一種復(fù)方丹參浸膏中單糖、二糖的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種復(fù)方丹參浸膏中單糖、二糖成分的分離純化方法，本發(fā)明采用固相萃取法，對(duì)復(fù)方丹參浸膏中的糖類成分進(jìn)行分離純化，先得到復(fù)方丹參浸膏總糖提取物，然后采用凝膠色譜法，對(duì)復(fù)方丹參浸膏總糖提取物中的低聚糖成分實(shí)現(xiàn)了很好的分離，得到了三個(gè)單糖、二糖成分，分別是果糖、D-葡萄糖和蔗糖。
【專利說(shuō)明】一種復(fù)方丹參浸膏中單糖、二糖的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)方丹參浸膏中單糖、二糖的分離純化方法?！颈尘凹夹g(shù)】:
[0002]復(fù)方丹參滴丸是由丹參、三七和冰片制成的滴丸劑，在臨床上廣泛用于冠心病、心絞痛的預(yù)防、治療、急救，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)心血管市場(chǎng)上的主導(dǎo)品牌之一。復(fù)方丹參浸膏為復(fù)方丹參滴丸的制劑中間體，是由丹參和三七藥材，經(jīng)水提、醇沉、濃縮后得到的浸膏(復(fù)方丹參浸膏的制備方法屬于現(xiàn)有技術(shù))。
[0003]復(fù)方丹參滴丸上市十余年中逐步建立了完善的工藝質(zhì)量控制體系，目前正在以藥品的形式進(jìn)行FDA申報(bào)研究。但是相對(duì)于西藥，復(fù)方丹參浸膏目前的已知組分仍然較低，提升產(chǎn)品工藝質(zhì)量控制水平，需要針對(duì)其中更多的中藥化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，從而更加準(zhǔn)確地把握產(chǎn)品質(zhì)量，降低用藥風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)為國(guó)際注冊(cè)提供支持。
[0004]糖類在中草藥中分布十分廣泛，也是中藥材及中藥產(chǎn)品中的主要組成成分，所占含量比例很高。測(cè)定結(jié)果表明，復(fù)方丹參浸膏中的糖類成分含量達(dá)到約50%，因此糖類成分的研究對(duì)于復(fù)方丹參浸膏的全面質(zhì)量控制有著重要意義。
[0005]從復(fù)方丹參浸膏中分離出了多種糖類成分，獲得這些成分可以用于分析復(fù)方丹參滴丸中不同糖類成分的比例關(guān)系，了解它們的作用，同時(shí)可以用于控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明在于提供一種從復(fù)方丹參浸膏中分離單糖、二糖成分的方法，該方法快速，準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，分離效果好，得到的產(chǎn)品純度高，收率高，可用于糖類成分的定性和定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0006]本發(fā)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期反復(fù)的摸索，最終得到一種復(fù)方丹參浸膏中單糖、二糖成分的分離純化方法，并分離得到三個(gè)糖類成分，經(jīng)結(jié)構(gòu)確認(rèn)，確認(rèn)該三個(gè)化合物為果糖、D-葡萄糖和蔗糖。
[0007]該分離純化方法包括如下步驟:
[0008](I)復(fù)方丹參浸膏總糖提取物的制備；
[0009](2)復(fù)方丹參浸膏總糖提取物過(guò)聚丙烯酰胺凝膠層析柱；
[0010](3)單糖、二糖成分的收集。
[0011]其中步驟(1)所述復(fù)方丹參浸膏總糖提取物的制備方法為:
[0012]復(fù)方丹參浸膏加水超聲溶解，上至已處理好的固相萃取柱，流速為0.5-1.0mL/min，再用水分次洗滌，收集上樣液和洗滌流出液，蒸干，得復(fù)方丹參浸膏總糖提取物。
[0013]其中所述固相萃取柱采用Cleanert PS-SPE萃取柱，使用前經(jīng)過(guò)處理，處理方法為:將固相萃取柱用甲醇沖洗，之后再用水沖洗。
[0014]其中所述復(fù)方丹參浸膏為丹參和三七藥材經(jīng)水提、醇沉、濃縮后得到的浸膏，其制備方法具體為:分別取 41.06份丹參、8.03份三七藥材，粉碎，放入提取罐中，加入上述生藥5倍量的堿水(pH=7.0),提取2小時(shí)，過(guò)濾，收集初濾液，藥渣加入4倍量水，煎煮I小時(shí)，濾過(guò)，與第一次提取的濾液混合，減壓濃縮，直至溶液體積(L)與生藥質(zhì)量(Kg)的比為
0.9-1.1，加入95%的乙醇直至含醇量至69-71%，靜置12小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮回收乙醇成浸膏，相對(duì)密度為1.32-1.40。該方法屬于現(xiàn)有技術(shù)。
[0015]其中步驟(2)所述過(guò)聚丙烯酰胺凝膠層析柱是將得到的復(fù)方丹參浸膏總糖提取物用超純水溶解，溶解后上樣至已處理好的層析柱，層析柱的柱溫為25-35°C，用超純水進(jìn)行洗脫，每IOmin收集I管洗脫液，收集相當(dāng)于0.80-0.95柱體積的流份。
[0016]其中，聚丙烯酰胺凝膠層析柱為現(xiàn)有技術(shù)，可以用以下方法得到:
[0017]稱取一定量的聚丙烯酰胺凝膠，倒入超純水中，在室溫下潤(rùn)漲12小時(shí)以上，真空脫氣，用自動(dòng)沉降法裝柱到需要的高度(10(Tl20cm)，再用2~3倍床體積的超純水以恒定的流速平衡層析柱。
[0018]優(yōu)選的，步驟(2)中層析柱的柱溫為30°C。
[0019]步驟(2)中所述上樣量為0.075-0.125g復(fù)方丹參浸膏總糖提取物/100克聚丙烯
酰胺凝膠。
[0020]步驟(2)中所述層析柱的洗脫流速為0.0184-0.0367柱體積/小時(shí)。
[0021]其中步驟(3)所述的單糖、二糖成分的收集方法為:用HPLC方法對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，分別收集保留時(shí)間為10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色譜峰的洗脫液合并，蒸干，得到三種洗脫物，分別為化合物1，2，3。
[0022]所述HPLC對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)的方法為:
[0023]采用HPLC-ELSD 法，HPLC 采用 Prevail TM Carbohydrate ES 色譜柱，色譜條件為以乙腈為流動(dòng)相A,水為流動(dòng)相B,梯度洗脫設(shè)置為:
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)方丹參浸膏中單糖、二糖成分的分離純化方法，包括如下步驟: (O復(fù)方丹參浸膏總糖提取物的制備； (2)復(fù)方丹參浸膏總糖提取物過(guò)聚丙烯酰胺凝膠層析柱； (3)單糖、二糖成分的收集。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(1)所述復(fù)方丹參浸膏總糖提取物的制備方法為: 復(fù)方丹參浸膏加水超聲溶解，上至已處理好的固相萃取柱，流速為0.5-1.0mL/min，再用水分次洗滌，收集上樣液和洗滌流出液，蒸干，得復(fù)方丹參浸膏總糖提取物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述固相萃取柱采用CleanertPS-SPE萃取柱，使用前經(jīng)過(guò)處理，處理方法為:將固相萃取柱用甲醇沖洗，之后再用水沖洗。
4.如權(quán)利要求1所述的方法， 其中步驟(2)所述過(guò)聚丙烯酰胺凝膠層析柱是將得到的復(fù)方丹參浸膏總糖提取物用超純水溶解，溶解后上樣至已處理好的層析柱，層析柱的柱溫為25-35°C，用超純水進(jìn)行洗脫，收集相當(dāng)于0.80-0.95柱體積的流份。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，聚丙烯酰胺凝膠層析柱用以下方法得到: 稱取聚丙烯酰胺凝膠，倒入超純水中，在室溫下潤(rùn)漲12小時(shí)以上，真空脫氣，裝柱，裝柱高度為100-120cm，再用2~3倍床體積的超純水以恒定的流速平衡層析柱。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中層析柱的柱溫為30°C。
7.如權(quán)利要求4所述的方法,其中上樣量為0.075-0.125g復(fù)方丹參浸膏總糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝膠。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述層析柱的洗脫流速為0.0184-0.0367柱體積/小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(3)所述的單糖、二糖成分的收集方法為:用HPLC方法對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，分別收集保留時(shí)間為10.1±0.2min、13.0±0.2min和18.0±0.2min的色譜峰的洗脫液，合并，蒸干，得到三種洗脫物:果糖、葡萄糖、蔗糖。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述HPLC對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)的方法為: 采用HPLC-ELSD法，HPLC采用Prevail TM Carbohydrate ES色譜柱，色譜條件為以乙腈為流動(dòng)相A,水為流動(dòng)相B,梯度洗脫設(shè)置為:
【文檔編號(hào)】C13K11/00GK103589811SQ201210290204
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月15日
【發(fā)明者】徐波, 牛濤, 陳紅, 劉巖 申請(qǐng)人:天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司