明mPCR法的靈敏度為100% (18/18，P < O. 05)，特異性分別為:90.6% (29/32，p < O. 05);普通 mPCR 法的靈敏度為 77. 8% (14/18，P < O. 05)，特異性為 81. 3% (26/32，p < O. 05)。
五、附圖表說(shuō)明本發(fā)明的核心部分即mPCR陣列技術(shù)體系如附圖I所示。圖中以單個(gè)待測(cè)核酸的三重mPCR為例。通過(guò)三段靶序列的同時(shí)擴(kuò)增來(lái)鑒定一種核酸。圖中DNA靶序列1、2、3分別代表檢測(cè)該核酸序列所錨定的3段特異性區(qū)域，引物對(duì)I、
2、3是針對(duì)這3個(gè)區(qū)段的特異性檢測(cè)引物，UTl是針對(duì)該目的核酸的通用標(biāo)簽，每種待測(cè)核酸分別分配一種UT，“-F”和“-R”分別代表上游引物和下游引物。(l)mPCR第一階段(可根據(jù)實(shí)際需求相應(yīng)增加循環(huán)數(shù))，同種待測(cè)片段的三對(duì)特異性檢測(cè)引物分別與UTl對(duì)組合成的復(fù)合引物對(duì)參加反應(yīng)。在該階段中，承擔(dān)引物功能的僅為復(fù)合引物中的特異性引物段，該階段的成功退火，將為整個(gè)mPCR體系的特異性擴(kuò)增奠定非常重要的基礎(chǔ)；(2)通過(guò)第一階段擴(kuò)增，新生成了 5’端攜帶UTl-F和UTl-R標(biāo)簽的產(chǎn)物各一條；(3)進(jìn)行第二階段擴(kuò)增，方法同第一階段；(4)通過(guò)第二階段擴(kuò)增，又新生成了兩條產(chǎn)物，即5’端攜帶UTl-R標(biāo)簽-3’端攜帶UTl-F互補(bǔ)序列標(biāo)簽和5’端攜帶UTl-F標(biāo)簽_3’端攜帶UTl-R互補(bǔ)序列標(biāo)簽的DNA 單鏈各一條，并且鏈間呈互補(bǔ)關(guān)系。這條雙鏈將繼續(xù)作為模版，為后續(xù)的高效擴(kuò)增起到關(guān)鍵作用；(5)從第三階段開(kāi)始，擴(kuò)增體系中的引物將主要由單一的UT1-F/R對(duì)來(lái)承擔(dān)，它們將三段不同的靶序列擴(kuò)增相統(tǒng)一，成為單-引物的簡(jiǎn)單PCR反應(yīng)。顯而易見(jiàn)，UT的應(yīng)用使得mPCR體系簡(jiǎn)單、高效；(6)在UT1-F/R對(duì)的作用下，三段靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物大量生成，與常規(guī)mPCR所不同的是，在每段靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物兩端都攜帶了 UT或UT互補(bǔ)序列；(7) UT的長(zhǎng)度是已知的，因此，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳即可判斷檢測(cè)結(jié)果。附表I:附表IA鮑曼不動(dòng)桿菌mPCR檢測(cè)體系UT+特異檢測(cè)引物復(fù)合體序列
權(quán)利要求
1.一種引物對(duì)，含有通用標(biāo)簽序列(UT序列)，以及檢測(cè)引物對(duì)，且UT序列加在每條檢測(cè)引物的5’端；其中，所述UT序列由20-24個(gè)堿基組成，并滿足以下條件①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超過(guò)±1°C，且大于檢測(cè)引物Tm值5-10°C左右；@UT序列為隨機(jī)設(shè)計(jì)的DNA片段，與待檢測(cè)生物的核酸序列間無(wú)同源性。
2.權(quán)利要求I的引物對(duì)，其特征在于所述UT序列由多組四個(gè)堿基組成的隨機(jī)四聚體，該四聚體應(yīng)滿足(1)四聚體間至少要有兩個(gè)堿基是互不相同的；(2)四聚體之間不能彼此互補(bǔ)；(3)四聚體不應(yīng)自身配對(duì)；(4)四聚體不能由兩個(gè)重復(fù)堿基對(duì)組成。
3.權(quán)利要求I或2的引物對(duì)，其中UT序列由6組隨機(jī)四聚體組成。
4.權(quán)利要求I或2的引物對(duì)，其中UT序列由以下6組隨機(jī)四聚體組成CAGC、GGTA、GACC、ACCT、ATCG、TGCG。
5.權(quán)利要求I或2的引物對(duì)，其中UT序列具體是F : CAGCGGT AGACCACCTATCGTGCG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC ;和 / 或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGAC ;和 / 或FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACC ；R GGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGAC
6.權(quán)利要求I的引物對(duì)，其是F CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCCTGAATCTTCTGGTAAAAC ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC ； 和/或F CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCATTATCACGGTAATTAGTG ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACAGAGCACTGTGCACTTAAG ;和 / 或F CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGTAATGCTTTGATCGGCTT ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG ;和 / 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCAACCGTACAGAATGAAGCGG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTTATTCGTGCAATACTCGTGCG ;和 / 或F CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGATTTCTGTAACAGCTACCAACGA ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGAATTCCCTGTCTTTTCA AAGTC ； 和/或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGGCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCG ； 和/或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGCGGTAGGTGGTTCAA ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACTTGTCGCGGATTTGCAACTA 和 / 或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACCTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT ； 和/或F GGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCCGGCTCGTTTATCGGCTT ；RAGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACGGTATTTCGTTTCAGCCAAGC ;和 / 或FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGAGTACCAAACTGCTAACACAGGTACTC ；R GGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACAGCTGGTTTGCAGCTTC ;和 / 或F TGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGCTGATTTAAGAGATAGAGGAACA ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACTTTATGTGGTTATTTGCTGTC ;和 / 或FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCTCCGCCTGCAAGTCCTAAG ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG。
7.試劑盒，其中含有權(quán)利要求1-6的引物對(duì)。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的引物對(duì)或權(quán)利要求7的試劑盒在非診斷目的的生物檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中所述的檢測(cè)是檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)，尤其是它的 recA、16S_23S ITS、0XA_51 樣基因。
10.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中所述的檢測(cè)是檢測(cè)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes),尤其是肺炎鏈球菌的lytA、ply和psaA基因；腦膜炎奈瑟菌的ctrA、crgA和porA基因；單核細(xì)胞增生李斯特菌的iap、actA和hly基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用多重PCR陣列技術(shù)的核酸檢測(cè)方法。包括通用標(biāo)簽(UT)序列，通用標(biāo)簽序列與特異性檢測(cè)引物組成的引物對(duì)(5’-UT引物+特異檢測(cè)引物-3’)，含有該通用標(biāo)簽序列或引物對(duì)的試劑盒，及其它們?cè)诤怂嵘餀z測(cè)中的應(yīng)用。所述UT序列滿足以下條件①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超過(guò)±1℃，且大于檢測(cè)引物Tm值5-10℃左右；②UT序列為隨機(jī)設(shè)計(jì)的DNA片段，與待檢測(cè)生物的序列間無(wú)同源性。本發(fā)明的檢測(cè)方法，通過(guò)mPCR結(jié)合通用標(biāo)簽序列的方法，以提高核酸檢測(cè)的靈敏度和特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/14GK102936593SQ20121028950
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者杜蓬, 張磊, 邵世和, 孫愛(ài)華, 王黎芳, 周海鷗, 銀國(guó)利, 何方, 蔣錦琴, 花扣珍, 覃江鳳 申請(qǐng)人:浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校