專利名稱:用于檢測(cè)gstp1基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種用于檢測(cè)谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pl (glutathione-S-transferase PI, GSTP1)基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)(I105V)的試劑盒,能對(duì)GSTPl基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),特異性好,準(zhǔn)確度高,可提高突變檢出率。
背景技術(shù):
谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一組多功能的藥物代謝酶,其中GSTPl廣泛存在于人體腫瘤組織中,在人體上皮來(lái)源的惡性腫瘤中表達(dá)率較高,如消化道來(lái)源的胃腸癌、食管癌,呼吸道來(lái)源的肺癌。在癌前病變和腫瘤患者中常發(fā)現(xiàn)GSTPlVall05基因型過(guò)度表達(dá)。在GSTPl基因多態(tài)性與人群健康的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),GSTPl基因的Ilel05Val位點(diǎn)的SNP導(dǎo)致在GSTPl蛋白密碼子105位氨基酸轉(zhuǎn)變,影響到GSTPl的催化功能,酶活性降 低,使其抗氧化功能下降,有利患者在化療中的生存。即GSTPlIlel05Val位點(diǎn)的多態(tài)性有利化療,預(yù)后較好。目前,GSTPl基因突變現(xiàn)有的檢測(cè)方法包括酶切法、普通測(cè)序法以及焦磷酸測(cè)序法等。在實(shí)際應(yīng)用中,用于檢測(cè)結(jié)直腸癌PIK3CA基因突變的方法主要為直接測(cè)序法,盡管該法為金標(biāo)準(zhǔn),但是如果突變率低于15%,會(huì)發(fā)生漏檢的現(xiàn)象,且試驗(yàn)過(guò)程過(guò)于繁瑣,需要的試劑種類繁多,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,因而一定程度上限制了該法的應(yīng)用。焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)技術(shù)是一種新的序列分析技術(shù),是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在實(shí)際工作中,很多情況需要對(duì)已知序列的DNA片段進(jìn)行序列驗(yàn)證,而這種分析往往測(cè)幾十bp就可以滿足需要。在這種情況下,Sanger法未必是最合適的DNA序列分析技術(shù)。而焦磷酸測(cè)序技術(shù)是目前最適合這些應(yīng)用的DNA序列分析技術(shù)。其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、大通量、自動(dòng)化,適合大量樣本的快速檢測(cè),根據(jù)峰值對(duì)序列的突變位點(diǎn)進(jìn)行判讀,從而實(shí)現(xiàn)GSTPl基因突變位點(diǎn)的定點(diǎn)檢測(cè)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,提供用一種快速,準(zhǔn)確,高通量的GSTPl基因熱點(diǎn)突變(Ilel05Val)檢測(cè)試劑盒。用于檢測(cè)GSTPl基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒,包括紅細(xì)胞裂解液、全血DNA抽提試齊U、無(wú)水乙醇、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品以及焦磷酸測(cè)序反應(yīng)液,其特征在于所述試劑盒包括檢測(cè)GSTPl第5外顯子目的基因上下游引物F、R-Biotin、測(cè)序引物FCX,其序列分別為FTGGTGGACATGGTGAATGA,R-Biotin GGTCAGCCCAAGCCAC,FCX :CCTCCGCTGCAAATA。進(jìn)一步地,所述試劑盒的使用方法包括如下步驟(I)采集待測(cè)血液樣本,提取DNA ;
(2)以該DNA為模板,用權(quán)利要求I所述用于擴(kuò)增樣本DNA中GSTPl基因第5外顯子的對(duì)應(yīng)PCR引物F、R進(jìn)行擴(kuò)增,得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物;(3)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用測(cè)序引物FCX進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,確定是否存在突變。優(yōu)選地,步驟(2)的PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增94°C 5min ;98°C 30s,58°C 30s、68°C 30s, 35 個(gè)循環(huán);最后 68°C 5min。本發(fā)明根據(jù)GSTPl基因熱點(diǎn)突變位,設(shè)計(jì)了外顯子5PCR擴(kuò)增引物以及焦磷酸測(cè)序引物。表I.外顯子5引物序列
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)GSTPl基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒,包括紅細(xì)胞裂解液、全血DNA抽提試齊U、無(wú)水乙醇、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品以及焦磷酸測(cè)序反應(yīng)液,其特征在于所述試劑盒包括檢測(cè)5外顯子目的基因上下游引物F、R-Biotin、測(cè)序引物FCX,其序列為FTGGTGGACATGGTGAATGA,RBiot i n-GGTCAGCCCAAGCCAC,FCX :CCTCCGCTGCAAATA。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒的使用方法包括如下步驟 (1)采集待測(cè)血液樣本,提取DNA; (2)以該DNA為模板,用權(quán)利要求I所述用于擴(kuò)增樣本DNA中GSTPl基因的對(duì)應(yīng)PCR引物F、R進(jìn)行擴(kuò)增,得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物; (3)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用測(cè)序引物FCX進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,確定是否存在突變。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于,步驟(2)的PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增94°C 5min ;98°C 30s、58°C 30s,68°C 30s,35 個(gè)循環(huán);最后 68°C 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione-S-transferaseP1,GSTP1)基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的試劑盒,包括紅細(xì)胞裂解液、全血DNA抽提試劑、無(wú)水乙醇、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品以及焦磷酸測(cè)序反應(yīng)液,其特征在于所述試劑盒包括檢測(cè)5外顯子目的基因上下游引物F、R-Biotin、測(cè)序引物FCX。可檢測(cè)出與GSTP1基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)(I105V)多態(tài)性,特異性好,準(zhǔn)確度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816846SQ20121029075
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者薛群, 王淑一, 徐建成, 孫翠蓮 申請(qǐng)人:吉林艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司